全 文 ：尸烈
土模皮等三种中药抗真菌作用的超微结构观察
中心 实验 室
卢玉娟
李相 ,忠
武庆 才干
吴振铎
李鹤玉
李富华
中药土榄皮治疗浅部真菌病 , 尤其体
癣 、 手和足癣 , 经临床广泛应用和抑菌试
验已证明其疗效显著 , 但所引起的真菌细
胞学的变化 , 国内报告还很少 。 本文饵就
土谨皮 、 黄连和龙胆草等三种中药对浅部
真菌超微结构的影响做了观察 , 以探讨抑
菌作用机 理 。 现报告如下 。
一 、 材料和方法
( 一 ) 菌种 : 使用我院真菌室保存的
石膏样癣菌 ( T r i e h o p y h t o n g y p s e “ m ) ,
取 o . Z e m 的菌落 , 移种于 S a b o u r a u d 氏葡
萄糖琼脂培养基上 , 3 周后取 其 菌 落 备
用 。
( 二 ) 中药与制备方法 : 本院中药局
供应的土横皮 ( H i b i s e u s C o r t i C i s S y -
t r 主岛。 i ) 、 黄 连 ( C o p t i s C h i n e n s i “
F r 肠n c h ) 和龙胆草 ( G e n t i a n a S e a b r a
B u n g e )
, 各取干品 5 0 9 , 研成 碎 块 , 分
别加水 2 50 m l , 浸泡30 分钟 , 放入玻璃 烧
杯内煮沸 1 小时 。 倾倒滤液放置于另一瓶
内 , 将剩余药渣再加水25 Om l , 以同样方
法煮沸过滤 。 然后将前后两次滤液棍合 、
加热 , 浓缩至 50 m l , 即成 10 。%浓度 药
液 。
( 三 ) 培养基 : 将土模皮等三种药液
分别加入 S a b o u r a u d 氏葡萄糖琼脂培养
液中 , 以 4 : 6的浓度 (即40 %药液培养液 )
充分混合 。 再将其 6 m l 置于试管内 , 按
常规消毒制成斜面 。
( 四 ) 接种 : 将切成直径小于 o . cZ m
的菌落 , 接种于不同成分药液培养基与对
照组培养基 ( 不含中药液 ) 中 。 每种药液
培养基分别接种 3 管 , 然后置于 25 ℃温箱
内 , 培养 2 小时 , 3 天和 7 天 , 观察菌落
生长形态 。
( 五 ) 电镜标本制 备 : 将培 养 2 小
时 、 3 天和 7 夭的菌落取出 , 并置于 3 %
戊二醛磷酸缓冲液 ( p H 7 . 4 ) 中 , 固定24
小时 ( 4 ℃ ) 。 经 o . I M 磷酸缓冲液冲 洗
后 , 按常规以 1 %饿酸固定 2 小时 。 再用
丙酮逐级脱水 , 环氧树脂浸透包埋 , 制备
超薄切片 , 以醋酸双氧铀和拘椽酸铅溶液
双重染色 。 应用 JE M一 7 型电镜观察 。
二 、 结 果
三种中药试管内抑菌结果
培养时间
培养液
7 天
于卜卜
」1卜
+
一卜沪ù卜卜3·钊月4肠卜厂.仆-lI,口
4 0帕土模皮
4 0外黄连
4 0肠龙胆草
对照组
汁 : 书仆完 全抑制 : 菌落直 径小 于 0 .跳 m
一 中等度抑制 : 菌落直径小 于 1 . oc m
+ 轻度抑制 : 菌落直径大于 1 . oc m
一无 抑制 : 菌落直径大于 1 .头 m
( 一 ) 三种中药抗真菌试验结果 , 肉
成所见 , 如表
( 二 ) 电谊观察所见
1
. 未经药物处理的细胞 : 表现为粗糙
的卵圆形细胞 , 其周围被 4 0 A 厚度电子
致密性细胞壁 ( C W ) 所包绕 。 里层为细
胞膜 ( C M ) , 即单位膜所构成 。 细胞 膜
和细胞核之间部分为细胞质 , 呈 细 颗 粒
状 。 细胞核 ( N ) 电子密度较低。 核旁线
粒体 ( M ) 为椭圆形 , 由二层 单 位 膜 围
成 , 线粒体数量较少 。 溶酶体 ( L Y )散在
细胞质内 , 外包一层单位膜 , 其内电子密
度不等 , 富有酸性水解酶 ( 图 1 ) 。
2
.
4 0%土模皮处理的细胞 : ① 2 小时
细胞形态变化 : 细胞壁和细胞膜完整 , 细
胞质浓缩 、 电子密度增高 。 核完整 , 电子
密度接近于正常 。 核旁可见小斑片状电子
薄区 ( E le e t r o n一 t h i n a r e a , E T A ) ,
散在或核周呈半环状分布 ( 图2 ) 。线粒体罕
见 。 ② 3 天细胞形态变化 : 细胞壁和细胞
膜仍然存在 , 胞浆中电子 薄 区 显 著 ( 图
3 )
。 可见细胞核 。 未见线粒体 , ③ 7 天
细胞形态变化 : 细胞壁和 细 胞 膜 完整 ,
但细胞膜明显皱缩 , 仅折入胞浆内 , 呈憩
室样 。 胞浆完全被电子薄区所占据 。 细胞
器消失 。
不用 40 %黄连和龙 胆 草处 理 的 细
胞 , 于不同的作用时间内真菌细胞亦发生
改变 , 其变化与土模皮相似 。 细胞结构破
坏 , 细胞器消失 ,胞浆内出现 电子薄区 。 细
胞壁和细胞膜完整 , 细胞膜皱缩 , 但未见
反折现象。
三 、 讨
本组实验采用40 %的土模皮 、 黄连和
龙胆草等药液 , 分别对石青样癣菌给予处
理 , 经不同时间观察 , 结果证实三种中药
与对照组比较 , 均有较强的抑菌作用 , 尤
其土模皮效力最强 。 据吴氏实 验 分析 证
明 . { , “ J , 土模皮主要含有土模皮酸 ( 土模
皮 甲酸与土攫皮 乙酸 ) 和揉质等成分 。 : L
模皮酸为一种有机酸 ( 毅酸 ) , 其分子式
为 C : : H : 。O 。 , 含有一个酸基一 C O O H 、
一个 甲氧基一 O C H 3与酷键 , 易溶解于 乙
醚 、 苯 、 丙酮 、 乙酸乙醋 、 甲醇 、 乙醇和
氯仿等有机溶剂中 , 但不易溶于石油 、 醚
和水中。 土模皮具有强力抑菌作用 , 其抗
真菌有效成分主要是梭酸 。 黄连主要为小
柏碱 ( 黄连素 , C : 。 H , 。 O 。 N ) , 此外 ,
还含有黄连碱 ( C : 。H : 。 O S N ) 、 甲基 黄
连 碱 ( C Z 。 H 】 : O S N ) 和 掌 叶 防 己 碱
( C
Z : H : 。 O 。 N )等 , 也具·有抑制真菌的作
用 。 抑菌实验证明小柏碱为抗真菌的有效
成分 : 5 。 龙胆草含龙 胆. 苦 贰 ( C , 。 H : 。
O 。 )
、 龙胆碱 ( C : 。 H 。 10 ZN ) 和龙 胆 糖
( C
: 。 H 3 : O : 。 ) 等 , 其中何种成分 具 有
抑菌作用 , 有待分析研究 。
在电镜下观察真菌超微结构变化 , 发
现以土模皮经 2 小时处理后 , 真菌细胞核
旁出现小斑片状电子薄区 , 散在或呈半环
形分布 ; 经 3一 7 天处理 , 细 胞 完 全 变
性 , 细胞器结构消失 , 并由电子薄区所占
据 。 细胞膜皱缩反折入胞浆内。 受黄连和
龙胆草作用的真菌细胞 , 其变化与受土模
皮作用者相似 , 也见有细胞器消失 , 胞浆
内出现电子薄区 , 不 同作用时间虽也导致
真菌细胞改变 , 但其变化发生 的 时 间 稍
迟 , 表示这两种中药的作用强度较弱 。 这
可能与各种药液中所含有效成 分 不 同 有
关 。 通过本组抑菌试验表明 , 尽管药物浓
度与剂量相同 , 由于其作用 时 间 长短 不
同 , 致使细胞损伤程度各异 。 倘若真菌充
分暴露后 , 应用药液浓度足够 时 , 即 有
I OQ%杀灭细胞的作用 。
气甲舞
本组实验观察 , 经土模皮等中药作用
的石膏样癣菌细胞学的变化与国外用二性
霉素B等抗真菌剂对白色念珠菌作用相 比
较 , 相同点为细胞浆内均有电子薄区 , 细
胞膜完整 , 并反折入胞浆内。 不 同点主要
有三 : ( 1 ) 由中药作用的真菌细胞结构
变性 , 细胞器消失 , 而经二性霉素 B 作用
的真菌细胞 , 尚保 留胞 核 和 线 粒 体 ,
( 2 ) 经中药作用跳真菌细胞 膜 明 显 皱
缩 , 并呈憩室样反折入胞浆 , 而由二性霉
素 B作用后未见细胞膜皱缩 ; ( 3 ) 经 二
性霉素 B作用的细胞浆内可见许多小 孔 ,
而经中药作用者未见到这种变化 。 因此 ,
我们认为土模皮等中药有显著的抗真菌作
用 , 是临床治疗浅部真菌病具有卓效的药
物 。
关于抗真菌剂作用于真菌 细 胞 的机
理 , 尚有不同见解 。 L a m eP n 等研 究 证
实 , 多烯类抗真菌剂主要作用敏感的真菌
细胞膜上 【 “ 一 。 该作者在做制霉菌素 对 糖
醉解的作用与酵母菌和真菌呼吸影响的研
究中指出 , 制霉菌素抑制真菌新陈代谢的
浓度 , 接近于抑制真菌生长的浓度 , 而真
菌本身气体交换受到抑制 。 这可能是真菌
细胞灭活的原因 。 此外 , G a le 发现二性霉
素B对酵母菌亦有相似作用 , 并提出与 细
胞膜渗透性发生改变有关 。 国外经二性霉
素 B和 F il i iP n 处理的真菌细胞 , 甚至在
胞浆改变之后 , 胞核和线粒体仍 完 整 无
损 , 故认为这些药物对细胞膜某些成分具
有特异性 , 而这种特异性并不存在于胞核
和线粒体膜上 。 但本组实验观察证实 , 经
中药尤其土模皮处理后的真菌细胞浆发生
明显变化 , 同时线粒体结构亦变性乃至消
失 。 这可能是药物表面活性剂 损 伤 细 胞
膜 , 改变其选择性渗透性 , 致使药物易于
弥散至细胞内 , 与细胞核或细胞膜的部分
磷脂成分结合 , 而导致细胞结构溶解 , 线
粒体等细胞器消失所致 。 由于线粒体含有
多种酶类 , 参与细胞内物质氧化与形成高
能磷酸化合物 ( 如 A T P ) , 后者是 提供
细胞活动的能量源泉 。 线粒体一旦发生改
变或消失 , 细胞氧化作用吸收链和整套酶
体系便受到抑制 , 使氧化磷酸化和细胞能
量偶联系统遭到破坏 , 细胞能量供给减少 ,
甚至得不到能量供给 , 从而影响基因调控
和 D N A 复制 , 而导致细胞衰退或死亡 。
P u c o i n e H i等应用冷冻断裂技术进一
步观察提出 魂 , 抗真菌药物引起真 菌 细
胞膜内颗粒分布异常 , 无颗粒区肿胀 ; 以
及细胞膜出现成层现象 ( L a m e l l ar f iq -
u r e ) 等改变 。 前两种改变可能由于 谱 蛋
白样 网状 结 构 ( S p e e t r i n一 l i k e m e s h -
w or k ) 变化所致 。 第三种改变可 能 是膜
脂质结晶化 ( C r y s t a l l i n e O r g a n i Z a t i -
。 n ) 的结果 。 此种现象由于直接受抗真菌
药物的影响 , 而出现高亲脂结构 , 改变膜
磷脂双层构型的结合所致 , 细胞膜上颗粒
分布和变动直接受位于膜下面的微丝所调
节 , 这种微丝主要由谱蛋白样网状结构组
成 。 谱蛋白样网状结构还可支持构成细胞
膜的双层脂质 , 并同蛋白质相结合 。 抗真
菌剂可能改变真菌细胞膜上的谱蛋 白样网
状结构 , 引起细胞膜性质改变 , 但其改变
是直接由药物引起还是由于细胞损伤的扩
散所致 , 尚需探讨 。
óō群||卜日|
参 考 文 献
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吴绍熙 : 中华皮肤科杂志 8 : 18 , 108 0
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北京 , 1 97 5年 9 月
图 1 未经药物处理的 细胞 : 细 胞 壁 ( C W ) , 细
胞膜 ( C M ) , 线粒体 ( M ) , 细胞 核 ( N ) , 溶
酶体 ( I JY ) 。 16 000倍
图2 40肠土模皮处理 2小时 细胞 : 细胞壁 和 细 胞
膜存在 , 核完整 , 接 近正常密度 . 核旁贝 小 斑 J }`
状电子薄区 ( E T A ) . 2 0000枯
图 3 用 4 0肠土攫皮处理 3 天细胞 : 细胞壁和 细 胞
膜完整 , 电子薄 区显著 , 核位于细胞一侧 ,未 见线粒
体 . 16 000倍
图4 用 40帕土榄皮处 理 7 天 细胞 : 细胞壁和细 胞
膜存在 , 细胞膜 明显皱缩 , 并反折入 胞 浆 内。 电
子薄 区占据梢个胞浆 . 2 7000倍
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三 、 注意事项 参考文献
1
.操作中应注意避免将染 液戮 在 器
材 、 衣物和手上 , 否则将留下难以洗掉的
黑迹 。
2
. 新制作的标本 , 晾干后 即可染色 。
如果制作的标本不太干净 , 在银染前 , 将
标本浸在 60 ℃中的 I N H C I 中处理 6 分
钟 , 可清除染色体上及其周围的复盖物 ,
如制作的标本比较干净 , 可省去 这 一 步
骤 。
( 本文承李璞教授审阅 , 刘贵德 、 孙
永宁同志协助摄影 , 谨致谢意 )
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