全 文 ：ACTH或 TOP等治疗婴儿痉挛症 ,主要在于有
效控制痉挛 ,其次对脑电图恢复正常有帮助 。本文
结果显示 , 42例治疗后控制痉挛达 30%, 40%异常
脑电图恢复正常 ,部分获得改善 ,治疗后脑电图改善
和痉挛发作缓解平行 。取得良好效果的病例 ,高峰
失律一般于用药后 2周消失 ,因此脑电图的动态观
察可作为治疗期估计判断药物疗程和剂量的依据。
婴儿痉挛症患儿多数预后不良 ,早期诊断有利
于改善预后 [ 1 ～ 3] 。通过本研究 ,我们认为如遇拟诊
的患儿应尽早进行脑电图检查 ,若发现特征性脑电
图表现 ,强烈提示本病可能 ,结合临床发作表现 ,即
使无条件作 MRI和头颅 CT检查 , 亦及早应用
ACTH或 TOP等治疗 ,可望改善预后 。脑电图的构
型对判断预后有一定价值 ,典型的发作控制程度优
于局灶性放电者 ,有文献报道脑电图的高峰失律预
后较好 ,其他异常脑电图预后差 [ 4] 。可见 , 脑电图
检查对婴儿痉挛症早期诊断 、病情甚至预后判断均
有重要价值。
[参考文献 ]
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(收稿日期:2007-10-15)
[基金项目 ] 辽宁省教育厅课题资助(2004D225)。
PI3 K/AKT信号转导系统在土槿皮乙酸
诱导胃癌细胞凋亡中的作用
宗志红 1 ,边　城 2 ,徐永红2 ,于爱鸣 1
(1中国医科大学 ,辽宁沈阳 110001;2青岛大学医学院附属医院)
　　[摘要 ] 　以不同浓度的土槿皮乙酸(PAB)分别处理 BGC823细胞 24 h, 采用 MTT法检测 PAB对细胞增殖抑
制作用 , PI染色检测细胞凋亡率及细胞周期 , Westernblot法检测 PAB对 Caspase-3剪切片断及 PI3K与 Akt通路相
关蛋白表达的影响。结果发现 , PAB对 BGC823细胞的增殖具有显著的抑制作用 ,呈剂量及时间依赖性。 Caspase-3
蛋白出现断裂片断 , 并随着浓度的增加断裂更明显 , 磷酸化 PI3K/AKT开始降低 , 72 h降低最明显 , 而非磷酸化的
PI3K/AKT无明显改变。认为 PAB具有明显的细胞毒作用 , 通过 PI3K/AKT途径激活 Caspase-3诱导胃癌细胞凋
亡 , 抑制细胞增殖。
[关键词 ] 　土槿皮乙酸;BGC823细胞;细胞凋亡;信号转导
[中图分类号 ] 　R735.2　　[文献标识码 ] 　B　　[文章编号 ] 　1002-266X(2008)09-0120-02
　　土槿皮乙酸(PAB)是从土槿皮中分离出来的三
帖内酯类化合物 , 具有抗真菌 、抗生育 、抗癌作
用 [ 1] 。我们采用体外细胞培养技术 ,研究 PAB对人
胃腺癌细胞 BGC823中磷酸化 PI3K/AKT表达的影
响 ,探讨其诱导胃癌细胞凋亡与 PI3K/AKT信号转
导通路之间的关系。
1　资料与方法
1.1　临床资料　人胃癌细胞株 BGC823由我科室
传代培养 ,在含 10%胎牛血清的 RPMI1640培养液 、
饱和湿度 、饱和温度为 37 ℃、CO2浓度为 5%的培
养箱中培养 。胎牛血清购自 Gibco公司;噻唑蓝
(MTT)、PI购自 Sigma公司;磷酸化和非磷酸化
PI3K、AKT均购自 CelSignal公司;Caspase-3、β -ac-
tin及抗兔和抗鼠的二抗均为 SantaCruz公司产品;
流式细胞仪为 BD公司产品;PAB购自中国药品生
物制品检定所 。
1.2　实验方法
1.2.1　MTT检测　收集对数生长期的 BGC823细
胞 ,以 1 ×105 /L密度接种于 96孔培养板中 ,每孔
100 μl,一组加 0.5 μmol/LPAB分别培养 8、16、24、
48、72 h,另一组加入不同浓度的 PAB使其终浓度
分别为 0、0.125、0.25、0.5、1、1.5、2.5μmol/L,培养
120
　山东医药 2008年第 48卷第 9期　
24 h。每组设 6个平行孔 ,空白对照孔加入 100 μl
培养基作本底 ,对照调零。另设二甲基亚砜(DM-
SO)对照组 ,于上述培养时间后 ,每孔加入新鲜配制
的浓度为 5g/L的 MTT20 μl,继续培养 4 h后取出
培养板 ,小心吸弃培养基 ,每孔加 DMSO150 μl,轻
轻震荡 10 min后 ,用酶联仪于 570 nm处测出各孔
吸光度值(A值),按下式计算细胞抑制率:细胞抑
制率(%)=(1 -给药孔平均 A值 /对照孔平均 A
值)×100%,实验重复 3次。
1.2.2　细胞周期分布及凋亡检测　细胞培养 24h后
换液 ,实验组加入 PAB使其终浓度为 0.5μmol/L,孵
育 12、24、48、72h后胰酶消化收集细胞 ,进行流式细
胞仪检测。以凋亡指数(APO)表示细胞凋亡情况:
APO=(凋亡细胞数 /所测细胞数)×100%。
1.2.3　Westernblot法　取处理后细胞 ,加入细胞
裂解液 100 μl,超声破碎 , 14 000 g离心 30 min,定
量蛋白 ,取 20μg蛋白 , 10% ～ 15%SDS聚丙烯酰胺
凝胶电泳后 ,电转移至硝酸纤维膜上 , 5%脱脂牛奶
封闭后依次加入第一 、二抗体 ,在室温下孵育 2 h,
TBST缓冲液洗涤 3次 ,每次 10 min,碱性磷酸酶法
显色后扫描测灰度值 。
1.3　统计学方法　实验数据用x±s表示 ,用 SPSS
11.0统计软件进行处理。以 P≤0.05为有统计学
差异。
2　结果
2.1　细胞抑制　PAB在 0.5μmol/L以下对胃癌细
胞生长无显著影响 ,在 0.5 ～ 2.5 μmol/L浓度范围
内 ,作用 24h后 ,对胃癌细胞的增殖有显著的抑制
作用(P<0.01或 0.05),并且随着浓度的增加 ,对
细胞的抑制率也逐渐增加 。同一浓度 PAB对胃癌
细胞的抑制作用随着时间的延长也逐渐增强。
2.2　细胞凋亡　PAB对 BGC823细胞周期及细胞
凋亡的影响见表 1。
表 1　PAB对 BGC823细胞周期及细胞凋亡的
影响(x±s, n=3)
作用时间
(h)
细胞周期
G0 /G1 S G2/M
凋亡率
(%)
0 51.87±1.98 40.45±4.50 7.68±1.98 1.22±0.08
12 60.82±2.48 35.83±3.43 7.35±1.68 1.23±0.12
24 64.30±3.67 30.34±2.87 5.36±1.08 4.16±1.68
48 69.06±5.89＊ 27.02±4.32＊ 3.92±0.98＊ 14.42±1.45＊
72 78.76±1.66＊ 20.27±1.05＊ 0.97±0.54＊ 24.16±5.88＊
　　注:与 0h时比较 , ＊P<0.05
2.3　Westernblot结果　用 0.5 μmol/LPAB作用
于 BGC823细胞 24 h后 , 35 kDa的 Caspase-3出现
17 kDa的断裂片段 ,表明 Caspase-3已被快速活化 ,
从而促进细胞凋亡。 24h后磷酸化的 PI3K、AKT降
低 , 72h降低最明显 ,而总的 PI3K、AKT的量没有变
化。磷酸化 PI3K、AKT分别是其活性形式 ,这表明
PAB抑制了 PI3K、AKT信号转导通路。
3　讨论
细胞凋亡主要有两种通路:一种是以 Fas和
TNF-α为代表死亡受体信号转导途径;另一种是以
线粒体为核心的凋亡途径。死亡受体通过与死亡配
体特异性结合后将凋亡信号由胞外传入胞内 ,在连
接分子的媒介下 ,引起上游 Caspase-8的激活 ,导致
Caspase-9激活 ,最终导致 Caspase-7激活 ,进而裂解
DNA损伤细胞 ,引起细胞凋亡 。线粒体通路是指在
细胞凋亡信号的刺激下 ,线粒体功能障碍 ,膜通透性
改变 , 凋亡蛋白从线粒体释放到胞质中 , 激活
Caspase-9,继而活化 Caspase-3,启动 Caspase的级联
反应 ,引起细胞凋亡 。Caspase蛋白酶在这两种通路
中都起着非常重要的作用。 Caspase-3是线粒体途
径及死亡受体途径两条信号途径的共同通道 ,其活
化及表达增加标志着细胞内的凋亡机制已经启
动[ 2] 。本实验证明 PAB能使 Caspase-3快速活化 ,
从而促进细胞凋亡的发生。
PI3K/AKT信号传导通路的活化在肿瘤发生 、
发展中具有重要作用 ,此信号转导通路的活化抑制
肿瘤细胞凋亡 、促进肿瘤细胞生存。 PI3K/AKT信
号转导通路抗细胞凋亡作用可能通过调节 bcl-2家
族成员的活性 ,使 Caspase-9和 Caspase-3失活 ,活化
转录因子 NF-κB,防止线粒体释放细胞色素 c及凋
亡因子 ,抑制肿瘤细胞膜上 TRAIL受体的活性等多
条途径抑制细胞凋亡 [ 3] 。本实验证明 PAB使磷酸
化的 PI3K/AKT表达降低 ,非磷酸化的 PI3K/AKT无
明显改变 ,同时 Caspase-3活性升高 。说明 PAB可
能通过抑制 PI3K/AKT活性进而导致 Caspase-3活
性升高诱导肿瘤细胞的凋亡 。
本研究表明 , PAB能明显抑制胃癌 BGC823细
胞的增殖 。PI3K/AKT活性下降 ,导致 Caspase-3激
活及其对肿瘤细胞周期运行的影响可能是其抑制肿
瘤细胞增殖 、诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制之一 。
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(收稿日期:2008-01-13)
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　山东医药 2008年第 48卷第 9期