全 文 ：［收稿日期］ 20131024(014)
［基金项目］ 国家自然科学基金项目(81260627);石河子大学国家级大学生创新创业训练计划项目(111075938)
［第一作者］ 王幻，硕士，从事天然药物分析研究，Tel:13565544456，E-mail:82540129@ qq． com
［通讯作者］ * 唐辉，博士，教授，硕士生导师，从事新疆特种植物药的开发与利用研究，Tel:0993-2055002，E-mail:th_pha@ shzu． edu． cn
HPLC测定天山花楸叶提取物中 6 种黄酮成分
王幻，唐辉* ，王国军，阚萌萌，任涵兰，徐鹏，李照雪
( 石河子大学药学院，新疆特种植物药资源教育部重点实验室，新疆 石河子 832002)
［摘要］ 目的:HPLC梯度洗脱法同时测定天山花楸叶提取物中的芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素-3-O-(6″-O-丙二酰
基)-β-D-葡萄糖苷、紫云英苷、山柰素-3-O-(6″-O-丙二酰基)-β-D-葡萄糖苷。方法:采用 Waters C18色谱柱 (4. 6 mm × 150 mm，
5 μm)，乙腈-0. 4%磷酸溶液为流动相梯度洗脱，运行时间 30. 0 min，平衡时间 10 min，流速 1. 0 mL·min －1，柱温 25 ℃，波长
360 nm。结果:芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素-3-O-(6″-O-丙二酰基)-β-D-葡萄糖苷、紫云英苷、山柰素-3-O-(6″-O-丙二酰
基)-β-D-葡萄糖苷分别在 3. 3 ～ 39. 5，6. 2 ～ 74. 1，12. 3 ～ 147. 5，14. 3 ～ 171. 2，7. 5 ～ 90. 4，15. 6 ～ 187. 5 mg·L －1与峰面积呈良好
的线性关系;平均加样回收率分别为 98. 1%，97. 5%，94. 5%，95. 8%，102. 2%，97. 9%，其 ＲSD 分别为 1. 37%，1. 57%，
1. 02%，1. 77%，2. 48%，1. 38%。结论:该法操作简便、快捷、准确、稳定性及重复性好，可用于对天山花楸中 6 个成分的含量
测定。
［关键词］ 天山花楸;芦丁;金丝桃苷;异槲皮苷;槲皮素-3-O-(6″-O-丙二酰基)-β-D-葡萄糖苷;紫云英苷;山柰
素-3-O-(6″-O-丙二酰基)-β-D-葡萄糖苷
［中图分类号］ Ｒ284. 1 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1005-9903(2014)15-0058-04
［doi］ 10． 13422 / j． cnki． syfjx． 2014150058
［网络出版地址］ http:/ /www． cnki． net /kcms /detail /11． 3495． Ｒ． 20140609． 1546． 018． html
［网络出版时间］ 2014-06-09 15:46
Simultaneous Determination of Six Compounds in
Sorbus tianschanica Extract by HPLC
WANG Huan，TANG Hui* ，WANG Guo-jun，KAN Meng-meng，ＲEN Han-lan，XU Peng，LI Zhao-xue
(College of Pharmacy Shihezi University Key Laboratory of
Xinjiang Phytomedicine Ｒesourses，Shihezi 832002，China)
［Abstract］ Objective:A high-performance liquid chromatographic method was established to evaluate the
quality of Sorbus tianschanica with a simultaneous determination of six compounds ［rutin， hyperoside，
isoquercitrin， quercetin-3-O-(6″-O-malonyl )-β-D-glucoside， kaempferol-3-O-β-D-glucopyranoside and
kaempferol-3-O-(6″-O-malonyl)-β-D-glucpyranoside］． Method:The Diamonsil C18 (4. 6 mm × 250 mm，5
μm)column was adopted and diluted with acetonitrile-0. 4% potassium dihydrogen phosphate gradiently at the
wavelength of 360 nm． The flow rate was 1. 0 mL·min －1 and the column temperature was 25 ℃ ． Ｒesult:The
method had good linearity over the range of 3. 3-39. 5，6. 2-74. 1，12. 3-147. 5，14. 3-171. 2，7. 5-90. 4，15. 6-
187. 5 mg·L －1 for rutin，hyperoside，isoquercitrin，quercetin-3-O-(6″-O-malonyl)-β-D-glucoside，kaempferol-
3-O-β-D-glucopyranoside，kaempferol-3-O-(6″-O-malonyl)-β-D-glucopyranoside， respectively． The average
recovery (n = 6)of six components were 98. 1%，97. 5%，94. 5%，95. 8%，102. 2%，and 97. 9%，with
ＲSDs of 11. 37%，1. 57%，1. 02%，1. 77%，2. 48%，and 1. 38% (n = 6)． Conclusion:The developed
·85·
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2014 年 8 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 20，No． 15
Aug．，2014
method is convenient，rapid and accurate with high repeatability and stability，it is suitable for the content
determination．
［Key words］ Sorbus tianschanica;rutin;hyperoside;isoquercitrin;quercetin-3-O-(6″-O-malonyl)-
β-D-glucoside;kaempferol-3-O-β-D-glucopyranoside;kaempferol-3-O-(6″-O-malonyl)-β-D-glucopyranoside
天山花楸为蔷薇科植物［1］，其枝叶和果实在维
吾尔、哈萨克族民间临床中，常被用以治疗肺结核、慢
性气管炎、咳嗽等疾病。药理实验证明天山花楸具有
保护心肌缺血、镇咳平喘、抗动脉粥样硬化和治疗糖
尿病等［2-5］作用。天山花楸枝叶提取物中黄酮类化合
物的质量分数可达 6% ～8%［6-7］，对其黄酮类单体化
合物的含量测定，目前仅限于几种常见的化合物，如
槲皮素、芦丁、金丝桃苷等［8-11］，本课题组用高速逆流
色谱仪(HSCCC)分离纯化其单体，在确定了化学成
分的研究基础上，首次分离到槲皮素-3-O-(6″-O-丙二
酰基)-β-D-葡萄糖苷、紫云英苷、山奈素-3-O-(6″-O-
丙二酰基)-β-D-葡萄糖苷 3 个化合物，并建立了
HPLC梯度洗脱法同时测定天山花楸叶提取物中芦
丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素-3-O-(6″-O-丙二酰
基)-β-D-葡萄糖苷、紫云英苷、山奈素-3-O-(6″-O-丙
二酰基)-β-D-葡萄糖苷 6 种黄酮类成分的定量分析
方法。
1 材料
1. 1 仪器 LC-20A 型高效液相色谱仪(包括在线
脱气机、自动进样器、二极管阵列检测器、LC solution
工作站等，日本岛津)，BP211D 型电子分析天平(德
国 Staotious) ，AＲ1140 型 1 /万电子分析天平(奥豪
斯国际贸易有限公司)，TP 300 型超声波清洗器(天
鹏电子新技术有限公司)，A-1000S 型水流抽气机
(德国，EYELA)，CCA-20 型低温冷却水循环泵。
1. 2 试药 对照品芦丁(批号 100080-200707)、金
丝桃苷(批号 111521-200505)、紫云英苷(批号
110756-200110)均购自中国食品药品检定研究院、
异槲皮素苷(上海博蕴生物科技有限公司，批号
21637-25-3)，槲皮素-3-O-(6″-O-丙二酰基)-β-D-葡
萄糖苷(自制，纯度 97%)和山柰素-3-O-(6″-O-丙二
酰基)-β-D-葡萄糖苷(自制，纯度 96%)由本实验室
分离得到，经MS，1H-NMＲ，13C-NMＲ 确定结构，并通
过 HPLC峰面积归一化法分析测定纯度。乙腈为色
谱纯，水为纯净水，其他试剂均为分析纯。天山花楸
叶采自新疆玛纳斯林场，经石河子大学药学院李鹏
副教授鉴定为蔷薇科天山花楸 Sorbus tianschanica
Ｒupr。天山花楸黄酮提取物自制(批号 20150324);
以芦丁为对照品，采用紫外分光光度法测定了天山
花楸叶提取物中总黄酮的质量分数 ＞ 65%。
2 方法与结果
2. 1 对照品溶液配制 精密称取经减压干燥至恒
重的芦丁、金丝桃苷、异槲皮素苷、槲皮素-3-O-(6″-
O-丙二酰基)-β-D-葡萄糖苷、紫云英苷、山柰素-3-O-
(6″-O-丙二酰基)-β-D-葡萄糖苷适量，置于 25 mL
量瓶中，用甲醇配置成含芦丁 65. 9 mg·L －1、金丝桃
苷 123. 5 mg·L －1、异槲皮素苷 245. 8 mg·L －1、槲皮素-
3-O-(6″-O-丙二酰基)-β-D-葡萄糖苷 285. 3 mg·L －1、
紫云英苷 150. 7 mg·L －1、山柰素-3-O-(6″-O-丙二酰
基)-β-D-葡萄糖苷 312. 5 mg·L －1的混合对照品溶
液，即得。
2. 2 样品溶液的制备 称取天山花楸叶粉 1 kg，用
60%乙醇超声循环提取 2 次，每次提取 30 min，浓
缩。加入澄清剂沉淀过滤后，经 AB-8 大孔吸附树
脂，经水和 60%乙醇分别洗脱，收集 60%醇洗脱液，
浓缩冷冻干燥即得天山花楸总黄酮提取物 74 g。精
密称取天山花楸叶总黄酮提取物粉末24. 8 mg，置
10 mL量瓶中，用甲醇定容。精密量取 3 mL 于 10
mL量瓶中，用流动相定容，过 0. 45 μm 滤膜，取续
滤液做为样品溶液，待测。
2. 3 色谱条件 Waters C18色谱柱 (4. 6 mm ×
250 mm，5 μm)，检测波长 254 nm，柱温箱温度
25 ℃，流动相乙腈-0. 4%磷酸溶液梯度洗脱(0 ～ 20
min，15% ～ 22% A;20 ～ 30 min，22% ～ 30% A)，平
衡时间 5 min，进样量 10 μL，流速 1 mL·min －1。见
图 1。在上述色谱条件下，样品保留时间适宜，样品
中各个组分的色谱峰分离度良好。
2. 4 标准曲线的绘制 分别精密取 2. 1 项下的对
照品溶液 0. 5，1. 0，3. 0，4. 0，5. 0，6. 0 mL，分别置于
10 mL量瓶中，以甲醇定容，摇匀，即得系列浓度的
混合对照品溶液，进样体积为 10 μL，注入液相色
谱仪，记录色谱图。以色谱图峰面积(Y)为纵坐
标，对照品溶液进样量(X)为横坐标，进行线性回
归，得回归方程，见表 1。取混合对照品不断稀释
后进样分析，以 3 倍信噪比确定检测限，结果见
表 1。
2. 5 精密度试验 将 2. 1 项下中间质量浓度梯度
点的混合对照品，依照2. 3中的色谱条件连续进样
·95·
王幻，等:HPLC测定天山花楸叶提取物中 6 种黄酮成分
表 1 天山花楸中 6 个成分的标准曲线方程、相关系数和线性范围
成分 标准曲线方程 r 线性范围 /mg·L －1 检测限 /mg·L －1
芦丁 Y = 150． 0X + 69． 53 0． 999 8 3． 3 ～ 39． 5 0． 23
金丝桃苷 Y = 208． 7X + 46． 99 0． 999 9 6． 2 ～ 74． 1 0． 34
异槲皮素苷 Y = 155． 6X + 53． 56 0． 999 8 12． 3 ～ 147． 5 0． 21
槲皮素-3-O(6″-O-丙二酰基)-β-D-葡萄糖苷 Y = 112． 2X + 58． 84 0． 998 0 14． 3 ～ 171． 2 0． 53
紫云英苷 Y = 111． 8X + 43． 16 0． 999 9 7． 5 ～ 90． 42 0． 36
山柰素-3-O-(6″-O-丙二酰基)-β-D-葡萄糖苷 Y = 61． 64X + 16． 41 0． 999 7 15． 6 ～ 187． 5 0． 67
A混合对照品;B供试品;1. 芦丁;2. 金丝桃苷;
3. 异槲皮苷;4. 槲皮素-3-O-(6″-O-丙二酰基)-β-D-葡萄糖苷;
5. 紫云英苷;6. 山柰素-3-O-(6″-O-丙二酰基)-β-D-葡萄糖苷
图 1 天山花楸 HPLC
测定 6 次，进样量 10 μL，记录每个对照品的峰面
积，求得日内精密度;连续进样 3 d，每天进样 1 次，
求得日间精密度。结果表明，6 种成分峰面积的日
内精密度的 ＲSD 分别为 1. 17%，0. 27%，0. 38%，
0. 77%，0. 49%，0. 27%;日间精密度的 ＲSD 分别为
2. 08%，0. 51%，0. 44%，0. 89%，0. 63%，0. 32%，结
果表明仪器精密度良好。
2. 6 稳定性试验 取同一份供试品溶液，按 2. 2 项
中色谱条件于 1，2，4，8，16，24 h 分别进样测定，记
录 6 种成分的峰面积。结果 6 种成分峰面积的 ＲSD
分别为 1. 36%，1. 47%，1. 10%，0. 50%，1. 60%，
1. 40%，表明各个组分在 24 h内稳定良好。
2. 7 重复性试验 按照 2. 2 项下的条件平行配置
供试品溶液 6 份，按项目 2. 3 中色谱条件进样测定，
记录 6 种成分的积分峰面积，6 种成分峰面积的
ＲSD 分 别 为 1. 61%，1. 41%，0. 90%，1. 34%，
1. 44%，1. 94%，结果表明方法的重复性良好。
2. 8 加样回收率试验 精密称取 2. 2 项下处理的
已知含量的天山花楸叶总黄酮提取物粉末 6 份，每
份约 6. 12 mg，精密称定，定容至10 mL量瓶中。精密
量取芦丁(73. 8 mg·L －1)、金丝桃苷(153. 6 mg·L －1)、
异槲皮素苷(297. 0 mg·L －1)、槲皮素-3-O(6”-O-丙
二酰基)-β-D-葡萄糖苷(317. 3 mg·L －1)、紫云英苷
(199. 8 mg·L －1)、山柰素-3-O-(6″-O-丙二酰基)-β-
D-葡萄糖苷(256. 0 mg·L －1)，1 mL 于 10 mL 量瓶
中，用流动相定容至刻度，过 0. 45 μm 滤膜。计算
各化合物的平均加样回收率见表 2。
表 2 天山花楸叶提取物中 6 种成分加样回收率试验(n = 6)
成分
样品中量
/μg
加入量
/μg
测得量
/μg
平均值
/%
ＲSD
/%
芦丁 7． 2 7． 38 14． 44 98． 1 1． 37
金丝桃苷 13． 50 15． 36 28． 48 97． 5 1． 57
异槲皮素苷 29． 4 29． 7 57． 50 94． 5 1． 02
槲皮素-3-O-(6″-O-
丙二酰基)-β-D-葡萄
糖苷
31． 32 31． 73 61． 55 95． 8 1． 77
紫云英苷 17． 65 19． 98 38． 06 102． 2 2． 48
山柰素-3-O-(6″-O-
丙二酰基)-β-D-葡萄
糖苷
24． 66 26． 50 49． 01 97． 9 1． 38
2. 9 样品含量测定 按 2. 2 项下方法制备供试品
溶液，进样体积 10 μL，计算芦丁、金丝桃苷、异槲皮
素苷、槲皮素-3-O(6″-O-丙二酰基)-β-D-葡萄糖苷、
紫云英苷、山柰素-3-O-(6″-O-丙二酰基)-β-D-葡萄
糖苷的含量。4 批样品测定结果见表 3。
3 讨论
考察了提取溶剂(甲醇及 30%，60%，80%，
95%乙醇)、提取方法(热回流和超声法)、提取时间
(20，30，40 min)和提取次数(1，2 次)，结果以 60%
乙醇作为提取溶剂，超声法提取 30 min，超声 2 次，
色谱峰数目较多，且方法简单，经济实用。
分别对甲醇-水、乙腈-水、甲醇-磷酸水、乙腈-磷
酸水、乙腈-乙酸水等多个流动相系统不同比例进行
了等度和梯度试验，结果甲醇-水和甲醇-磷酸水系
统条件下，槲皮素-3-O(6″-O-丙二酰基)-β-D-葡萄糖
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表 3 天山花楸叶提取物黄酮苷的含量(n = 4)
批号
提取量 /mg·g － 1 ＲSD /%
芦丁
金丝
桃苷
异槲皮
素苷
槲皮素-3-O
(6″-O-丙二
酰基)-β-D-
葡萄糖苷
紫云
英苷
山柰素-3-O-
(6″-O-丙二
酰基)-β-D-
葡萄糖苷
芦丁
金丝
桃苷
异槲皮
素苷
槲皮素-3-O
(6″-O-丙二
酰基)-β-D-
葡萄糖苷
紫云
英苷
山柰素-3-O-
(6″-O-丙二
酰基)-β-D-
葡萄糖苷
20130310 0. 870 6 1. 632 4 3. 555 3. 788 4 2. 134 2 2. 981 8 0. 52 0. 69 1. 02 1. 37 0. 97 1. 14
20130328 0. 830 6 1. 592 4 3. 258 3. 389 3 1. 868 9 2. 583 3 0. 45 0. 84 1. 09 1. 39 0. 87 1. 22
20130405 0. 884 3 1. 942 4 3. 699 3. 628 4 2. 345 6 3. 233 4 0. 60 0. 75 1. 12 1. 53 0. 94 1. 26
20130427 0. 927 7 1. 740 2 3. 899 3. 982 4 2. 033 4 3. 372 2 0. 55 0. 72 0. 97 1. 34 0. 99 1. 13
苷不能达到完全分离，基线漂移严重;乙腈-水系统
条件下，槲皮素-3-O-(6″-O-丙二酰基)-β-D-葡萄糖
苷、紫云英苷、山柰素-3-O-(6″-O-丙二酰基)-β-D-葡
萄糖苷存在拖尾现象;乙腈-乙酸水系统条件下，黄
酮类为酚酸类化合物，容易造成拖尾峰，基线不稳;
因此选择乙腈-磷酸水系统为流动相。曾尝试过体
积分数 0. 05%，0. 1%，0. 3%，0. 4% 磷酸水溶液，经
试验证明体积分数 0. 4% 磷酸水溶液梯度洗脱各
测定物质的柱效和相邻两物质之间的分离度最佳，
有效消除了峰的拖尾现象。故确定流动相为乙腈-
0. 4%磷酸水溶液梯度洗脱。本实验采用二极管阵
列检测器在 200 ～ 500 nm 检测，结果表明 360 nm下
各指标成分都具有适宜的灵敏度，且在此波长下基
线平整，其他成分干扰小。故选择 360 nm 为测定
波长。
本试验中所涉及的部分对照品为本实验室自
制，通过 HSCCC分离天山花楸叶黄酮提取物中的黄
酮化合物，经过大孔树脂纯化后，通过二级质谱数据
分析、13C-NMＲ、1H-NMＲ及对照品比对，明确了天山
花楸叶黄酮提取物中 6 种主要化合物的结构［12-13］，
并通过 HPLC峰面积归一化法分析测定纯度。
本文所建立的天山花楸中 6 种化合物的含量测
定方法简单准确、稳定可靠、精密度高、重复性好符
合快速分析的要求，达到了快速测定黄酮苷含量的
目的。
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［责任编辑 顾雪竹］
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王幻，等:HPLC测定天山花楸叶提取物中 6 种黄酮成分