全 文 ：收稿日期:2016-01-22
基金项目:湖北省自然科学基金(2015CFB250) ;武汉市青年科技晨光计划(2015071704011629)
作者简介:武欣迎(1981-) ，男，硕士，主治医师，主要从事纤维化疾病的防治研究;Tel:027-68831991，E-mail:shanghuchuan@ 126. com。
* 通讯作者:陈镜楼，Tel:027-68831991，E-mail:jinglouchen@ 126. com。
渐尖毛蕨总黄酮通过 miＲ-29 /TGF-β1 调控
慢性镉暴露诱导的大鼠肾脏损伤
武欣迎，陈镜楼*
(华中科技大学同济医学院附属普爱医院，湖北 武汉 430033)
摘要 目的:研究渐尖毛蕨总黄酮对慢性镉暴露诱导大鼠肾脏损伤的影响。方法:采用暴露于含250 mg /L氯
化镉饮水 16 w的方式诱导大鼠慢性肾损伤模型，灌胃渐尖毛蕨总黄酮干预。实验周期结束后检测大鼠血肌酐
(Cr) 和尿素氮(BUN) 含量、肾脏胶原沉积情况及血清超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px) 活性
和丙二醛(MDA) 水平，并检测肾脏TGF-β1 和微小 ＲNA(miＲ)-29a /b /c的表达。结果:渐尖毛蕨总黄酮能显著改善
镉诱导的大鼠肾脏胶原沉积，降低血清 Cr、BUN、MDA水平，提高血清 SOD和 GSH-Px活性，抑制肾组织 TGF-β1 表
达并上调 miＲ-29a /b /c表达。结论:渐尖毛蕨总黄酮对慢性镉暴露诱导的大鼠肾脏损伤具有潜在的抑制作用，其作
用机制与抑制氧化应激，调控肾脏 TGF-β1 及 miＲ-29a /b /c表达有关。
关键词 渐尖毛蕨总黄酮;镉;肾脏损伤
中图分类号:Ｒ285. 5 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2016)08-1879-04
DOI:10. 13863 / j. issn1001-4454. 2016. 08. 048
近年来重金属污染引起了越来越多的关注，尤
其是镉在石油化工和电池生产等工业中的广泛应用
使得土壤和水源的镉污染问题日益严重，随之而来
的蔬菜和水产品等中的镉残留导致人类慢性暴露于
镉〔1〕。另一个接触镉的重要来源则是吸烟〔2〕。慢
性镉暴露能对人体多种组织器官产生损害，包括促
进肾脏的上皮-间质转化(Epithelial-to-mesenchymal
transition，EMT) 和纤维化进程〔3，4〕。渐尖毛蕨 Cys-
losorus acuminatus(Houtt. )Nakai是金星蕨科毛蕨属
植物，药用名为黑舒筋、牛肋巴、小叶凤凰尾巴草等，
在江浙等民间地区用于治疗热淋( 前列腺炎、膀胱
炎、肾盂肾炎、尿道炎等泌尿生殖系统疾病) 等〔5〕。
笔者前期研究发现渐尖毛蕨总黄酮成分具有显著的
抗氧化抗炎和肾保护活性〔6〕。本研究拟探讨渐尖
毛蕨总黄酮对慢性镉暴露诱导的大鼠肾脏损伤的影
响。
1 材料与仪器
1. 1 实验动物 SPF 级 6 周龄雄性 SD 大鼠，体质
量(200 ± 20)g，购自华中科技大学实验动物中心，
实验动物生产许可证号:SCXK 鄂 2010-0009。实验
大鼠于温度(22 ± 3)℃、湿度(50 ± 10)%、昼夜节律
12 h光照∶ 12 h黑暗环境下饲养，自由饮食饮水。
1. 2 药物与试剂 渐尖毛蕨药材采收于江西省九
江市，经江西省九江市林业科学研究所谭策铭高级
工程师鉴定为金星蕨科毛蕨属植物渐尖毛蕨 Cy-
closorus acuminatus(Houtt．)Nakai，按笔者前期发表
的方法制备和检测渐尖毛蕨粗黄酮〔6〕，黄酮含量为
(32. 96 ± 3. 22)%，随后采用 HPD500 型大孔树脂纯
化，依次用蒸馏水、30%乙醇和 70%乙醇洗脱，收集
70%乙醇洗脱段落得渐尖毛蕨总黄酮，黄酮质量分
数为(87. 23 ± 3. 67)%;氯化镉(CdCl2)购自上海国
药集团;尿素氮、血肌酐、超氧化物歧化酶(SOD)、谷
胱甘肽过氧化酶(GSH-Px) 和丙二醛(MDA) 试剂盒
购自南京建成生物工程研究所;TＲIzol 试剂盒购于
美国 Invitrogen 公司;All-in-OneTM qPCＲ Master Mix
试剂盒购自美国 GeneCopoeia公司。
1. 3 主要仪器 BA310 显微镜，福建省厦门市
Motic公司; 冷冻干燥机，美国VirTis 公司;StepOne
Plus 型 Ｒeal time-PCＲ 仪，美国 ABI 公司;ＲM2016
切片机，上海市徕卡仪器有限公司;KD-BM 包埋机，
浙江省金华市科迪仪器设备有限公司。
2 方法
2. 1 动物造模、分组及给药 大鼠适应环境 1 w后
随机分为 5 组(n = 8) : 正常对照组、模型组及渐尖
毛蕨总黄酮 25、50、100 mg /kg组。除正常对照组外
各组大鼠给予含 250 mg /L CdCl2的饮水( 蒸馏水配
制)〔3，4〕，正常对照组给予蒸馏水。造模期间渐尖毛
蕨总黄酮各组分别每日灌胃相应剂量药物，正常对
照组及模型组大鼠灌胃等体积生理盐水。实验周期
为 16 w。
2. 2 指标检测 实验周期结束后，收集血浆用于
检测尿素氮和血肌酐含量，并分离肾脏组织，分割为
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3 份。其中一份进行 4%的多聚甲醛固定、石蜡包埋
和组织切片，用于 masson 和天狼星红染色观察组织
胶原沉积及 PAS染色观察肾脏基底膜增厚的情况，
并于 400 倍光学显微镜下观察拍照。一份用冰冷的
生理盐水制备 10%的组织匀浆，用于检测肾脏组织
中抗氧化酶 SOD和 GSH-Px活性及脂质过氧化特征
产物 MDA的含量，操作步骤均按说明书进行。一
份用于 ＲT-PCＲ 检测肾脏 TGF-β1 和 microＲNA
(miＲ)-29a /b /c的表达情况。用 Trizol 试剂盒提取
肾脏组织总 ＲNA，进行逆转录合成 cDNA。20 μL的
逆转录体系包括 1 μg总 ＲNA、2 μL dNTPs、12. 5 μL
primer mix、0. 5 μL ＲiboLock Ｒnase Inhibitor和 1 μL
ＲevertAid Ｒeverse Transcriptase，用 ddH2O 定容。逆
转录参数为 35 ℃ ×10 min、42 ℃ × 60 min 和 70 ℃
×10 min。随后 20 μL 的 qPCＲ 反应体系包括 10
μL qPCＲ Master Mix、5 μL cDNA、0. 4 μL 前引物和
后引物，用 ddH2O定容。反应参数为 95 ℃反应 10
min后进行 40 个循环，循环条件为 95 ℃ × 10 s，60
℃ ×20 s和 72 ℃ ×20 s。相对表达量通过 2 － ΔΔCt公
式计算，以正常对照组表达水平归一。各引物根据
GenBank序列号由 primer 5. 0 软件设计，引物序列
见表 1，其中 miＲ-29a /b /c 内参为 U6，TGF-β1 内参
为 GAPDH。
表 1 各引物序列表
基因 GenBank序号 上游引物 5-3 下游引物 5-3 逆转录引物 5-3
rno-miＲ-29a-3p MIMAT0000802 GGGCCTAGCAC-
CATCTGAAAT
CAGTGCAGGGTC-
CGAGGTAT
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-
TATTCGCACTGGATACGACTAACCG
rno-miＲ-29b-3p MIMAT0000801 GGGGTAGCAC-
CATTTGAAATC
CAGTGCAGGGTC-
CGAGGTAT
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-
TATTCGCACTGGATACGACAACACT
rno-miＲ-29c-3p MIMAT0000803 GGGGTAGCAC-
CATTTGAAATC
CAGTGCAGGGTC-
CGAGGTAT
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-
TATTCGCACTGGATACGACTAACCG
TGF-β1 NM-021578. 2 TATAGCAACAATTC-
CTGGCGTTACCT
GTCACCTCGACGTTT-
GGGACTGA
2. 3 统计学处理 采用 SPSS 11. 5 软件对数据进
行方差分析，数据以 珋x ± s 表示，以 P ＜ 0. 05 为差异
有统计学意义。
3 结果
3. 1 渐尖毛蕨总黄酮对镉暴露大鼠 BUN、Cr 含量
的影响 结果如表 2 所示，与正常对照比较，模型组
大鼠 BUN、Cr 含量显著升高(P ＜ 0. 01) 升高。与模
型组比较，渐尖毛蕨总黄酮各剂量组大鼠 BUN、Cr
含量显著降低(P ＜ 0. 05 或 P ＜ 0. 01)。
表 2 渐尖毛蕨总黄酮对镉暴露大鼠 BUN、
Cr含量的影响(珔x ± s，n =8)
组别
剂量 /
(mg /kg)
BUN/
(mmol /L)
Cr /
(μmol /L)
正常对照组 － 7. 1 ± 0. 9＊＊ 49. 9 ± 2. 9＊＊
模型组 － 23. 0 ± 3. 1 98. 1 ± 6. 7
渐尖毛蕨总黄酮组 25 19. 4 ± 1. 4* 90. 9 ± 3. 8*
50 14. 8 ± 1. 5＊＊ 78. 8 ± 6. 7＊＊
100 9. 5 ± 1. 2＊＊ 66. 0 ± 4. 3＊＊
注:与模型组比较，* P ＜ 0. 05，＊＊P ＜ 0. 01
3. 2 渐尖毛蕨总黄酮对镉暴露大鼠肾脏胶原沉积
和基底膜增厚的影响 结果如图 1 所示，与正常对
照组比较，模型组大鼠肾脏胶原沉积明显严重，同时
PAS染色显示模型组肾小球基底膜明显增厚。渐尖
毛蕨总黄酮可明显抑制该趋势，使镉暴露大鼠肾脏
组织胶原沉积和肾小球基底膜增厚的情况均得到改
善。
3. 3 渐尖毛蕨总黄酮对镉暴露大鼠肾组织氧化应
激水平的影响 结果如表 3 所示，与正常对照组比
较，模型组大鼠肾组织 SOD 及 GSH-Px 活性显著降
低，MDA含量显著升高(P ＜ 0. 01)。与模型组比
较，渐尖毛蕨总黄酮各剂量组大鼠肾组织 SOD、
GSH-Px 活性显著升高，MDA 含量显著降低(P ＜
0. 05 或 P ＜ 0. 01)。
3. 4 渐尖毛蕨总黄酮对镉暴露大鼠肾组织 TGF-β1
及 miＲ-29a /b /c 表达的影响 结果如图 2 所示，与
正常对照组比较，模型组大鼠肾组织 miＲ-29a /b /c
表达显著降低，TGF-β1 表达显著升高(P ＜ 0. 01)。
与模型组比较，渐尖毛蕨总黄酮各剂量组大鼠肾组
织 miＲ-29a /b /c 表达显著升高，TGF-β1 表达显著降
低(P ＜ 0. 05 或 P ＜ 0. 01)。
4 讨论
肾脏纤维化过程源于机体对慢性刺激和损伤的
响应，以细胞外基质(Extracellular matrix，ECM) 过度
合成沉积为特征，其终点为器官衰竭，涉及内皮、上
皮和脂肪等细胞转化为间质细胞等程序〔7〕。其中
上皮-间质转换(Epithelial-to-mesenchymal transition，
EMT) 是上皮细胞向间质细胞转化的过程，可造成上
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图 1 渐尖毛蕨总黄酮对镉暴露大鼠肾脏胶原沉积和基底膜增厚的影响(×400)
A. 正常对照组 B. 模型组 C. 渐尖毛蕨总黄酮 25 mg /kg 组 D. 渐尖毛蕨总黄酮 50 mg /kg 组 E. 渐尖毛蕨总黄酮 100
mg /kg组
表 3 渐尖毛蕨总黄酮对镉暴露大鼠肾组织氧化应激水平的影响(珔x ± s，n =8)
组别 剂量 /(mg /kg) SOD /(U/mg) GSH-Px /(U/mg) MDA/(nmol /mg)
正常对照组 － 169. 9 ± 9. 1＊＊ 73. 7 ± 8. 8＊＊ 3. 0 ± 0. 5＊＊
模型组 － 76. 6 ± 8. 7 38. 4 ± 5. 0 7. 3 ± 0. 7
渐尖毛蕨总黄酮组 25 97. 8 ± 11. 1＊＊ 44. 9 ± 5. 0* 6. 0 ± 0. 8＊＊
50 124. 1 ± 9. 2＊＊ 50. 6 ± 5. 5＊＊ 4. 6 ± 0. 7＊＊
100 148. 2 ± 7. 9＊＊ 63. 4 ± 5. 9＊＊ 4. 4 ± 0. 6＊＊
注:与模型组比较，* P ＜ 0. 05，＊＊P ＜ 0. 01
图 2 渐尖毛蕨总黄酮对镉暴露大鼠肾组织 TGF-β1 及 miＲ-29a /b /c表达的影响(珔x ± s，n =8)
A. 正常对照组 B. 模型组 C. 渐尖毛蕨总黄酮 25 mg /kg 组 D. 渐尖毛蕨总黄酮 50 mg /kg 组 E. 渐尖毛蕨总黄酮 100
mg /kg组
注:与模型组比较，* P ＜ 0. 05，＊＊P ＜ 0. 01
皮细胞的破坏，是器官纤维化的核心环节〔8〕。已知
高度分化的肾小球上皮细胞是维持肾小球滤过屏障
正常功能的关键所在，约 36%的成肌纤维细胞通过
EMT而形成于肾小管上皮细胞〔9〕。进而引发 ECM
的过量合成和沉积，从而启动器官纤维化的转
变〔8〕。肾脏是镉在人体蓄积后的主要损伤器官之
一。一方面，镉通过抑制机体内抗氧化酶 SOD 和
GSH-Px等的活性而导致系统和局部环境氧化应激
水平的升高，从而带来组织氧化损伤; 另一方面，镉
蓄积将激活 EMT 过程，破坏上皮完整性，加速 ECM
沉积，从而诱导肾脏的纤维化进程〔3〕。
TGF-β配体家族包括 3 种亚型的 TGF-β(1 ～ 3)
和 6 种亚型的 BMP(2 ～ 7) ，其中TGF-β1 是肾小球
硬化和肾脏纤维化的主要诱导因子之一，具有促进
细胞外基质加速合成和肾脏细胞增生，诱导促纤维
化因子产生等作用〔10〕。因此，TGF-β1 被认为是肾
脏纤维化形成的核心靶标之一〔11〕。微小 ＲNA(mi-
croＲNAs，miＲs) 是一种由21 ～ 24 个核苷酸组成的
内源性短链非编码 ＲNA，在哺乳动物体内广泛存
在。现已发现 miＲs 在多种器官的纤维化过程中均
起到调节子的作用〔7〕。其中 miＲ-29 家族被认为是
肾脏纤维化的抑制性调解者，其表达可在一定程度
上阻断 EMT 过程，抑制 ECM 沉积〔12〕。而 miＲ-29
家族的抗纤维化作用很有可能与抑制 TGF-β1 有
关〔7〕。
综合本研究结果可以发现，渐尖毛蕨总黄酮能
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显著改善模型动物的肾脏胶原沉积和基底膜增厚，
降低血清 Cr、BUN、MDA 水平，提高血清 SOD 和
GSH-Px活性，抑制肾组织 TGF-β1 表达并上调 miＲ-
29a /b /c表达，表明渐尖毛蕨总黄酮对慢性镉暴露
诱导的大鼠肾脏 EMT具有潜在的抑制作用，其作用
机制与抑制氧化应激及调控肾脏 TGF-β1 及 miＲ-
29a /b /c表达有关。
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