全 文 ：收稿日期:2007-08-23
基金项目:绿色农业发展关键技术集成研究与产业化示范(20060201);加拿大披碱草与老芒麦杂种 F2 代遗传特性的研究(QN005022)
作者简介:李景环(1972-),女 ,内蒙古呼和浩特人 ,在读博士 ,主要从事植物遗传学 、分子生物学等教学与科研工作。
加拿大披碱草和老芒麦及其杂种 F1 ,F2的
RAPD分析
李景环1 , 2 ,云锦凤1 ,邰丽华2 ,王树彦1 ,吕建军2
(1.内蒙古农业大学 生态环境学院 ,内蒙古 呼和浩特　010019;2内蒙古师范大学 生命科学与技术学院 ,内蒙古 呼和浩特　010022)
　　摘要:利用随机扩增多态性 DNA技术(RAPD)对加拿大披碱草和老芒麦及其杂种F1 , F2 做了比较分析。旨在用分
子标记方法探索亲本加拿大披碱草与老芒麦及其远缘杂种后代的遗传关系 , 为后期育种提供理论依据。结果表明:
两亲本加拿大披碱草和老芒麦之间的亲缘关系较近 ,杂种 F1 主要表现为互补双亲的 RAPD扩增带 ,同时还丢失了双
亲部分的 RAPD扩增带 , 杂种F1 的多态性条带有偏向母本遗传的倾向;F1 是真正的杂种;F2 的多态性条带表明:F2与
父母本的遗传距离相差不大 ,略偏向母本。亲本与杂种 F1 , F2 的 RAPD扩增带表型均具有一定的差异 , RAPD 遗传标
记可用于杂种鉴定和目标性状植株的检测。
关键词:加拿大披碱草;老芒麦;杂种 F1 , F2;RAPD分析
中图分类号:Q321　　文献标识码:A　　文章编号:1000-7091(2007)06-0077-04
RAPD Analysis of Elymus canadensis , E.sibiricus and Their Hybrid F1 ,F2
LI Jing-huan1 , 2 ,YUN Jin-feng1 , TAI Li-hua2 ,WANG Shu-yan1 , LU Jian-jun2
(1.College of Life Science and Technology , Inner Mongolia Normal University ,Hohhot　010020 ,China;
2.College of Bio-engineering , Inner Mongolia Agricultural University ,Hohhot　010019 ,China)
Abstract:Elymus canadensis , E .sibiricus and their Hybrid F1 , F2 were analyzed by using random amplified poly-
morphic DNA(RAPD)markers.The results showed that the two parents Elymus canadensis and E.sibiricus had relatively
closer relationships.The RAPD bands of the hybrid F1were mainly mutual supplement RAPD bands of the parents;at the
same time , some RAPD bands of the parents were lost , the RAPD types of hybrid F1 showed a tendency toward the mater-
nal type.The RAPD bands of F2 showed that the genetic relationships between F2 and their parents were almost the same ,
but it also showed a tendency toward the maternal type a bit.There were differences about RAPD types between parents
and their hybrids;RAPD technique can be used to identify hybrid and to detect the plants with object traits.
Key words:Elymus canadensis;E.sibiricus;Hybrid F1 ,F2;RAPD analysis
　　加拿大披碱草与老芒麦都是生态适应性很强 ,
耐寒 、耐旱 、产量高等综合生产性能好的优良牧草 ,
它们的经济价值很大 ,而且还含有抗病和抗逆基因 ,
因此常被作物育种家选为麦类作物远缘杂交的原始
材料 ,进行转基因研究。
自20世纪 90年代以来 ,随机扩增多态性 DNA
(RAPD)分析已被证明为植物遗传多样性研究和系
统学研究的一个有用而简单的工具[ 1-3] 。且有成本
低 、分析速度快 、仅需极微量的 DNA 即能获得丰富
的多态性特征等优点 ,已被广泛应用于种间 、品种
间 、亚种或不同基因组间的分类 、遗传和进化关系等
方面的研究。远缘杂交可获得综合性状很好的 F1 ,
但是去雄时间 、方法 、授粉时间 、方法及环境条件均
影响杂交后代的纯度。在去雄不干净或自花花粉完
成授粉过程及其他外界因素的影响下 ,均容易发生
自花授粉 ,因此 ,为保证杂种 F1的纯度 ,以利用其能
恢复育性而获得性状优良的 F2植株 ,对 F1 进行杂
种纯度的鉴定是必要的 。
本研究用加拿大披碱草 、老芒麦及其杂种 F1 ,F2
进行 RAPD分析 ,旨在为解决它们的种间关系提供
华北农学报·2007 , 22(6):77-80
新的分子证据 ,并为披碱草属植物种质资源的保护
和利用提供科学的依据。
1　材料和方法
1.1　供试材料
试验材料选自内蒙古农业大学牧草试验站的加
拿大披碱草(Elymus canadensis)、老芒麦(Elymus .
sibiricus)及其杂种 F1 ,F2 ,其基本情况见表 1。
1.2　材料的采集与处理
取供试材料新鲜叶片 0.5 g(分别来源于 10个
单株),先用自来水洗掉杂质 ,然后用双蒸水冲洗 3
次 ,再用无菌滤纸吸干叶片上的水分 ,剪成 2 ～ 3 cm
的小段并用保鲜膜包好放在-20℃冰箱里备用。
表 1　所用试验材料的基本情况
Tab.1　Experimental materals
牧草名称
Species name
学名
Latin names
来源
Locality
主要特征
Character
加拿大披碱草(♀) Elymus
canadensis 北美 高产 、叶量大 、抗寒 、抗虫 、抗病
老芒麦(♂) Elymus.
sibiricus 中国 结实率高 、抗寒 、抗旱 、草质好
杂种 F1Hybrid F1
杂种 F2 Hybrid F2
1.3　DNA提取与检测[ 4 , 5]
将上述处理好的叶片样品按编号放入-20℃预
冷的研钵中 ,加液氮研磨成粉末 ,转入 10 mL离心管
中(以下均为 5 mL 的离心管),迅速加入 3 mL 65℃
预热的 CTAB提取液 ,65℃温浴 90 min;加等体积的
氯仿∶异戊醇(24∶1)充分混匀 ,4℃5 000×g 离心 10
min;取上清 ,再加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)充
分混匀 ,4℃5 000×g 离心 10 min;取上清 ,加 2/3体
积-20℃异丙醇 ,混匀 ,4℃5 000×g 离心 10 min;得
沉淀加 1.5 mL 65℃预热的 CTAB提取液 ,65℃温浴
30 min;加等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)充分混匀 ,
4℃ 5 000×g 离心 10 min;取上清 , 加 2/3 体积
-20℃异丙醇 ,混匀 , -20℃沉淀 2 h;4℃5 000×g
离心 10 min ,沉淀用 70%乙醇洗涤 2次 ,干燥;将沉
淀用 100μL TE 回溶 ,加 RNase 3 μL ,37℃放置 1 h ,
4℃冰箱保存 。
将上述提取到的 DNA 样品进行琼脂糖凝胶电
泳 ,以 1 kb plus ladder 为marker ,利用琼脂糖凝胶成
像系统检测是否提取到目的 DNA ,并确定其浓度 。
1.4　PCR反应条件与反应体系[ 4 , 6]
参照Williams等[ 7]方法 ,通过对 DNA浓度 ,引物
浓度 ,Mg2+等条件的初步调整 ,达到了优化的反应条
件:聚合酶链式反应(PCR)的条件设置为:94℃预变性
3 min ,94℃变性 1 min ,37℃退火 1 min ,72℃延伸 1.5
min ,45次循环 ,最后 72℃延伸5 min ,4℃保存。
反应体系 25μL:20 ng/μL的基因组 DNA 2 μL ,
10×PCR Buffer 2.5μL(已包含Mg2+ ,其原浓度为 15
mmol/L),0.2μmol/μL 引物 1 μL , 5 U/μL Taq酶 0.2
μL ,10 mmol/L dNTPS 2μL , d2H2O 17.3μL。RAPD反
应在 Biometrer热循环仪上进行 。每次 PCR做一次
阴性对照(不加模板)。
1.5　遗传多样性与遗传结构分析
1.5.1　遗传多态性位点百分率　根据种群间 RAPD
图谱的位点差异 ,统计特异位点(多态性位点)的数
目占所有检测位点的百分率 ,即为遗传多态性位点
百分率。
1.5.2　种群间的遗传距离和遗传一致度　Nei定义
的遗传距离为:D=-ln(I);I=2Nxy/(Nx+Ny)
式中 I 为遗传一致度;Nx 为 X 种群中出现的
RAPD标记数;Ny 为 Y种群中出现的 RAPD标记数;
Nxy 为X , Y 2个种群中共有的 RAPD标记数。采用
加拿大Alberta 大学的 Popgen32分析软件计算遗传
一致度和遗传距离 。
2　结果与分析
2.1　试验结果
筛选 8个引物(表 2)进行正式扩增 ,共产生 60
条可区分的 DNA 条带。多态性条带 39 条。引物
S127和 S315 ,只获 5条清晰的带 ,引物 S446 ,得到11
条条带 ,平均每引物产生约 8条带 。扩增结果见图
1 ,图 2 ,图 3。
表 2　引物及其序列和扩增结果
Tab.2　List of primer labels , primer sequences and
amplification results
引物
Primer
序列(5′-3′)
Sequence
总扩增带数/条
Total loci
多态性扩增带数/条
Polymorphism
loci
多态位点百分率/ %
Polymorphism
percentage
S14 TCCGCTCTGG 8 3 37.50
S127 CCGATATCCC 5 2 40.00
S133 GGCTGCAGAA 7 4 57.14
S134 TGCTGCAGGT 8 6 75.00
S141 CCCAAGGTCC 7 5 71.43
S315 CAGACAAGCC 5 4 80.00
S446 CCACGGGAAG 11 9 81.81
S459 GGTGCACGTT 9 6 66.67
Total 8 60 39 65.00
　　60条带中有 21条(占 35.00%)为共有带 ,存在
于各个样本中 。另外还有 3 条在双亲中都出现 ,故
双亲共有 24条(占 39.34%)相同的带。
F1共获得 17条多态性带 ,其中仅与母本相同
的有 12条(占其总多态性条带的 70.59%),仅与父
本相同的为 4条(占其总多态性条带的23.53%),还
有 1条与父母本均相同;F1丢失了母本的 6条带 ,丢
78　 华　北　农　学　报 22卷
失了父本的24条带 ,此外还丢失了双亲共有的一条
带。从电泳图中看出其中引物 S141 ,S315 , S446扩
增的结果充分证明了 F1是双亲的真正杂种 。但是
F1丢失了父本的大多数多态性条带 ,其绝大多数条
带来源于母本。
图 1　S14(1～ 4), S127(5 ～ 8), S133(9～ 12),
S134(13～ 16)PCR扩增图
Fig.1　PCR amplification results of S14(1-4),
S127(5-8), S133(9-12), S134(13-16)
图 2　S446(1～ 4), S459(5～ 8)PCR扩增图
Fig.2　PCR amplification results of S446(1-4),
S459(5-8)
图 3　S141(1～ 4), S315(5～ 8)PCR 扩增图
Fig.3　PCR amplification results of S141(1-4),
S315(5-8)
　　F2共产生 24条多态性带 , 11条(占其总多态性
条带的 45.83%)仅来自于母本 ,12条(占其总多态
性条带的 50%)仅来自于父本 ,还有 1 条与双亲都
相同 ,其中有 18条带与 F1相同 。
　　从表 3可以看出 ,加拿大披碱草与老芒麦的遗
传相似系数为0.571 4 ,F1与母本加拿大披碱草及父
本老芒麦的相似系数为分别为0.814 8和0.611 8 ,F2
与母本加拿大披碱草及父本老芒麦的相似系数分别
为0.809 5和0.750 0 , F1 与 F2 的遗传相似系数为
0.823 5 。
表 3　双亲及 F1 , F2代遗传一致度和遗传距离的计算结果
Tab.3　Measures of genetic identity and genetic distance
种群
Pop ID
加拿大披碱草
E.canadensis
老芒麦
E.sibiricus F1Hybrid F1
F2
Hybrid F2
加拿大披碱草
E.canadensis ＊＊＊ 0.571 4 0.814 8 0.809 5
老芒麦
E.sibiricus 0.559 7 ＊＊＊ 0.611 8 0.750 0
F1代Hybrid F1 0.204 8 0.411 3 ＊＊＊ 0.823 5
F2代Hybrid F2 0.211 3 0.287 7 0.194 2 ＊＊＊
3　讨论与结论
加拿大披碱草与老芒麦及其杂种 F1 和 F2 的
RAPD图谱产生的 60条清晰带中 ,有 24条是双亲共
有的条带 ,两亲本的遗传相似率为 0.571 4 ,这就从
DNA水平上验证出两亲本的亲缘关系相对较近 。
杂种 F1的条带主要表现为互补双亲的 DNA带
类型 ,其中引物 S141 ,S315 ,S446扩增的结果充分证
明了 F1是双亲的真正杂种 ,同时还丢失了部分双亲
具有的条带 ,但 F1 的多数条带来源于母本 ,与母本
加拿大披碱草的遗传相似率为 0.814 8 ,而与父本老
芒麦的遗传相似率为 0.611 8 ,有偏向母本遗传的倾
向。这一结果与李造哲同工酶研究的结果相一
致[ 8] 。
F2 中有约2/3(18条)的条带与 F1相同 ,说明 F2
可能是 F1 自交产生的 ,F2与父母本的遗传距离相差
不大 ,略偏向于母本 ,这主要是由于 F1 偏向母本遗
传所致 。两亲本与杂种 F1 ,F2 的 DNA 条带表型均
具有一定的差异 ,但它们之间的亲缘关系都很近。
RAPD遗传标记可用于杂种鉴定和目标性状植株的
检测 。
利用杂交优势选育新品种 ,是植物遗传改良中
常用的技术策略。利用具有优良性状互补的两个亲
本进行远缘杂交是获得高产优质新品系的主要途
径。在植物育种中 ,F1杂交种的纯度对植物育种是
至关重要的。在杂交后代的鉴定工作中 ,可以通过
植株形态特征 、细胞染色体分析和同工酶等方法来
鉴别[ 8 , 9] ,尽管这些方法在某种程度上是有效的 ,但
也存在着一些缺点。RAPD分子标记作为一种快速
简捷 、有效的检测手段 ,已被广泛应用于植物种子纯
度及杂交后代的鉴定上 ,如烟草 、水稻 、蕃茄 、玉米 、
柑桔 、唐菖蒲属植物和阿月浑子树等。本研究
RAPD标记技术在加拿大披碱草与老芒麦杂交后代
鉴定上的应用 ,可为加拿大披碱草与老芒麦的遗传
6期 李景环等:加拿大披碱草和老芒麦及其杂种F1 , F2 的 RAPD 分析 79　
改良提供科学依据和理论指导 。
本研究利用 8个引物共产生 60条清晰的 RAPD
扩增带 ,虽然所用的引物不多 ,但能从 60个位点对
供试的4个样本进行检测 ,这种效率是形态特征 、细
胞学特性等方法无法比拟的。本研究的结果基本上
同形态学 、细胞学和同工酶等分析结果相吻合[ 8] 。
因此 , RAPD 分析将是小麦族系统学研究的有效补
充手段。是辅助育种的有利手段。
由于 RAPD所用的随机引物是 10 bp的寡聚核
苷酸 ,同时 ,扩增反应还受到模板 DNA用量 、dNTP 、
Mg2+及 Taq 酶浓度等诸多因素的影响 ,因而 RAPD
技术较其他分子标记(如 RFLP)稳定性差 ,限制了它
更广泛的应用。要想得到很好的试验结果 ,必须对
RAPD的 PCR反应体系和条件进行筛选与优化。
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