全 文 ： [ 收稿日期] 2010-10-16
[ 基金项目] 湖北省教育厅重点项目(2007ABA386)
[ 第一作者简介] 刘乐承(1964-),男 ,湖北洪湖市人 ,农学博士 ,教授 ,主要从事园艺植物遗传育种的教学与研究.
doi:10.3969/ j.i ssn.1673-1409(S).2010.04.013
紫菜薹 BcMF4基因的克隆及其 RNAi植物
表达载体的构建
刘乐承 ,林小芳 (长江大学园艺园林学院 , 湖北 荆州 434025)
[摘要] 根据普通白菜(Brassica cam pestris ssp.chinensis , syn.B.rapa ssp.chinensis)雄性不育相关基因 Bc-
MF4 序列设计一对特异引物 , 从紫菜薹(B.campestris ssp.chinensis var.purpuraria)中克隆出了大小为 710
bp BcMF4 基因片段。采用 Gatew ay技术 , 构建了 BcMF4基因 RNA干涉(RNA inte rference , RNAi)植物表
达载体。为下一步通过沉默 B cMF4 基因 ,明确其对紫菜薹花粉发育和雄性不育的影响奠定了基础。
[关键词] 紫菜薹(Brassica campestris ssp.chinensis var.p urp uraria);BcMF4 基因;克隆;RNAi(RNA inter-
ference);表达载体
[中图分类号] Q785 [ 文献标识码] A [文章编号] 1673-1409(2010)04-S044-03
BcMF4(Brassica campestris Male Fert ility 4)基因是从普通白菜(B .campestris ssp.chinensis var.
communis Tsen et Lee)核雄性不育两用系中分离得到的一个雄性不育相关的隐性基因[ 1] 。目前 ,已经从
十字花科植物 11个物种中克隆出了 BcMF4的同源基因[ 2] ,而且已经证明 ,在菜心(B.campestris ssp.
chinensis var.parachinensis(Bai ley)Tsen et Lee)、拟南芥(Arabidopsis)中 , BcMF4与花粉发育有着密
切关系[ 3 , 4] 。然而 ,至今还没从紫菜薹(B.campestris ssp.chinensis var.purp uraria)克隆出 BcMF4的同
源基因。紫菜薹是十字花科芸薹属作物 ,原产我国 ,营养价值极高[ 5] 。紫菜薹早熟品种和中晚熟品种分别
于国庆 、元旦 、春节前后大量上市 ,深受大众的喜爱[ 6] 。本研究拟从紫菜薹中克隆出 BcMF4 后 ,采用
Gatew ay 技术构建其 RNA 干涉(RNA interference ,RNAi)[ 7] 植物表达载体 ,旨在为下一步通过沉默该基
因明确其对紫菜薹雄性不育的影响及分子育种奠定基础 。
1 材料与方法
1.1 材料
田间种植`十月鲜 紫菜薹 ,开花期取 2.5 mm 以上的花蕾[ 2 ～ 4] ,立即投入液氮中 ,带回实验室-75 ℃
保存备用。
T4-DNA连接酶 、pGEM-T-easy-vecto r 购自 Promega公司;1 kb DNA Ladder Marker 、100-bp DNA
Ladde r和 VITGENE DNA回收试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司;Taq DNA Polymerase 购自 Fer-
mentas公司;B型小量质粒快速提取试剂盒购自背景博大泰恒生物技术有限公司;Gatew ay·BP Clona-
se
TM
II 购自 Invit rogen公司。PCR引物委托湖北省武汉鼎国生物技术有限公司合成。 IPTG 、X-gal 、氨苄
青霉素 、利福平 、链霉素等购自北京索莱宝科技有限公司 。常规试剂均为进口或国产分析纯 。
大肠杆菌(E.col i)DH5a 菌株 、根癌农杆菌(Agrobacterium tume f aciens)LBA4404工程菌株由长江
大学许峰博士惠赠;pHGRV质粒为华中农业大学叶志彪教授惠赠。
1.2 目的片段的克隆
称取 1.0 ～ 1.5 g 紫菜薹花蕾 ,采用 CTAB法[ 8] 提取 DNA ,0.7%的琼脂糖凝胶电泳检查 、分子检测仪
·44· 长江大学学报(自然科学版) 2010年 12月第 7卷 第 4期:农学Journal of Yangtze University(Nat Sci Edit) Dec.2010 , Vol.7 No.4:Agri Sci
检测质量 。根据文献[ 4] 设计 1 对引物(B4-1:5 -GCT GGA TCC ATC AAG AAG TCC CTT AAC
AAC C-3 ;B4-2:5 -GCT TCTAGA ACA TCA TCG AAG CA T CAC C-3 ),以提取的紫菜薹
DNA 为模板进行 PCR扩增 ,扩增条件为:94 ℃预变性3 min;94 ℃变性 30 s ,63.6 ℃退火 45 s , 72 ℃延长
45 s ,共 30个循环;72 ℃延长10 min;4 ℃保存;PCR产物在 1.2%琼脂糖凝胶中电泳分离后 ,用手术刀切
下含目的片段的胶块 , 采用 VITGENE DNA 胶回收试剂盒进行回收。取适量的回收 DNA 与 50 ng
pGEMRR-T-Easyv-ecto r在 T4连接酶作用下连接。将连接产物转化大肠杆菌 DH5a 菌株感受态细胞。
在 LB/Amp/ IPTG/X-gal筛选平板上筛选重组子 ,挑选白色菌落经 LB液体培养后 ,用 B型小量质粒快速
提取试剂盒提取质粒 DNA(按说明书进行)。取适量质粒 DNA 为模板 ,以 B4-1 、B4-2为引物 ,进行 PCR
扩增鉴定。
1.3 RNAi表达载体的构建
以带有目的基因片段的重组质粒为模板 ,用 aBt tI+和 aBt t II+进行第一轮 PCR扩增(50 μL PCR反
应液中含有引物 10 pmo l/L ,扩增条件为:95 ℃2 min后 ,94 ℃10 s , 58 ℃ 30 s ,68 ℃1.5 min , 5个循
环),取 10 μL反应物至含有 40 pmol/ L aBt t 通用引物的 40 μL PCR反应液中进行第二轮扩增(95 ℃
1 min后 ,94 ℃15 s , 45 ℃30 s ,68 ℃1.5 min ,5个循环;94 ℃ 15 s , 55 ℃30 s ,68 ℃1.5 min , 15个循
环 ,68 ℃延伸 5 min),PCR产物用 0.8%琼脂糖凝胶分离检测 ,回收目的片段。在 5μL BP 缓冲液中 ,依
次加入 100 ng 纯化的 PCR产物和 100 ng 带有 attP 位点的 pHGRV 质粒 DNA ,混匀 ,加入 4μL BP Clo-
nase , 25 ℃反应过夜 。加入 1 μL 蛋白酶 K , 37 ℃ 10 min 终止反应。取反应物热击法转化大肠杆菌
DH5a , Str 50 mg/L 的 LB固体平板筛选阳性克隆。以 pHGRV 上 35S 与 Int ron序列为引物对阳性克隆
进行 PCR检测[ 9] 。提取阳性重组子质粒 ,CaCl2 转化法转化农杆菌 LBA4404[ 10] ,在含 Rif 50 mg/L 、Str
80 mg/ L的 LB平板上筛选阳性克隆 ,菌落 PCR检测验证 ,定名为 pHGRV-B4。
2 结果与分析
2.1 目的片段的获得
提取的紫菜薹基因组 DNA 经琼脂糖凝胶电泳(图 1)检测后 ,分子检测仪器检测发现 DNA 含量为
1.86 mg/mL ,D260 =0.186 ,D280 =0.091 ,D280/D 260 =0.49 ,表明提取的紫菜薹基因组 DNA 质量较好 。以
B4-1 、B4-2为引物对其进行 PCR扩增 ,得到的目的片段为单一条带 ,大小为 710 bp左右(图 2),与预期吻
合 。连接到 pGEM-T-Easy-vector载体上后 , PCR验证大小为 710 bp左右;阳性克隆测序结果证实所扩
增的条带为 BcMF4基因片段。
M 为 M arker;A 、B为 DNA 片段
图 1 紫菜薹基因组 DNA 电泳图
Figure 1 Electrophoresis of purple cai-tai genome DNA
M 为 Marker;A 为扩增的 B cMF4片段
图 2 BcMF4 基因 PCR扩增产物电泳图
Figure 2 Electrophoresis of BcMF4 fragment
of PCR amplification
2.2 RNAi表达载体的获得
经过两轮 PCR反应获得带有 aBt t位点的目的基因 BcMF4基因片段 ,然后在 BP Clonase 作用下 ,与
·45·第 7 卷 第 4 期:农学 刘乐承等:紫菜薹 BcMF4基因的克隆及其 RNAi植物表达载体的构建
M 为M ark er;A 、B为 PCR扩增片段
图 3 RNAi表达载体的 PCR检测电泳图
Figure 3 Electrophoresis of RNAi expression
vector by PCR detection
载体 pHGRV上的 at tP位点发生重组 ,将目的基因片段整
合到 pHGRV上 ,最终获得了带有反向重组 BcMF4基因的
RNAi植物表达载体(图 3)。
3 讨论
芸薹属作物是杂种优势利用最为普遍的一类作物 ,而雄
性不育系是白菜类等芸薹属作物杂种优势利用的最理想方
式 ,因而其雄性不育的选育及其应用基础的研究深受人们重
视 。随着分子生物学实验手段日臻完善 ,从分子水平上阐明
芸薹属植物雄性不育的机理已成为可能 。从雄性不育的遗
传基础着手 ,了解花粉发育相关的基因以及抑制花粉发育的
基因 ,是揭示雄性不育产生的机理的有效途径 。但迄今为
止 ,从芸薹属植物中分离的花粉 、花药特异表达基因为数不
太多 ,且多数基因功能尚不清楚 。从普通白菜核雄性不育两
用系中成功分离得到雄性不育相关的隐性基因 BcMF4后 ,已经从十字花科植物 11个物种中克隆出了同
源基因 ,而且已经证明 ,在拟南芥 、菜心中与花粉发育有着密切关系[ 3 , 4] 。本研究从紫菜薹克隆出了
BcMF4基因的同源片段 ,为下一步研究奠定了基础 。当然 ,还需通过 RACE 等方法克隆出 BcMF4基因
的全序列 ,以进一步证实所克隆片段的正确性。
RNAi现象普遍存在于植物和动物中 ,这一现象一经发现马上就引起了人们的高度重视 ,并迅速发展
成为一种强大的“基因沉默”技术 ,广泛应用于各种生物的基因功能鉴定和功能基因表达调控领域[ 11] 。
RNAi的关键在于表达载体的构建。但是 ,以往 RNAi植物表达载体的构建十分繁琐 ,耗时费钱[ 3 , 4] 。本
研究采用Gatew ay 技术 ,不再需要使用限制性内切酶和连接酶 ,操作简便 ,反应条件易于控制 ,阳性克隆
通过 PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳即可检测 ,获得的表达载体能直接用于农杆菌介导的植物转化 ,从而为
下一步通过沉默 BcMF4基因 ,明确其对紫菜薹花粉发育和雄性不育的影响奠定了基础 。
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·46· 长江大学学报(自然科学版) 2010年 12 月
(PNR)
041 Effects of Starvation on Energy and Substance Consumption in Oreochromis aureus ×O.
niloticus
CHAI Yi ,LUO Jing-bo
ZHANG Yuan-jiong Col lege o f Anima l Science ,Yang tz e Universi ty , J in gzhou , Hubei 434025 , China
Abstract:The metabolic course of energ y substance in the muscle during s tarvation peri-
od was s tudied.Samples were picked up in the 1st , 4th , 8th , 16th , 24th , 32nd , 40th , 48th
day during starvation period and the chemical composition(moisture , lipid , protein and
ash)in the whole fish and the muscle w ere detected.The results showed that content of
moisture and ash decreased , while the content of lipid and pro tein increased.During the
starvation period , the pro tein compostion in the muscle decreased from 18.82% to
16.42%.The rate of protein consumption was -12.66.T he lipid compo sion in the mus-
cle decreased f rom 1.79% to 1.03%while the rate of lipid comsumption was -44.62.
At the sametime , the protein compostion in the who le fish decreased f rom 17.43% to
15.85%.And the rate of protein consumption was -9.84 while the lipid compositon in
the whole fish decreased from 2.98% to 2.11%.The rate of lipid consumption was -
31.05.
Key words:Oreochromis aureus ×O.niloticus;s tarvatio n;material consumption
044 Cloning of BcMF4 Gene from Purple Cai-tai(Brassica campestris ssp.chinensis var.pur-
puraria)and Construction of Its RNAi Plant Expression Vector
LIU Le-cheng ,LINXiao-fang (Col lege o f Horticulture and Gardening ,Y angtze Universi ty ,J ingzhou , H ubei 434025 , China)
Abstract:According to the sequence of the gene BcMF4 , which is related w ith the male
sterility of common Chinese cabbage-pak-choi (Brassica campestris ssp.chinensis , syn.
B.rapa ssp.chinensis), a pair of special primers w ere desig ned , and then a 710 bp gene
segment w as cloned f rom purple Cai-tai (B.campestr is ssp.chinensis var.purpurar ia).
U sing Gateway technology , a RNAi (RNA interference)plant ex pressio n vector of Bc-
MF4 gene was constructed.The s tudy has laid the groundwo rk for understanding the in-
fluence of BcMF4 gene on the pollen development and male sterility of purple Cai-tai by
silencing this gene.
Key words:purple Cai-tai(Brassica campestris ssp.chinensis var.purpurar ia);BcMF4;
clone;RNAi(RNA interference);expression vector
047 Effects of Phosphate Availability on Root System Architecture and Allometric Growth of
Solanum pseudocapsicum Seedlings
WU Chu , HE Kai-ping ,WU Li-shuang Col lege o f Hort icul tur e and Garden ing , Yang tz e Univer sity ,
J in gzhou , Hubei 434025 , China
Abstract:Sand culture was used to investig ate the effects of low phosphate availability on
root system architecture and allometry of Solanum pseudocapsicum seedling s.The re-
sults showed that topological indexes increased as the phosphate concentrations in-
creased , suggesting the roo t sy stem architectures of these seedlings under low phosphate
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