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ＲP － HPLC法同时测定旱柳叶药材中 3 个主要黄酮苷成分的含量
左飞鸿1，2，吴国江2，李进进1，周国平2，付辉政2* ，郭文2
(1．江西国药有限责任公司，南昌 330052;2．江西省食品药品检验所，南昌 330046)
摘要 目的:建立同时测定旱柳叶药材中木犀草苷、芹菜素 －7 －O － β －D －吡喃葡萄糖醛酸苷和木犀草素 － 3 －甲醚 － 7 － O －
β －D －吡喃葡萄糖醛酸苷含量的高效液相色谱法。方法:采用 YMC － Pack ODS － A(150 mm ×4. 6 mm，5 μm)色谱柱，以乙腈
－0. 2%磷酸溶液(15∶ 85)为流动相，流速 1. 0 mL·min －1，检测波长 344 nm。结果:木犀草苷，芹菜素 － 7 － O － β － D －吡喃葡
萄糖醛酸苷和木犀草素 － 3 －甲醚 － 7 － O － β － D －吡喃葡萄糖醛酸苷进样量分别在 0. 26 ～ 2. 08 μg(r = 0. 9999)、0. 30 ～
2. 40 μg(r = 0. 9999)和 0. 62 ～ 4. 96 μg (r = 0. 9999)范围内与峰面积呈良好线性关系;平均回收率(n = 6)分别为 97. 5%、
98. 8%和 101. 5%，ＲSD分别为 1. 7%、1. 7%和 1. 6%。结论:经方法学验证，本法可用于旱柳叶药材的质量控制。
关键词:旱柳叶;木犀草苷;芹菜素 －吡喃葡萄糖醛酸苷;木犀草素 －甲醚 －吡喃葡萄糖醛酸苷;反相高效液相色谱法;方法学
验证;中药材质量控制
中图分类号:Ｒ917 文献标识码:A 文章编号:0254 － 1793(2014)05 － 0903 － 04
ＲP － HPLC simultaneous determination of three main flavonoid
glycoside components in Hankow Willow Leaf
ZUO Fei － hong1，2，WU Guo － jiang2，LI Jin － jin1，ZHOU Guo － ping2，
FU Hui － zheng2* ，GUO Wen2
(1． Jiangxi Guoyao Co．，Ltd，Nanchang 330052，China;2． Jiangxi Provincial Institute for Drug and Food Control，Nanchang 330046，China)
Abstract Objective:To establish a method for the simultaneous determination of the contents of luteolin － 7 －
O － β － D － glucoside，apigenin － 7 － O － β － D － pyranglycuronide and lutelion － 3 － methylether － 7 － O － β －
D － pyranglycuronide in Hankow Willow Leaf by HPLC．Methods:The separation was performed on a YMC － Pack
ODS － A column (150 mm ×4. 6 mm，5 μm)with a mobile phase of acetonitrile － 0. 2% phosphoric acid solution
(15∶ 85)． The flow rate was 1. 0 mL·min －1，and the detecting wavelength was 344 nm． Ｒesults:The linear ranges
of luteolin － 7 － O － β － D － glucoside，apigenin － 7 － O － β － D － pyranglycuronide and lutelion －3 －methylether －
7 －O － β － D － pyranglycuronide were 0. 26 － 2. 08 μg (r = 0. 9999) ，0. 30 － 2. 40 μg (r = 0. 9999)and 0. 62 －
4. 96 μg (r = 0. 9999) ，respectively． The average recoveries (n = 6)were 97. 5% (ＲSD = 1. 7%) ，98. 8%
(ＲSD =1. 7%)and 101. 5% (ＲSD =1. 6%) ，respectively． Conclusion:Based on method validation，the method
can be used for quality control of the leaves of Salix matsudana Koidz．
Key words:the leaves of Salix matsudana Koidz．;mignonette glycosides;luteolin － glucoside;apigenin － pyrangly-
curonide;luteion － methylether － pyranglycuronide;ＲP － HPLC;method validation;quality control for traditional
Chinese medicine
旱柳叶为杨柳科(Salicaceae)植物旱柳(Salix
matsudana Koidz．)的干燥叶，性寒、味苦。具有祛风
除湿、清热利胆之功效。用于风湿痹痛、盘筋拘挛、
湿热黄疸、身目发黄、小便短赤等症［1］。民间长期食
用旱柳叶以清热、利胆和明目［2］。旱柳叶的主要成分
为黄酮苷类化合物［3 － 4］，如木犀草苷、木犀草素 － 7 －
O － β －D －吡喃葡萄糖醛酸苷、木犀草素 － 3 －甲
醚 － 7 － O － β － D －吡喃葡萄糖醛酸苷、杨梅酮、芹
菜素 － 3 －甲醚 － 7 － O － β － D －吡喃葡萄糖苷等。
文献报道，许传莲等［5］对柳属植物大黄柳叶中的
—309—药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2014，34(5)
DOI:10.16155/j.0254-1793.2014.05.006
Diosmetin 7 － O － α － L －吡喃阿拉伯糖(1→6)－
β － D －吡喃葡萄糖苷进行了含量测定;赵厚民等［6］
采用 ＲP －HPLC法对柳属植物柳枝皮药材中水杨苷
的含量进行了测定。韩立芹等［7］采用 ＲP － HPLC
法，用 Nucleosil C18(250 mm ×4. 6 mm，5 μm)色谱柱，
乙腈 －水为流动相，运用梯度洗脱的方法同时测定了
旱柳叶中 3 个黄酮类成分及水杨苷的含量。旱柳叶
收载于 1996年版《江西省中药材标准》，该标准项下
没有含量测定项［1］。作者对旱柳叶水提物化学成分
进行了系统的研究，从旱柳叶药材中分离出黄酮苷类
的 3个主要成分木犀草苷、芹菜素 － 7 － O － β － D －
吡喃葡萄糖醛酸苷和木犀草素 － 3 －甲醚 － 7 － O －
β －D －吡喃葡萄糖醛酸苷。文献报道这 3 个成分具
有多种药理活性［8 － 11］。目前尚未有同时测定旱柳
叶药材中上述 3 个成分的文献报道。并且旱柳叶药
材也是《江西省中药材标准》2015 年版起草品种。
因此，本实验采用反相高效液相色谱法同时测定了
旱柳叶药材中主要成分木犀草苷、芹菜素 － 7 － O －
β － D －吡喃葡萄糖醛酸苷和木犀草素 － 3 －甲醚 －
7 － O － β － D －吡喃葡萄糖醛酸苷的含量，经方法学
考察试验，表明该方法专属性强，准确可行，重现性
好，准确度高，可作为旱柳叶药材的质量控制方法。
1 仪器与试药
Aglient Technologies 1260 高效液相色谱仪(包
括 G1311C四元泵、G4212B DAD、G1329B 自动进样
器、G1316A柱温箱、LC1260 色谱工作站) (美国安
捷伦科技有限公司) ;Sartoris BS110S 十万分之一天
平;电热恒温水浴锅(上海跃进医疗器械厂)。
乙腈为色谱纯，水为娃哈哈饮用纯净水，其他试
剂均为分析纯。
木犀草苷对照品(批号 111720 － 200604)购自
中国食品药品检定研究院;芹菜素 － 7 － O － β － D －
吡喃葡萄糖醛酸苷和木犀草素 － 3 －甲醚 － 7 － O －
β － D －吡喃葡萄糖醛酸苷对照品为本实验室自制，
通过1 H － NMＲ、13 C － NMＲ、MS 等手段确证了它们
的结构，纯度经 HPLC 检测大于 98%(面积归一法
测得) ;旱柳叶药材购自安徽淮南，由江西省食品药
品检验所袁贵平主任中药师鉴定为杨柳科植物旱柳
Salix matsudana Koidz． 的叶，标本存于江西省食品
药品检验所科研室。
2 方法与结果
2. 1 色谱条件 色谱柱:YMC － Pack ODS － A
(150 mm ×4. 6 mm，5 μm) ;流动相:乙腈 － 0. 2%磷
酸溶液(15 ∶ 85) ;流速:1. 0 mL·min －1;检测波长:
344 nm;柱温:25 ℃;进样量:10 μL。
在上述色谱条件下，旱柳叶中木犀草苷、芹菜
素 － 7 － O － β － D － 吡喃葡萄糖醛酸苷和木犀草
素 － 3 －甲醚 － 7 － O － β － D －吡喃葡萄糖醛酸苷
与其他组分的色谱峰分离度良好。色谱图见图 1。
图 1 混合对照品(A)和旱柳叶药材样品(B)高效液相色谱图
Fig 1 HPLC chromatograms of mixed reference substances(A)and the
leaves of Salix matsudana sample(B)
1．木犀草苷(luteolin － 7 － O － β － D － glucopyranside) 2． 芹菜素 －
7 － O － β － D －吡喃葡萄糖醛酸苷(apigenin － 7 － O － β － D － pyran-
glycuronide) 3．木犀草素 － 3 －甲醚 － 7 － O － β － D －吡喃葡萄糖
醛酸苷(lutelion － 3 － methylether － 7 － O － β － D － pyranglycuronide)
2. 2 对照品溶液的制备 精密称取木犀草苷、芹菜
素 －7 － O － β － D －吡喃葡萄糖醛酸苷和木犀草素
－3 －甲醚 －7 －O － β － D －吡喃葡萄糖醛酸苷的对
照品适量，分别置 10 mL 量瓶中，加 70%甲醇溶液
溶解并定容，摇匀，分别得木犀草苷(0. 14 mg·
mL －1)、芹菜素 － 7 － O － β － D －吡喃葡萄糖醛酸苷
(0. 16 mg·mL －1)和木犀草素 － 3 －甲醚 － 7 － O －
β － D －吡喃葡萄糖醛酸苷(0. 30 mg·mL －1)的单
一成分对照品溶液。
2. 3 供试品溶液的制备 取旱柳叶粉末(过 4 号
筛)约 1. 0 g，精密称定，置 50 mL 锥形瓶中，精密加
入 70%甲醇溶液 50 mL，摇匀，称定重量，回流提取
1 h，取出放冷，称重，用 70%甲醇溶液补足减失重
量，摇匀，过滤，精密量取滤液 25 mL于蒸发皿中，蒸
干溶剂，残渣用 70%甲醇溶液使溶解，置于 5 mL 量
瓶中，定容至刻度，摇匀，即得。
2. 4 线性关系考察 精密称取木犀草苷、芹菜
素 － 7 － O － β － D － 吡喃葡萄糖醛酸苷和木犀草
素 － 3 －甲醚 － 7 － O － β － D －吡喃葡萄糖醛酸苷
的对照品适量，分别用 70%甲醇溶液溶解并稀释
制成每1 mL含木犀草苷 0. 26 mg、芹菜素 － 7 －
O － β － D －吡喃葡萄糖醛酸苷 0. 30 mg 和木犀草
—409— 药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2014，34(5)
素 － 3 －甲醚 － 7 － O － β － D －吡喃葡萄糖醛酸苷
0. 62 mg的对照品储备液，精密吸取各对照品储备
液均 1、2、4、6、8 mL，分别置于 10 mL 量瓶中，用
70%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，即得单一成分的
系列对照品溶液。分别精密吸取 10 μL 注入高效
液相色谱仪，按“2. 1”项色谱条件进样分析，以进
样量 X(μg)为横坐标，峰面积 Y 为纵坐标，绘制标
准曲线。结果表明:木犀草苷、木犀草素 － 7 － O －
β － D －吡喃葡萄糖醛酸苷和木犀草素 － 3 －甲醚 －
7 － O － β － D － 吡喃葡萄糖醛酸苷进样量分别在
0. 26 ～ 2. 08、0. 30 ～ 2. 40 和 0. 62 ～ 4. 96 μg 范围内
与峰面积呈良好线性关系，回归方程分别为:
Y = 1. 023 × 10 －3X － 8. 756 r = 0. 9999
Y = 6. 955 × 10 －2X + 1. 452 r = 0. 9999
Y = 1. 045 × 10 －3X + 18. 26 r = 0. 9999
2. 5 精密度试验 精密吸取供试品溶液 10 μL，在
“2. 1”项色谱条件下连续进样 6 次，测定峰面积。
结果木犀草苷、芹菜素 － 7 － O － β － D －吡喃葡萄糖
醛酸苷和木犀草素 － 3 －甲醚 － 7 － O － β － D －吡
喃葡萄糖醛酸苷峰面积的 ＲSD(n = 6)分别为
0. 31%、1. 1%、0. 60%。
2. 6 稳定性试验 精密吸取供试品溶液 10 μL，于
配制后 0、1、3、7、12、24 h进样测定，测得木犀草苷、
芹菜素 － 7 － O － β － D －吡喃葡萄糖醛酸苷和木犀
草素 － 3 －甲醚 － 7 － O － β － D －吡喃葡萄糖醛酸
苷峰面积 ＲSD(n = 6)分别为 0. 55%、0. 87%、
0. 55%，说明供试品溶液在 24 h内稳定。
2. 7 重复性试验 取同一批旱柳叶粉末(过 4 号
筛)6 份，每份约 1. 0 g，精密称定，按“2. 3”项下方法
制备供试品溶液，在“2. 1”项色谱条件下进行分析
测定，木犀草苷、芹菜素 － 7 － O － β － D －吡喃葡萄
糖醛酸苷及木犀草素 － 3 －甲醚 － 7 － O － β － D －
吡喃葡萄糖醛酸苷的含量的平均值(n = 6)分别为
0. 9186、0. 6458、0. 8344 mg · g －1，ＲSD 分别为
1. 5%、1. 9%、1. 3%。
2. 8 回收率试验 取已知含量的旱柳叶药材粉末
(过 4 号筛)6 份，每份约 0. 5 g，每份精密加入含木
犀草苷 0. 0092 mg·mL －1，芹菜素 － 7 － O － β － D －
吡喃葡萄糖醛酸苷 0. 0068 mg·mL －1和木犀草素 －
3 － 甲醚 － 7 － O － β － D － 吡喃葡萄糖醛酸苷
0. 0084 mg·mL －1的对照品混合溶液(精密称取木
犀草苷 4. 60 mg，芹菜素 － 7 － O － β － D －吡喃葡萄
糖醛酸苷 3. 40 mg，木犀草素 － 3 －甲醚 － 7 － O －
β － D －吡喃葡萄糖醛酸苷 4. 20 mg，置于 500 mL量
瓶中，加 70%甲醇溶液溶解并定容，即得)50 mL，按
“2. 3”项下方法制备供试溶液，在“2. 1”项色谱条件
下进行分析测定，计算回收率。结果木犀草苷，芹菜
素 －7 －O － β －D －吡喃葡萄糖醛酸苷和木犀草素 －
3 －甲醚 － 7 － O － β － D －吡喃葡萄糖醛酸苷的平
均回收率(n = 6)分别为 97. 5%、98. 8%、101. 5%，
ＲSD分别为 1. 7%、1. 7%、1. 6%。
2. 9 耐用性试验 取同一批旱柳叶药材粉末(过 4
号筛)约 1. 0 g，精密称定，按“2. 3”项下方法制备供
试品溶液，分别用 Diamonsil C18(150 mm × 4. 6 mm，
5 μm)、Agilent Eclipse XDB － C18(150 mm × 4. 6
mm，5 μm)、YMC － Pack ODS － A(150 mm × 4. 6
mm，5 μm)3 种品牌的色谱柱按正文中的色谱条件
对其进行测定，结果无明显差别。
2. 10 样品测定 分别取不同产地的旱柳叶药材，
每个样品取 3 份，按“2. 3”项下方法制备供试品溶
液。精密吸取供试品溶液及“2. 2”项下的对照品溶
液各 10 μL，在“2. 1”项色谱条件下进样分析，测定
峰面积，用外标法计算出木犀草苷、芹菜素 － 7 －
O － β － D －吡喃葡萄糖醛酸苷和木犀草素 － 3 －甲
醚 － 7 － O － β － D －吡喃葡萄糖醛酸苷的含量，测定
结果见表 1。
表 1 旱柳叶药材中 3 个黄酮苷类化合物的含量(mg·g －1，n =3)
Tab 1 The contents of three flavonoid glycoside compounds in the leaves of Salix matsudana
编号
(No．)
来源
(source)
木犀草苷
(luteolin － 7 － O － β － D －
glucopyranside)
芹菜素 －7 － O － β － D －
吡喃葡萄糖醛酸苷
(apigenin － 7 － O － β － D －
pyranglycuronide)
木犀草素 －3 －甲醚 －7 － O －
β － D －吡喃葡萄糖醛酸苷
(lutelion － 3 － methylether － 7 － O －
β － D － pyranglycuronide)
1 天津(Tianjin) 1. 047 1. 420 3. 195
2 浙江杭州(Hangzhou，Zhejiang) 0. 047 0. 077 0. 199
3 山东临沂(Linyi，Shandong) 0. 989 1. 361 2. 858
4 河北安国(Anguo，Hebei) 1. 025 1. 357 2. 981
5 江西樟树(Zhangshu，Jiangxi) 0. 210 0. 344 0. 563
6 安徽淮南(Huainan，Anhui) 0. 886 0. 638 0. 866
—509—药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2014，34(5)
3 讨论
3. 1 提取方式的选择 考察了加热回流法和超声
提取法 2 种方法对木犀草苷、芹菜素 － 7 － O － β －
D －吡喃葡萄糖醛酸苷和木犀草素 － 3 －甲醚 － 7 －
O － β － D －吡喃葡萄糖醛酸苷含量测定的影响，结
果表明，加热回流提取法提取更完全，故选择回流提
取法;提取溶剂考察了水、50%甲醇溶液、70%甲醇
溶液、甲醇 4 个浓度，结果表明，70%甲醇溶液提取
效率最高，故选择 70%甲醇溶液为提取溶剂;提取
时间考察了 30、60、90 min，结果表明 60 min 可提取
完全，故提取时间定为 60 min。
3. 2 检测波长的选择 木犀草苷在 252、266 和
347 nm波长处有最大吸收，芹菜素 － 7 － O － β －
D －吡喃葡萄糖醛酸苷在 265 和 337 nm 波长处有
最大吸收，木犀草素 － 3 －甲醚 － 7 － O － β － D －吡
喃葡萄糖醛酸苷在 250、266 和 344 nm 波长有最大
吸收，考虑到在短波长处样品中其他组分的干扰较
大，故选择 344 nm作为检测波长，结果选择性好，灵
敏度高。
3. 3 流动相的选择及优化 考察了甲醇 －水、甲醇 －
0. 2%磷酸溶液、乙腈 － 0. 2%磷酸溶液 3 个溶剂系
统。结果表明，以乙腈 － 0. 2%磷酸溶液为流动相，
所得色谱峰峰形较好，分离效果最佳。在对峰 2 进
行对照品研究时，发现使用流动相乙腈 － 0. 2%磷酸
溶液，在时间较短的情况下峰 2 中包含了 1 个杂峰，
影响了峰 2 的纯度。为了保证峰 2 的准确性，同时
又能使色谱图中的 3 个主要成分完全达到基线分
离，优化为文中的最佳色谱条件;虽然峰 2 和峰 3 的
基部峰宽较大，但峰 2 和峰 3 的理论塔板数均超过
4000，分别达到 5500 和 8000。
3. 4 指标成分选择 在对色谱图中保留时间约 23
min的峰进行对照品制备时，发现该化合物不稳定，
所以未将该峰作为指标成分同时进行测定。
3. 5 小结 本文建立的反相高效液相色谱法同时
测定旱柳叶中 3 个主要黄酮苷类成分的含量，样品
前处理简单，方法简便、准确，重复性好，准确度高，
可作为旱柳叶药材的质量控制方法。
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(本文于 2013 年 8 月 19 日收到)
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