全 文 ：·综述与专论· 2012年第8期
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
收稿日期 : 2011-12-06
基金项目 : 国家自然科学基金项目（30970055）
作者简介 : 林艳 , 女 , 硕士研究生 , 研究方向 : 真核基因表达调控 ; E-mail: linyan841014@163.com
通讯作者 : 王天云 , 男 , 博士 , 硕士生导师 , 研究方向 : 真核基因表达调控 ; E-mail: wty@xxmu.edu.cn
MAR介导的非病毒附着体载体的研究进展
林艳1 李照熙2 王芳1 王天云1
（1 新乡医学院生物化学与分子生物学教研室，新乡 453003 ；2 新乡医学院生命科学技术系，新乡 453003）
摘 要： 附着体载体可以使外源基因在宿主细胞中不整合到基因组上而是以附着体的形式存在，是一种新型的高效、安全、
附着体表达载体。目前研究较多的是由 S/MAR（Scaffold/Matrix Attachment Region，S/MAR）元件介导的质粒。虽然此类载体均能介
导载体附着存在，但是转基因的表达量不同。最近研究发现，载体的启动子、骨架结构、CpG基序以及表达系统等方面能够影响
转基因的表达，针对以上内容作一综述，希望据此进一步优化载体，为临床研究提供基础依据。
关键词： 核基质附着区 转基因表达 附着体载体 启动子 骨架结构 CpG基序
Research Progress of the Matrix Attachment Mediated Nonvirus
Episomal Vector
Lin Yan1 Li Zhaoxi2 Wang Fang1 Wang Tianyun1
（1Department of Biochemistry and Molecular Biology，Xinxiang Medical University，Xinxiang 453003；2Department of Life Science and
Technology，Xinxiang Medical University，Xinxiang 453003）
Abstract: The new type of episomal expression vectors can make transgene expression efficient, continuous, and safety, which do not
integrate into the genomes and exist in form of episome in host cells. Currently, more researches focus on episomal vectors which are mediated
by scaffold/matrix attachment region components. Though episomal vectors exist in form of episome, there are many differents in the terms
of transgene expression. It was found that many factors were affected on transgene expression based on the recent researches, for example,
the promoter, the skeleton structure, CpG sequence of the vector, and the express system. Here the development of MAR madiated transgene
expression was reviewed. According to it, it is better to optimize the vector furtherly and provide the basis for clinical researches.
Key words: Matrix attachment region Transgene expression Episomal vector Promoter Skeleton structure CpG sequence
在基因治疗的过程中，随着基因转染技术的成
熟，基因表达载体是最关键的技术之一。由于病毒
载体存在潜在的免疫原性、病理损害和致癌性，需
要研究新型附着体载体替代传统的转基因载体［1-3］。
最近 10 年来，研发了一种 S/MAR（Scaffold/Matrix
Attachment Region，S/MAR）介导的非病毒附着型载
体。核基质附着区（matrix attachment region，MAR）
又称为核骨架附着区（scaffold attachment region，
SAR）序列是限制酶消化后仍附着在核基质上的
DNA 序列，长度约为 200-2 000 bp ；MAR 富含 AT
碱基对（> 70%）［4-7］。MAR 元件在游离表达载体
中具有三个功能性的特点，能够介导载体附着于染
色体外存在，克服转基因表达的沉默和使载体在有
丝分裂中保持稳定［8， 9］，但是 S/MAR 对于转基因表
达的调控的分子机制和对转录的控制还处于探索阶
段［10， 11］。本文就附着体载体的启动子、表达系统、
骨架载体、CpG 基序等影响转基因表达因素的最新
进展作一综述，旨在为进一步研究提供帮助。
1 影响 S/MAR介导的非病毒附着载体转基
因表达的因素
1.1 启动子
Argyros 等［12］研究发现，不同的启动子介导
2012年第8期 47林艳等 ：MAR 介导的非病毒附着体载体的研究进展
的 MAR 非病毒附着体载体的转基因表达水平不同。
相同条件下向鼠肝内转染含不同启动子的 S/MAR
元件介导的附着体质粒，发现肝特异性 AAT（a1-
antitrypsin，AAT）启动子介导的 pAAT-S/MAR 载体
能够持续高效表达转基因，而 CMV（chicken-β-actin，
CMV）启动子介导的 pCMV-S/MAR 载体的表达水平
却没有提高，表明 MAR 序列与哺乳动物组织特异
性的启动子结合能提高转基因的表达水平。研究还
发现使用 MAR 元件时，AAT 启动子的富含 CpG 区
未甲基化，说明 MAR 能够抑制 AAT 启动子的甲基
化作用。Argyros 等［13］在 S/MAR 微环载体也有类似
的发现，UbC 和 AAT 启动子分别介导的 mini-UbC-
S/MAR 和 mini-AAT-S/MAR 载体转染鼠肝内一周后，
与不含 MAR 序列的对照质粒相比，转基因表达量都
增加接近 10 倍，说明 MAR 序列能提高转基因的表
达水平。但是 92 d 后，mini-AAT-S/MAR 基因表达
水平是转染 24 h 后表达水平的 5 倍，但 mini-UbC-
S/MAR 载体仅为 3 倍。由此可见，MAR 序列与组织
特异性启动子结合能够增加转基因表达。
2010 年，Heace 等［14］将 pEPito 载体转染人胚
胎肾细胞（HEK293）32 d 后，与对照 PEPI 载体相比，
pEPito 系列载体均较高水平持续表达荧光素酶基因，
但是含 hCMV-EF1α 启动子的 pEPito 载体荧光素酶
基因的表达是含 CMV 启动子的 6 倍，同样说明转
基因的表达受启动子的影响。在体内研究中同样发
现转基因的持续表达取决于 MAR 元件和启动子的
选择。2009 年，Iqbal 等［15］ 报道 SV40-EGFP-MAR
微环载体转染牛受精卵后，71.4% 囊胚表达增强的
绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescence protein，
EGFP）基因，用 CMV 替代 SV40 启动子后，仅有
23% 囊胚发现荧光，也证实启动子选择对基因表达
的影响。
体内和体外研究共同表明 SMAR 介导的附着体
载体选择的启动子不同，最终导致转基因的表达水
平不同。
1.2 表达系统
含 MAR 序列的附着体载体转染的细胞系统
有 ：中国仓鼠卵巢细胞（CHO）、鼠胚胎成纤维细胞
（IMEF）、小鼠成纤维细胞（NIH3T3）、人胚胎肾细
胞（HEK293）、人造血祖细胞、鼠淋巴瘤细胞（MEL）
等［4， 14， 16-18］，机体组织器官有脑、肌肉、眼睛、肝、
新生鼠和猪体内等［19-22］。对体内外研究的转基因表
达水平分析发现，同种质粒同条件转染不同的宿主
细胞，虽都以低拷贝数存在，但是转基因的表达量
有所差异。例如，Tessadori 等［16］将 pEPI-EGFP 载
体转染 IMEF 细胞和 CHO 细胞，发现 IMEF 细胞中
EGFP 基因的表达水平均高于同条件下的 CHO 细胞，
说明转基因的表达受到宿主细胞体内各种导致基因
沉默程序的影响［17］。研究还发现，组蛋白的去甲
基化和乙酰化能提高载体中 EGFP 基因的表达水平，
宿主和 pEPI-eGFP 载体引起的染色质型态的变化能
够诱导附着体基因的变化，进一步证实附着体基因
容易受宿主控制系统的影响且作用于附着体基因的
调控机制与宿主基因的机制相似［16， 23］。
1.3 骨架载体
1999 年，Piechaczek 等［9］用人类的 5β 干扰素
上的 MAR 序列代替 SV40 编码的大 T 抗原，成功
构建基于 huIFNβ-MAR 的载体 pEPI，这是第一个
完全由哺乳动物序列构造的非病毒自主复制子，代
表了研究复制和转录的表观遗传调控的最小模型系
统［9］（图 1-A）。荧光原位杂交（fluorescence in situ
hybridization，FISH）分析表明，pEPI-1 载体在有丝
分裂期附着于宿主染色体外，以低拷贝数（5-10 个
拷贝 / 细胞）存在，目前并没有发现特定的附着位
点（图 1-B，图 1-C）。但 pEPI 载体有许多不足之处，
如转基因沉默和较低的稳定克隆形成率等。
2006 年，Nehlsen 等［24］ 首次尝试利用 Flp 重
组酶除去骨架结构中的细菌序列，形成了第一代的
MAR 微环载体。SV40 介导的 MAR 微环载体转染
CHO-K1 细胞，缺失 G418 抗性筛选后至少 55 d 能
够持续表达 EGFP 基因，与最初的 pEPI 载体相比
有较大的进步。Broll 等［25］在此基础上，将长度为
2 200 bp 的 MAR 序列减少到约为 700 bp，形成新的
S/MAR 微环载体 M18。M18 载体、第一代 MAR 微
环载体和 pEPI 载体同时转染 CHO-K1 细胞 20 d 后，
转基因的表达量分别是 58%、53% 和 38%，说明减
少 MAR 序列和除去细菌序列能够提高转基因表达水
平。Haase 等［14］在 2010 年用 Cre 重组酶形成最新
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第8期48
一代的 S/MAR 微环载体。mini-UbC-S/MAR 和 mini-
AAT-S/MAR 介导的载体转染鼠肝内一周后，基因表
达量与不含 MAR 序列相比增加近 10 倍。很明显，
除去质粒骨架中的细菌序列在荧光素酶基因稳定表
达中起着重要的作用。
2010 年，Haase 等［14］构建一个新载体 pEPito
载体。与 pEPI 载体相比，骨架结构最大的区别是没
有 SV40 O/P 转录单元，仅有 37 个 CpG 基序。结果
显示，转染 HEK293 细胞 32 d 后，不同启动子（CMV
和 hCMV-EF1a）介导的 pEPito 载体都比 pEPI 载体
表现出较高的荧光素酶表达水平。pEPito 载体之所
以延长转基因表达时间，除了 MAR 序列可能使载
体分子转录到活性染色质位点而增强整个转录水平
外，改良的细菌骨架结构减少外因导致的沉默也起
到了重要的作用。这种骨架减少与大量 CpG 基序的
pEPito 载体和微环载体以及无 CpG 基序的载体基因
表达的状况相似。
Lufino 等［26］用细菌人工染色体，即 iBAC 构建
总长度为 156 kb 的 iBAC-S/MAR-LDLR 载体。携带
HSV-1 扩增子的载体能完整转染到 CHO 细胞中并获
得两个独立的克隆细胞株用于后续的试验。在两个
稳定克隆细胞株中发现新重构载体能够调节缺陷型
低密度脂蛋白受体（low density lipoprotein receptor，
LDLR）的表达水平到生理水平，这是 MAR 介导的
非病毒载体第一次应用到具体的疾病中。
在快分化细胞中，如部分肝切术后的肝细胞或
者造血祖细胞中［18， 19］，质粒在复制的过程中会丢
失，但是在慢分化组织如脑、肌肉等，附着载体似
乎具有无限制的能力［21， 27］，所以需进一步优化载体
才能有效地诱导和调节基因表达。Rupprecht 等［28］
2010 年报道一种基于四环素诱导表达系统（Tet-
off/Tet-on 系统）的可诱导载体。诱导系统加入新霉
素后，利用 MAR 元件的部分序列，四环素应答元
件（tetracycline response element，TRE） 和 CMV 启
动子融合激活转录因子并反式表达，除去新霉素后
载体从细胞中丢失。通过添加和去除过新霉素进行
调节 pEPI-Tet-On 转染细胞中的 EGFP 表达水平，流
式细胞仪检测细胞的荧光表达水平显示，除去新霉
素以后，转染细胞的荧光细胞数目减少到 10%，荧
光水平减少到 2.5%，重新诱导试验再次证实了这一
结果。同样，在鼠肝内转染相同的 pEPI-Tet-On 系统，
qPCR和Western印记显示转基因表达水平增加5倍。
但是新霉素注入到鼠体内，在抗生素缺失的条件下
转基因表达水平低下，表明有必要进一步提高载体
的功能。
自第一代 S/MAR 介导的附着体载体 pEPI 被证
实后，许多研究是在此基础上进行了相应的改进，
插入调控元件或者减少细菌序列，在一定程度上弥
补了该载体的不足。但与临床的实际应用还存在较
大差距，需要进一步完善。
1.4 CpG基序
Haase 等［14］减少 pEPito 载体的 CpG 基序，结
果发现 CpG 基序减少的 pEPito 系列载体在转基因表
达水平上要优于 pEPI 载体。因为 CpG 甲基化能够
A. pEPI-1 载体图谱 ；B. 荧光原位杂交（FISH）分析显示， pEPI-1 载体在有丝分裂期附着宿主染色体外，以低拷贝数（5 个拷
贝 / 细胞）存在 ；C. FISH 结果显示 pEPI-1 载体在间期核内以 10 个低拷贝数存在（按照文献［6］稍作修改）
图 1 MAR元件介导的非病毒附着载体 pEPI-1
2012年第8期 49林艳等 ：MAR 介导的非病毒附着体载体的研究进展
抑制基因的表达，减少 CpG 基序从而可能减少后因
造成的转基因沉默，而且无 CPG 的质粒，不仅能延
长转基因的时间，还没有或仅有微弱的负作用［14］。
Ferber 等［29］将携带 PDX1、NGN3 和 MAFA 基
因的 CpG 减少的 S/MAR 质粒和 pEPI 质粒同时转染
到鼠肝内，通过测量胰岛素 2 的产生量作为肝细胞
转移分化的标记。一周后，CpG 减少的 S/MA 质粒
是正常胰腺表达量的 4.2%，远远高于 pEPI 质粒的
0.11%，说明减少 CpG 基序在基因表达中的显著的
积极作用。
总之，由于 CpG 甲基化能够抑制表达，减少
pDNA 系统中的 CPG 基序能够增强转基因的表达。
同样有报道证实 CpG 岛能够降低基因的表达水平，
最终导致体外 CpG 甲基化的负作用［30， 31］。
2 展望
虽然非病毒载体优于病毒载体，但是也面临很
多问题。如 S/MAR 载体稳定克隆形成率较低［4］，附
着复制体在细胞的快速增殖期丢失，特别常见于部
分肝切除后和新生胎儿生长发育期中，在有丝分裂
滞后的组织如脑，肌肉，肝，甚至是一个具有无限
制克隆的复制子［27， 32， 33］。尽管还存在许多未解决的
问题，但 S/MAR 载体的前期临床应用已取得一些进
展。S/MAR 附着体载体已应用于肝、中枢神经系统
（CNS）、眼（特别是在视网膜上皮细胞区）及肌肉
组织中，部分载体中携带的目的基因可形成持续免
疫应答对抗癌症［34］。
在未来研究中，我们可以选择组织特异性启动
子，减少 CpG 模序，在骨架结构中除去细菌序列和
使用 DNA 元件（如 CpGs，绝缘子和增强子）等一
系列优化条件，对现有的非病毒附着体载体进行改
造，从转录水平和染色质水平上对新型附着体载体
进行研究，优化表达体系使目的基因长期安全持续
表达和易于调控，为临床基因治疗提供一种新型的
非病毒表达载体。
参 考 文 献
［1］ Cole A. Child in gene therapy programme develops leukaemia. BMJ,
2008, 336 ：13.
［2］ Hacein-Bey-Abina S, von Kalle C, Schmidt M, et al. A serious
adverse event after successful gene therapy for X-linked severe
combined immunodeficiency. N Engl J Med, 2003, 348 ：255-256.
［3］ Hacein-Bey-Abina S, Von Kalle C, Schmidt M, et al. LMO2-associ-
ated clonal T cell proliferation in two patients after gene therapy for
SCID-X1. Science, 2003, 302（5644）：415-419.
［4］ Stehle IM, Postberg J, Rupprecht S, et al. Establishment and mitotic
stability of an extra-chromosomal mammalian replicon. BMC Cell
Biol, 2007, 8 ：33.
［5］ Wong SP, Argyros O, Coutelle C, et al. Strategies for the episomal
modification of cells. Current Opinion in Molecular Therapeutics,
2009, 11 ：433-441.
［6］ Ehrhardt A, Haase R, Schepers A, et al. Episomal vectors for gene
therapy. Current Gene Ther, 2008, 8 ：147-161.
［7］ Baiker A, Maercker C, Piechaczek C, et al. Mitotic stability of an
episomal vector containing a human scaffold/matrix-attached region
is provided by association with nuclear matrix. Nature Cell Biol,
2000, 2 ：182-184.
［8］ Bode J, Winkelmann S, Gotze S, et al. Correlations between scaffold/
matrix attachment region （S/MAR） binding activity and DNA duplex
destabilization energy. J Mol Biol, 2006, 358 ：597-613.
［9］ Piechaczek C, Fetzer C, Baiker A, et al. A vector based on the SV40
origin of replication and chromosomal S/MARs replicates episomally
in CHO cells. Nucleic Acids Res, 1999, 27 ：426-428.
［10］ Harraghy N, Gaussin A, Mermod N. Sustained transgene expression
using MAR elements. Curr Gene Ther, 2008, 8 ：353-366.
［11］ Bode J, Goetze S, Heng H, et al. From DNA structure to gene expre-
ssion ：mediators of nuclear compartmentalization and dynamics.
Chromosome Res, 2003, 11 ：435-445.
［12］ Argyros O, Wong SP, Niceta M, et al. Persistent episomal transgene
expression in liver following delivery of a scaffold/matrix attachment
region containing non-viral vector. Gene Ther, 2008, 15 ：1593-
1605.
［13］ Argyros O, Wong SP, Fedonidis C, et al. Development of S/MAR
minicircles for enhanced and persistent transgene expression in the
mouse liver. J Mol Biol, 2011, 89 ：515-529.
［14］ Haase R, Argyros O, Wong SP, et al. pEPito ：a significantly
improved non-viral episomal expression vector for mammalian cells.
BMC Biotechnol, 2010, 10 ：20.
［15］ Iqbal K, Barg-Kues B, Broll S, et al. Cytoplasmic injection of
circular plasmids allows targeted expression in mammalian embryos.
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第8期50
Biotechniques, 2009, 47 ：959-968.
［16］ Tessadori F, Zeng K, Manders E, et al. Stable S/MAR-based
episomal vectors are regulated at the chromatin level. Chromosome
Res, 2010, 18 ：757-775.
［17］ Wong SP, Argyros O, Coutelle C, et al. Non-viral S/MAR vectors rep-
licate episomally in vivo when provided with a selective advantage.
Gene Ther, 2011, 18 ：82-87.
［18］ Papapetrou EP, Ziros PG, Micheva ID, et al. Gene transfer into
human hematopoietic progenitor cells with an episomal vector
carrying an S/MAR element. Gene Ther, 2006, 13 ：40-51.
［19］ Sawyer GJ, Rela M, Davenport M, et al. Hydrodynamic gene
delivery to the liver ：theoretical and practical issues for clinical
application. Curr Gene Ther, 2009, 9 ：128-135.
［20］ Park HJ, Yang F, Cho SW. Nonviral delivery of genetic medicine for
therapeutic angiogenesis. Drug Deliv Rev, 2011, 64（1）： 40-52.
［21］ Conley SM, Naash MI. Nanoparticles for retinal gene therapy. Prog
Retin Eye Res, 2010, 29 ：376-397.
［22］ Manzini S, Vargiolu A, Stehle IM, et al. Genetically modified pigs
produced with a nonviral episomal vector. Proc Natl Acad Sci USA,
2006, 103 ：17672-17677.
［23］ Habener JF, Kemp DM, Thomas MK. Minireview ：transcriptional
regulation in pancreatic development. Endocrinol, 2005, 146 ：
1025-1034.
［24］ Nehlsen K, Broll S, Bode J. Replicating minicircles ：Generation
of nonviral episomes for the efficient modification of dividing cells.
Gene Ther Mol Biol, 2006, 10 ：233-244.
［25］ Broll S, Oumard A, Hahn K, et al. Minicircle performance depen-
ding on S/MAR nuclear matrix interactions. J Mol Biol, 2010, 395 ：
950-965.
［26］ Lufino MM, Manservigi R, Wade-Martins R. An S/MAR-based
infectious episomal genomic DNA expression vector provides long-
term regulated functional complementation of LDLR deficiency.
Nucleic Acids Res, 2007, 35 ：e98.
［27］ Li YS, Davidson E, Reid CN, et al. Optimising ultrasound-mediated
gene transfer （sonoporation） in vitro and prolonged expression of a
transgene in vivo：potential applications for gene therapy of cancer.
Cancer Lett, 2009, 273 ：62-69.
［28］ Rupprecht S, Hagedorn C, Seruggia D, et al. Controlled removal of a
nonviral episomal vector from transfected cells. Gene, 2010, 466 ：
36-42.
［29］ Ferber S, Halkin A, Cohen H, et al. Pancreatic and duodenal
homeobox gene 1 induces expression of insulin genes in liver
and ameliorates streptozotocin-induced hyperglycemia. Nature
Medicine, 2000, 6 ：568-572.
［30］ Antoniou M, Harland L, Mustoe T, et al. Transgenes encompassing
dual-promoter CpG islands from the human TBP and HNRPA2B1
loci are resistant to heterochromatin-mediated silencing. Genomics,
2003, 82 ：269-279.
［31］ Hyde SC, Pringle IA, Abdullah S, et al. CpG-free plasmids confer
reduced inflammation and sustained pulmonary gene expression.
Nature Biotechnol, 2008, 26 ：549-551.
［32］ Wong SP, Argyros O, Howe SJ, et al. Systemic gene transfer of
polyethylenimine （PEI）-plasmid DNA complexes to neonatal
mice. J Controlled Release, 2011, 150 ：298-306.
［33］ Argyros O, Wong SP, Harbottle RP. Non-viral episomal modification
of cells using S/MAR elements. Exp Opin Biol Ther, 2011, 11 ：
1177-11791.
［34］ Zhou Q, Brown J, Kanarek A, et al. In vivo reprogramming of adult
pancreatic exocrine cells to beta-cells. Nature, 2008, 455 ：627-
632.
（责任编辑 狄艳红）