全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2007, 34 (2) : 381 - 386
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2006 - 08 - 14; 修回日期 : 2007 - 01 - 25
基金项目 : 广西自然科学基金项目 (桂科青 0640062) ; 广西农业科学院科技发展基金项目 (2002008)3 E2mail: dzn620@1631com
M AR序列介导野苋菜凝集素基因在白菜中的表达
邓智年 1, 23 , 魏源文 1, 2 , 吕维莉 1 , 李杨瑞 1
(1 广西农业科学院广西作物遗传改良生物技术重点开放实验室 , 南宁 530007; 2 广西大学农学院 , 南宁 530004)
摘 　要 : 以 ‘丰顺 ’白菜带柄子叶为转化受体 , 用带有 MAR (Matrix A ttachment Region) 和不带 MAR
的两种植物表达载体进行农杆菌介导转化野苋菜凝集素基因 (Am aran thus virid is L. agg lu tin in, AVA ) 获得
转基因的抗蚜小白菜。分析 MAR序列介导对转基因表达的影响。表明利用 MAR序列介导 AVA基因表达 ,
获得转基因植株的数量比对照提高 29163% ; 转 AVA基因白菜对桃蚜 (M yzus persicae) 的群体发展有一定的
抑制作用 , 平均抑制率为 5518% ; MAR序列介导 AVA基因表达的转基因植株中 , 该基因的表达水平比对
照高 , 并且不同转基因单株间 AVA基因表达差异比对照小。
关键词 : 白菜 ; MAR; 野苋菜凝集素基因 ; 桃蚜 ; 转基因表达
中图分类号 : S 63413　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2007) 0220381206
Expression of Am a ran thus virid is L. A gglu tin in M ed ia ted by M a tr ix A ttach2
m en t Reg ion (M AR) Sequence in Tran sgen ic Ch inese Cabbage
DENG Zhi2nian1, 23 , W E I Yuan2wen1, 2 , LüW ei2li1 , and L I Yang2rui1
(1 Key Laboratory of C rop Genetic Im provem ent and B iotechnology of Guangxi, Guangxi A cadem y of A gricu ltura l Sciences, N ann ing
530007, China; 2A gricu ltura l College, Guangxi U niversity, N ann ing 530004, China )
Abstract: The cotyledons with petiole as accep tors, Chinese cabbage genetic transformation system me2
diated by A grobacterium tum efaciens was set up and Am aran thus virid is L. agg lu tin in (AVA ) transformed
p lants resistanting to M yzus persicae were acquired. The effects of MAR (matrix attachment region) on AVA
gene exp ression in transgentic Chinese cabbage were studied with two different p lant exp ression vectors. The
number of transgenic p lants was 29163% higher than that of the control. The bioassay of M yzus persicae re2
vealed that transgetic p lants showed more or less enhanced resistance and inhibition to population, and the av2
erage inhibition rate was 5518%. Among the transgetic p lants that AVA gene were mediated byMAR, the ex2
p ression level of AVA gene was higher than that of the control, and the exp ression variance of AVA gene among
transgetic p lants was smaller as well.
Key words: Chinese cabbage; Matrix attachment regions; AVA gene; M yzus persicae; Transgene exp res2
sion
白菜类蔬菜中缺乏抗蚜虫种质资源 , 至今无法通过常规育种手段培育出抗虫品种。借助转基因技
术获得抗蚜白菜 , 结合常规育种手段培育抗蚜新品种是防治蚜虫的有效途径之一。携带苋菜凝集素家
族基因 ACA、AHA的转基因烟草表现出对桃蚜良好的抑制作用 ( R inderie et al. , 1990; 周永刚 等 ,
2001; Guo et al. , 2004) 。目前应用于白菜类蔬菜作物分子改良的抗蚜基因主要是雪花莲凝集素基因
GNA (杨广东 等 , 2003; 张扬勇 等 , 2003; 王忠华 , 2004) , 尚未见苋菜凝集素基因导入白菜的报
道。
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与其它作物相比 , 转基因白菜类植株的抗虫性较差 , 这可能与抗虫基因表达水平低有关 (王忠
华 , 2004)。
MAR s (Matrix A ttachment Regions) 序列在转基因动植物中具有稳定和提高基因表达水平的作用
(B reyne et al. , 1992; A llen et al. , 1993, 1996, 2000; Han et al. , 1997; Lee et al. , 1998; Gutierrez2
Adan et al. , 2000) , 研究其在决定基因表达中所处的位置及对目的基因表达的作用 , 具有重要的实
际意义。
本研究利用自主克隆的野苋菜凝集素基因 (Am aran thus virid is L. agg lu tin in , AVA ) , 通过构建
MAR2AVA2MAR植物表达载体 , 利用农杆菌介导法转化白菜 , 获得抗蚜转化植株 , 并研究 MAR序列
介导对 AVA基因表达水平的影响。
1　材料与方法
111　材料与质粒
供试 ‘丰顺 ’白菜种子购自农贸市场。根癌农杆菌 EHA105为本实验室保存 , 植物表达载体质
粒 pC130022MARAVA及 pC13002AVA为本实验室所构建 , 各元件结构见图 1 (箭头方向表示 MAR以
相同方向排列 )。
图 1　植物表达载体 T2D NA结构
F ig. 1　T2D NA structure of plan t expression vectors
112　转化方法
种子消毒后接种于 1 /2MS0培养基上 , 取 5～7 d无菌苗的带柄子叶为外植体 , 将子叶柄基部插入
预处理培养基 (MS0 + 2, 42D 012 mg/L + NAA 011 mg/L + AgNO3 715 mg/L) 中预培养 2 d, 放在培
养皿中 , 加入用乙酰丁香酮 AS (终浓度为 50 mmol/L ) 活化的农杆菌菌液 (按 1∶5稀释 ) 浸染 10
m in, 用无菌滤纸将菌液吸干后转接到无抗生素的共培养基 (MS0 + TDZ 110 mg/L +NAA 011 mg/L +
AgNO3 715 mg/L + ABA 015 mg/L) 中暗培养 2 d, 再转入附加 500 mg/L 羧卞青霉素 (Carb) 和 20
mg/L 潮霉素 (Hyg) 的筛选培养基中 , 每 2周继代 1次。
培养 4周即可得到抗性芽 , 长到 2 cm高时切下转入壮苗培养基 (MS0 +BA 015 mg/L +NAA 011
mg/L + Carb 500 mg/L + Hyg 20 mg/L) 中培养 1～2周 , 移入生根培养基 (1 /2MS0 + IBA 210 mg/L +
Carb 500 mg/L + Hyg 20 mg/L)。
生根后移栽于土壤中发育至成熟。
113　转化植株的分子鉴定
小量抽提植物总 DNA的方法 ( Edwards et al. , 1991) 提取白菜总 DNA, 用 AVA 基因 5′端引物
( 5′2GGAAGATCTACCATGGCGGGATTACCAGTG23′) 和 3′端 引 物 ( 5′2AGCGTCGACTTAGTTGTTG2
GATCCCAATTC23′) 进行 PCR扩增 , 扩增产物用 018%琼脂糖凝胶电泳检测。
PCR2Southern杂交采用 Roche公司的 D IG H igh Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit Ⅱ试剂
盒。
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　2期 邓智年等 : MAR序列介导野苋菜凝集素基因在白菜中的表达 　
采用总 RNA抽提试剂盒提取 PCR呈阳性的植株总 RNA , 以 RNA作为模板进行 RT2PCR。
114　转基因植株的抗蚜性测定
选取 PCR2Southern检测呈阳性的转基因植株 10株进行抗蚜性测定。每棵白菜植株上接 10头 1～
2龄桃蚜 (M yzus persicae Sulzer) , 每天观察统计桃蚜的存活和生长情况 , 共观察 12 d。每处理重复 3
次 , 非转基因植株为对照。桃蚜抑制率 ( % ) = (对照平均桃蚜量 -样品平均桃蚜量 ) /对照平均桃
蚜量 ×100。
2　结果与分析
211　白菜转化及再生植株的筛选
带柄子叶与携带质粒的农杆菌 EHA105共培养 2 d后转到筛选培养基上进行抗性芽的诱导和筛
选。10～15 d后 , 含 20 mg/L Hyg的筛选培养基上 , 一部分外植体子叶柄膨大 , 伤口基部长出绿色不
定芽 ; 一部分基部变黄 , 最终死亡。经过 4周筛选 , 将保持绿色的抗性芽切下转至壮苗培养基上培养
1～2周 , 然后再转至生根培养基上培养 3～4周可形成具有发达根系的完整植株 , 炼苗后移栽到营养
土中。
212　白菜转化植株的分子检测
根据 AVA基因序列设计特异引物扩增 , 两种质粒的转化植株均扩增出长度为 1 900 bp的 AVA基
因 , 而阴性对照没有 (图 2) , 初步证明该基因已经整合到白菜基因组中。
图 2　抗性植株的 PCR检测
1. Marker DL22000; 2. 非转化植株 ; 3～5. 含有 MAR抗性植株 ; 6～8. 无 MAR抗性植株。
F ig. 2　PCR of resistan t plan ts
1. Marker DL22000; 2. Non2transgenic p lants; 3 - 5. Resistant p lants with MAR;
6 - 8. Resistant p lants withoutMAR.
随机选取 4株 PCR检测为阳性的植株进行 PCR2Southern分子杂交 , 结果见图 3。共获得 PCR阳性
植株 82株 , 其中转化 pC130022MARAVA质粒获得 11个基因系 , 55株 PCR阳性植株 ; 转化 pC13002AVA
图 3　抗性植株 Southern杂交
CK. pC130022MARAVA PCR产物 ; A, B. 含有 MAR抗性植株 ; C, D. 无 MAR转化植株 ; CK - . 非转基因植株。
F ig. 3　Southern blot of D NA from resistan t plan ts
CK. pC130022MARAVA PCR p roducts; A, B. Transgenic p lants with MAR;
C, D. Transgenic p lants withoutMAR; CK - . W ild type p lants as negative control.
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质粒获得 7个基因系 , 27株 PCR阳性植株。
MAR序列介导的转基因系数量提高了 57114% , 抗性子叶平均再生植株数提高了 29163%。
213　RT2PCR鉴定
RT2PCR验证含有内含子的 AVA基因在白菜中的表达。结果表明扩增到约 900 bp的片段 , AVA基
因的内含子得到正确剪切 , 进一步证明了转基因白菜中不仅整合了 AVA 基因 , 而且该基因获得了正
确的表达 (图 4)。
图 4　抗性植株的 RT2PCR
1, 2, 4. 含有 MAR转化植株 ; 3. Marker DL22000; 5～7. 无 MAR的转化植株。
F ig. 4　RT2PCR of resistan t plan ts
1, 2, 4 . Transgenic p lants with MAR; 3. Marker DL22000;
5 - 7. Transgenic p lants without MAR.
214　转基因阳性植株的抗蚜分析
对 PCR2Southern检测呈阳性的白菜植株进行抗蚜性分析。
图 5显示含有 AVA基因的白菜植株对桃蚜的群体发展有一定的抑制作用。与对照相比 , 在转基
因抗性植株上都观察到有桃蚜若虫死亡的现象 , 其中含 MAR的转基因 T0代植株表现出明显的对桃蚜
生长的抑制作用 , 接种 12 d后的平均抑制桃蚜密度达 5518% ; 而非转化对照为 0; 无 MAR的转基因
植株平均抑制桃蚜密度为 3413%。
不同抗性植株抗虫性差异很大 (图 6)。无 MAR的 T0代转 AVA基因植株中 , 大部分植株的桃蚜
图 5　转基因植株的抗蚜分析图
F ig. 5　Aph id resistance b ioa ssay of tran sgen ic plan ts
图 6　具有不同抗蚜性的两种转化植株的百分率分布
F ig. 6　Percen tage d istr ibution of the two tran sgen ic plan ts
w ith d ifferen t levels of aph id resistance
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　2期 邓智年等 : MAR序列介导野苋菜凝集素基因在白菜中的表达 　
抑制率在 30% ～50%之间 , 有的单株最高可达 7214% , 18% ～20%的植株几乎没有抗蚜性。含 MAR
的转基因单株的基因表达也仍存在一定的差异 , 超过 2813%的植株桃蚜抑制率超过 70% , 有的甚至
高达 85% , 但有的植株仅为 10% ～15%。
这些结果暗示构建在外源基因两侧的 MAR序列在一定程度上可以提高 AVA的表达水平 , 但是并
不能明显降低其在不同转基因系间的表达差异。
从总体上来说含有 MAR的转基因白菜植株较不含的转化植株对桃蚜具有更明显的抑制作用 , 且
抗性程度与 AVA基因的表达量呈正相关。
3　讨论
利用植物凝集素基因进行的植物抗虫基因工程刚起步不久 , 获得的转基因植株是否对人畜无害 ,
还有待进一步证实。
研究结果表明 , 转野苋菜凝集素基因 AVA的白菜有一定抑制桃蚜群体发展的作用 , 证明 AVA基
因是一个有潜在应用前景的抗蚜基因。
转基因沉默、基因表达不稳定及转基因株系间的基因表达差异是制约植物转基因研究的瓶颈问
题。当转基因两侧连有 MAR序列时 , MAR序列之间就会形成一个位置独立、结构较为松散的 DNA
环状结构域 , 从而使转基因表达的位置效应降到最低 (A llen et al. , 1996; Sp iker & Thomp son,
1996)。A llen等 (1993, 1996) 认为 MAR对转基因表达水平的提高主要是通过减少同源依赖性基因
沉默的负影响而提高转基因的表达效率 , 无 MAR的对照转基因系中由于基因沉默使转基因表达效率
减低。
MAR序列介导的植物转基因研究还处在初级阶段 , MAR总体上表现为稳定和提高转基因表达水
平 , 但对降低转基因株系间的基因表达差异结果却不相同 (B reyne et al. , 1992; Schoffl et al. , 1993;
M lynarova et al. , 1994, 1995; Sp iker et al. , 1996)。另外转基因两侧 MAR的同源性也是必需的 , 只
有这样 MAR 才能提高外源基因在转基因植株中的表达水平 ( Slatter et al. , 1991; L iu & Tabe,
1998)。
本研究的结果初步证实了 MAR序列在影响转基因表达方面的作用。两种不同结构的质粒在相同
的试验条件下进行转化 , 结果却有着明显的差异 , 显而易见 , 这是由质粒本身所引起的 , 这个结果与
伍成祥等 (2002) 利用基因枪转化 MAR序列介导水稻 bar基因的表达的研究结果一致。
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