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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(3):115-120
高等植物中源库组织相互交织形成一个复杂
的有机整体。一些源组织如成熟叶片主要为糖类等
有机物合成的场所,其合成的光合产物主要以蔗糖
的形式运输至库器官后,一部分储存在薄壁细胞
中,另外一部分在各种蔗糖代谢酶的作用下水解为
单糖,并在单糖转运蛋白的协助下被库器官所利用,
收稿日期 :2014-09-04
基金项目 :“863”计划(2013AA102604-1),海南省自然科学基金项目(313078),海南省重大科技项(ZDZX2013023-1)
作者简介 :王俊刚,男,博士研究生,助理研究员,研究方向 :甘蔗生物技术 ;E-mail :wangjungang@itbb.org.cn
通讯作者 :张树珍,女,博士,研究员,研究方向 :甘蔗生物技术 ;E-mail :zhangsz2007@163.com
甘蔗脱毒健康种苗中单糖转运蛋白基因差异表达分析
王俊刚 赵婷婷 杨本鹏 蔡文伟 张树珍
(中国热带农业科学院甘蔗研究中心 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 农业部热带作物生物学与
遗传资源利用重点实验室,海口 571101)
摘 要 : 旨在探讨脱毒处理对单糖转运蛋白表达量的影响,分析了 3 种甘蔗单糖转运蛋白基因 SGT1、SGT2 和 PST2a 在健
康种苗和常规种苗不同生长时期的表达量差异。结果显示,在苗期和分蘖期甘蔗脱毒健康种苗叶片中 SGT1、SGT2 和 PST2a 表达
量高于未脱毒种苗 ;在拔节期和成熟期甘蔗脱毒健康种苗未成熟茎节中 SGT1、SGT2 和 PST2a 表达量也高于未脱毒种苗 ;而在成
熟茎节中表达量没有差异。苗期和分蘖期甘蔗叶片以及未成熟茎节中细胞生长分裂旺盛,需要利用大量单糖以提供能源和生物合
成的前体物质。结果表明,该 3 种单糖转运蛋白基因表达量上升可能提供更多单糖用于细胞代谢,促进脱毒健康种苗的快速生长
及最终生物量的积累。
关键词 : 甘蔗 ;健康种苗 ;单糖转运蛋白基因 ;基因表达 ;产量
DOI :10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.04.016
The Differential Expression of Monosaccharide Transporter Genes in
Disease-free Sugarcane Plants
Wang Jungang Zhao Tingting Yang Benpeng Cai Wenwei Zhang Shuzhen
(Sugarcane Research Center of Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences,Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology of Chinese
Academy of Tropical Agricultural Sciences,Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Tropical Crops,
Ministry of Agriculture,Haikou 571101)
Abstract: The sugarcane yield can be increased by planting disease-free sugarcane seedlings. However, the physiological and molecular
mechanisms of this yield increasing are still not clear now. Monosaccharide transporters are one type of key regulatory proteins involved in carbon
accumulation and partitioning processes, and play an important role in plants defense process. The differential expression of three monosaccharide
transporter genes(SGT1, SGT2 and PST2a)in disease-free and untreated sugarcane plants was studied to clarify the potential function of these
genes on sugarcane yields. The expression levels of SGT1, SGT2 and PST2a in leaves of disease-free plants at seedling and tillering stages were
obviously higher than untreated plants. Furthermore, the expression levels of these genes were increased in immature internodes of disease-free
plants at elongation and mature stages, but there were no difference in mature internodes. The sugarcane leaves(at seedling and tillering stages)
and the immature internodes(at elongation and mature stages)grow rapidly and demand for more monosaccharide to provide energy and the
precursor of biosynthesis. The up-regulations of these monosaccharide transporter genes might accelerate the growth and biomass accumulation
of disease-free sugarcane plants by increasing the transporting and uptake of monosaccharide.
Key words: sugarcane ;disease-free plants ;monosaccharide transporter gene ;gene expression ;yield
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.3116
从而为植物的生长提供基本能量和营养物质。植物
单糖转运蛋白属于易化因子超家族(Major facilitator
superfamily)成员之一,是一种能量依赖性 H+ 共转
运蛋白,具有 12 次跨膜结构,包括己糖转运蛋白
(hexose transporter,HT)和葡萄糖转运蛋白(glueose
tansporter,GT)等,在植物碳水化合物分配、韧皮
部装载和卸载、植物防御以及糖信号过程中发挥关
键作用,同时与植物生物量形成有密切的关系[1-3]。
甘蔗(Saccharum officinarum L.)是最为重要的
糖料作物,是一种多年宿根无性繁殖栽培作物。多
年种植尤其是宿根后,几乎所有甘蔗品种在大规模
应用后均受到宿根矮化病(Ratoon Stunting Disease,
RSD) 和 甘 蔗 花 叶 病(Sugarcane mosaic virus,SC-
MV)的危害,导致品种退化,造成甘蔗减产达 10%,
有的甚至高达 50%[4,5]。目前,生产上尚无有效的
化学方法防治这两种病害。研究表明,采用热处理
结合腋芽分生组织培养技术培育的脱毒健康种苗是
防治这两种病害最有效的措施之一[6-10]。种植甘蔗
脱毒健康种苗可以增产 20%-40%[6-8]。从甘蔗农
艺性状上对其增产机理研究比较多[8,9],但更进一
步分子水平的增产机理还未见报道。本研究利用已
报道的 3 个甘蔗单糖转运蛋白基因 PST2a(Putative
Sugar Transporter 2a,PST2a)、SGT1(Glucose Tansp-
orter1,SGT1)和 SGT2(Glucose Tansporter2,SGT2)
为研究对象,分别从甘蔗生长的苗期、分蘖期、拔
节期和成熟期对它们的表达量进行比较分析,以期
探讨脱毒处理对单糖转运蛋白表达量的影响,从分
子生物学层面上揭示种植脱毒健康种苗可能的增产
机理。
1 材料与方法
1.1 材料
供试材料为 ROC22 脱毒健康种苗二代种茎苗和
未脱毒 ROC22 种茎。材料来源于中国热带农业科学
院热带生物技术研究所甘蔗试验地。
1.2 方法
1.2.1 总 RNA 提取、定量及完整性检测 取从 10
个完整植株剥离的冻存样品进行研磨,用 RNAout
试剂盒(北京天泽基因)试剂提取全部研磨样品的
总 RNA 以减少取样误差。用核酸分析仪(Eppendorf
Biophotometer Plus) 测 260 nm 和 280 nm 处 的 吸 光
值,以 A260/A280 比值估计总 RNA 的纯度,以 A260 的
值进行总 RNA 定量。以 1.2% 普通琼脂糖凝胶电泳
检测 RNA 完整性。
1.2.2 第一链 cDNA 的合成 取甘蔗总 RNA 3 μg 与
反转录引物(oligo-dT 接头引物)1 μL(10 pmol/L)
混合,70℃加热 5 min 后,立即放置冰上,然后加
入 5×buffer,2.5 mmol/L dNTP 混合液,Ribonuclease
Inhibitor,M-MLV 反转录酶,反应体系为 25 μL。反
应过程为 42℃ 60 min,70℃ 15 min,5 min 后瞬时
离心,最后放入 -80℃保存备用。
1.2.3 引物设计 根据公布的甘蔗单糖转运蛋白基
因 SGT1(GenBank 登录号:L21752)、SGT2(GenBank
登 录 号 :L21753)、PST2a(GenBank 登 录 号 :AY-
165599)序列利用 primer3 设计引物,内参 GADPH
表 1 引物序列、PCR 扩增基因片段长度和扩增效率
基因名称 登录号 引物序列(5-3) 扩增产物长度 /bp 扩增效率
SGT1 L21752 F:GCTCTTCACCTTCGCCATC 188 0.976
R:CTTCCAGAACCAGTGCTTCC
SGT2 L21753 F:TTCGGCATCTTCCTCTTC 137 0.992
R:CCTTCTTCCAGAACCAGT
PST2a AY165599 F:CGAGAAGGTGAGGACGGTAAG 154 0.958
R:CAGAGCAGCAGCATGTATGAAC
GAPDH CA254672 F:CACGGCCACTGGAAGCA 101 0.994
R:TCCTCAGGGTTCCTGATGCC
基因引物引自参考文献[11]。
1.2.4 Real-Time PCR 扩增及数据分析 选用 SYBR®
Premix Ex TaqTM Ⅱ(TaKaRa)试剂盒,按照说明书
建立 25 μL 荧光定量 PCR 反应体系 :cDNA 模板 1
2015,31(3) 117王俊刚等:甘蔗脱毒健康种苗中单糖转运蛋白基因差异表达分析
μL,引物 1、引物 2 各 1 μL,Rox Ⅱ 0.5 μL,SYBR
Taq 12.5 μL,dH2O 9 μL;反应程序:95℃热变性 15 s;
95℃ 15 s,60℃ 40 s,40 个循环。反应在 Mx3005P
(Stratagene)上完成,每个处理设置 3 次重复,扩增
效率见表 1。以甘蔗 GADPH 基因为内参基因,所有
结果以 2-ΔΔCT 法计算相对定量值[12]。
2 结果
2.1 RNA 纯度鉴定
不同组织以及不同生长时期的总 RNA 琼脂糖凝
胶电泳表明,28S 和 18S 条带清晰可见,无明显降解;
A260/A280 比值皆在 1.8-2.2 之间,可用于下一步试验。
2.2 苗期单糖转运蛋白基因表达分析
研究结果表明,3 个单糖转运蛋白基因 SGT1、
SGT2 和 PST2a 在苗期甘蔗叶片中均有表达 ;在脱毒
健康种苗未成熟叶片中表达量均明显高于未脱毒种
苗 ;在脱毒健康种苗成熟叶片中 SGT1 和 SGT2 表达
量与对照无差异,PST2a 基因表达量升高(图 1)。
2.3 分蘖期单糖转运蛋白基因表达分析
选择甘蔗分蘖中期单糖转运蛋白基因的表达特
征进行分析。大约在甘蔗第一棵分蘖苗长出 7 d 后,
对主茎甘蔗进行采样,此时主茎甘蔗叶片光合效率
高,需要大量合成有机化合物,随后光合效率维持
一段时间后,慢慢降低(数据未显示)。研究结果(图
2)表明,SGT1、SGT2 和 PST2a 在脱毒健康种苗未
成熟和成熟叶片中的表达量较未脱毒种苗均大幅提
高,表明脱毒处理可能使分蘖期甘蔗叶片中单糖利
用效率提高,促进植株的分蘖和快速生长。
ሩ㺘䗮䟿
0
2
4
6
8
10 CK
Treat
SGT1 PST2aSGT2สഐ㊫රሩ㺘䗮䟿
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
CK
Treat
SGT1 SGT2 PST2aสഐ㊫රB
A
A :未成熟叶片 ;B :成熟叶片
图 1 甘蔗苗期不同组织 SGT1、SGT2 和 PST2a 基因相对
表达量
สഐ㊫රሩ㺘䗮䟿 024681012 CKTreatSGT1 SGT2 PST2a
0
1
2
3
4
5 CK
Treat
SGT1 SGT2 PST2aสഐ㊫රሩ㺘䗮䟿
A
B
A :未成熟叶片 ;B :成熟叶片
图 2 甘蔗分蘖期不同组织 SGT1、SGT2 和 PST2a 基因相
对表达量
2.4 拔节期单糖转运蛋白基因表达分析
甘蔗拔节期为茎秆快速生长时期,甘蔗最终生
物量与此阶段的快速生长呈正相关。结果(图 3)
表明,SGT1、SGT2 和 PST2a 在拔节期甘蔗脱毒健
康种苗叶片中表达量与未脱毒种苗差异不明显 ;然
而在茎节中的表达量差异却呈现出一定的趋势 :在
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.3118
幼嫩未成熟 1-3 茎节中,表达量稍有提高 ;随着茎
节发育糖分的快速利用,到 7-8 节 SGT1、SGT2 和
PST2a 表达量均大幅提高 ;随着茎节成熟表达量差
异增幅逐渐变小或没有差异,可能与甘蔗茎秆中单
糖的利用效率呈正相关。
2.5 成熟期单糖转运蛋白基因表达分析
结果(图 4)表明,SGT1 和 PST2a 在成熟期脱
毒健康甘蔗种苗叶片中的表达量大幅增加,而 SGT2
6
5
4
3
2
1
0
YL ML 1 2 3
组织类型
相
对
表
达
量
4 5 6 7 8
6
7
8
9
5
4
3
2
1
0
YL ML 1 2 3
组织类型
相
对
表
达
量
4 5 6 7 8
6
7
8
9
A
B
C
5
4
3
2
1
0
YL ML 1 2 3
组织类型
相
对
表
达
量
4 5 6 7 8
CK
Treat
CK
Treat
CK
Treat
YL :未 成 熟 叶 片 ;ML :成 熟 叶 片 ;1 :1-3 节 ;2 :4-5 节 ;3 :7-8 节 ;
4 :10-11 节 ;5 :13-14 节 ;6 :16-17 节 ;7 :19-20 节 ;8 :22-23 节
图 3 甘蔗拔节期不同组织 SGT1(A)、SGT2(B)和
PST2a(C)基因相对表达量
25
20
10
2.5
1.5
0.5
0
YL ML 1 2 4㓴㓷㊫රሩ㺘䗮䟿 3 5 6 7 8 9 101.02.015
50
40
20
2.5
1.5
0.5
0
YL ML 1 2 4㓴㓷㊫රሩ㺘䗮䟿 3 5 6 7 8 9 101.02.030
25
A
B
C
20
10
1.5
0.5
0
YL ML 1 2 4㓴㓷㊫රሩ㺘䗮䟿 3 5 6 7 8 9 101.015 CKTreat
CK
Treat
CK
Treat
YL :未 成 熟 叶 片 ;ML :成 熟 叶 片 ;1 :1-3 节 ;2 :4-5 节 ;3 :7-8 节 ;
4 :10-11 节 ;5 :13-14 节 ;6 :16-17 节 ;7 :19-20 节 ;8 :22-23 节 ;9 :
29-30 节 ;10 :36-37 节
图 4 甘蔗成熟期不同组织 SGT1(A)、SGT2(B)和
PST2a(C)基因相对表达量
2015,31(3) 119王俊刚等:甘蔗脱毒健康种苗中单糖转运蛋白基因差异表达分析
表达量差异较小 ;SGT1 和 SGT2 在脱毒健康种苗未
成熟茎节中表达量大幅提高,随着茎节成熟表达量
低于对照,然而 PST2a 在成熟期脱毒健康甘蔗种苗
茎秆中的表达量与未脱毒种苗没有差异。表明该 3
种单糖转运蛋白可能在不同组织中参与调控单糖的
分配及利用。
3 讨论
植物单糖转运蛋白是调控生物量的一类重要蛋
白[13]。在多种植物中均存在多基因现象,并且在
不同植物中基因成员数及不同部位表达量也有所不
同。在植物生长发育过程中不同单糖转运蛋白可能
是通过协同作用实现其生理学功能[14-16]。水稻单糖
转运蛋白 OsMST6 在种子灌浆中期表达量达到最高,
随着种子成熟逐渐降低,主要表达部位在幼嫩种子
维管薄壁组织的珠心和胚乳、花粉、花药以及叶片
叶肉细胞中,推测 OsMST6 可能与种子形成及产量
有相关性[17];水稻 OsMST4 在种子灌浆期早期和中
期表达量最高,随后降低,拟推测其重要功能为种
子形成供应单糖[18];拟南芥单糖转运蛋白 STP1 和
STP13 在根部表达,能够从根的周围吸收糖分[19];
通过提高拟南芥单糖转运蛋白 TMT1 表达量能够增
加其种子的生物量[13]。各种单糖转运蛋白差异表
达量和组织特异性表达,也决定了其在植物不同发
育阶段发挥不同的作用。此外,单糖转运蛋白也参
与植物防御过程,通常基因表达受到病原菌入侵的
调控[3]。
种植甘蔗脱毒健康种苗通常能够增产 20% 以
上,其增产机理在田间主要表现为分蘖强、生长快、
成茎率高等性状[8]。然而进一步从分子生物学方面
对其可能的增产机理的研究报道较少,特别是关于
单糖转运方面的研究还未见报道。植物中单糖转运
蛋白通常与单糖的快速利用和分配相关。在生长和
细胞分裂旺盛的细胞及组织中通常对单糖的需求高,
因此也需要较多的单糖转运蛋白参与。本研究表明,
甘蔗 SGT1、SGT2 和 PST2a 基因在脱毒健康种苗苗
期和分蘖期叶片中的表达显著高于未脱毒种苗,表
明脱毒处理可能使得这一生长阶段甘蔗叶片中单糖
利用提高,促进叶片及整株植株的快速生长发育,
这也可能为脱毒健康种苗的强分蘖提供更多的单糖
而被加以利用。SGT1、SGT2 和 PST2a 在拔节期脱
毒健康种苗快速生长 1-8 茎节中的表达明显高于对
照,可能有利于茎节的快速生长,为其提供更多的
单糖以及纤维素合成前体底物,因此进一步需要更
多的单糖转运蛋白来增强对单糖的利用。SGT1 和
SGT2 在脱毒健康种苗成熟期 1-8 节茎节中大量表达,
有利于未成熟茎节增粗,增加产量 ;同时在成熟茎
节中表达量降低,降低了对单糖的利用,促进蔗糖
的积累,提升甘蔗品质。通过对整个生长期脱毒健
康种苗和非脱毒苗中的单糖转运蛋白基因差异表达
研究表明 :单糖转运蛋白基因表达量与甘蔗脱毒健
康种苗的产量形成呈正相关 ;该 3 种单糖转运蛋白
基因表达可能受到甘蔗病害的抑制,进一步预测它
们可能有利于甘蔗的产量形成。
4 结论
本研究采用 Real-Time PCR 技术分析了甘蔗脱
毒健康种苗和常规种苗中 3 种单糖转运蛋白基因
SGT1、SGT2 和 PST2a 不同生长时期的表达量差异。
研究结果表明 :(1)在苗期甘蔗脱毒健康种苗叶片
中 PST2a 基因表达高于未脱毒种苗 ;SGT1 和 SGT2
基因在未成熟叶片中表达高于未脱毒种苗。(2)在
分 蘖 期 甘 蔗 脱 毒 健 康 种 苗 叶 片 中 SGT1、SGT2 和
PST2a 表达量均明显高于对照。(3)在拔节期甘蔗
脱毒健康种苗叶片中 SGT1、SGT2 和 PST2a 基因表
达与对照没有差异 ;而在未成熟茎节中 SGT1、SGT2
和 PST2a 基因表达量都明显高于对照,随着茎节成
熟表达量差异逐渐缩小。(4)在成熟期甘蔗脱毒健
康种苗叶片中 SGT1 和 PST2a 基因表达量比对照高 ;
未成熟茎节中 SGT1 和 SGT2 基因表达量高于对照,
而成熟茎节中表达量没有差异。
参 考 文 献
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(责任编辑 马鑫)