全 文 ：·综述与专论· 2015, 31(5):20-26
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
秸秆类生物质是全球第四大能源物质。我国每
年生产的玉米秸秆生物质 1.5 亿 t，利用纤维素转化
技术可生产 1 500 万 t 生物燃料及 1 800 万 t 加工产品，
相当于 4 500 万 t 石油产生的价值［1］。当前我国大
量秸秆生物质未充分利用，许多在田地直接焚烧。
这一方面使资源白白浪费 ；另一方面产生严重的大
气污染，如每年春夏之交的中原小麦秸秆田间燃烧
给我国许多省造成重大的空气污染。如何充分利用
秸秆生物质资源，世界各国相继提出了发展生物质
资源的国家战略计划［2］，纤维素酶能将秸秆类生物
质转化为可发酵性糖，再结合发酵技术直接生产生
物燃料，其具有技术成熟、效率高、环境友好等优点，
成为了新能源研究领域的主要方向之一。高效、廉价、
大量的纤维素酶等糖苷水解酶是其关键。本文将从
对秸秆类生物质的预处理、纤维素酶的作用机理研
究和纤维素酶基因工程技术三个方面对纤维素酶的
研究进展进行综述分析，以促进我国秸秆类生物质
的利用技术。
收稿日期 ：2014-08-09
基金项目 ：国家自然科学基金项目（21376184），湖北省教育厅科学研究项目（D20121108）
作者简介 ：张森翔，男，硕士研究生，研究方向 ：纤维素酶应用 ；E-mail ：zhangsenxiang421@163.com
通讯作者 ：杨忠华，博士，教授，研究方向 ：生物化工 ；E-mail ：yangzh@wust.edu.cn
纤维素酶降解秸秆特性及其基因工程研究进展
张森翔  尹小燕  龚志伟  杨忠华  侯亚利  周卫
（武汉科技大学化学工程与技术学院，武汉 430081）
摘 要 ： 能源短缺和环境污染问题是人们关注的焦点。秸秆类生物质以其资源丰富、无污染及可再生等特性使其在解决能
源危机方面具有极大应用前景。对秸秆类生物质通过纤维素酶的水解转化为可发酵性的糖，再结合发酵技术可进一步生产乙醇、
氢气等能源物质，是一条成熟的能源化技术路线。其关键是秸秆生物质的预处理与高效的糖苷水解酶获得。将从对秸秆类生物质
的预处理、纤维素酶的作用机理研究和纤维素酶基因工程 3 个方面对当前的研究进展进行综述与分析。这对于促进秸秆类生物质
能源化应用具有指导意义。
关键词 ： 纤维素 ；纤维素酶 ；秸秆生物质 ；纤维素水解效率 ；纤维素酶基因
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.004
Advances in Research of Straw Degradation with Cellulase and Its
Genetic Engineering
Zhang Senxiang Yin Xiaoyan Gong Zhiwei Yang Zhonghua Hou Yali Zhou Wei
（School of Chemical Engineering and Technology，Wuhan University of Science and Technology，Wuhan 430081）
Abstract: Energy shortage and environmental pollution have become the public focusing issue. Straw biomass with its rich resources,
non-polluting and renewable feature, has great application prospect in solving the energy crisis. Converting straw biomass to fermentable sugars
by hydrolysis with cellulase and combing with fermentation may produce ethanol, hydrogen and other materials of energy, which has been a
mature technology route. The crucial steps of utilizing straw biomass are the pretreatment of straw biomass and efficient obtaining of glycoside
hydrolases. We summarize and analyze the current research from 3 aspects: the structural characteristics of straw and its biological pretreatment;
the mechanism of cellulase in hydrolysis of straw biomass; and the gene engineering for cellulase. It has a guiding significance in the promotion of
applying straw biomass for energy.
Key words: cellulose ；cellulase ；straw biomass ；hydrolysis efficiency of cellulose ；cellulase gene
2015,31(5) 21张森翔等：纤维素酶降解秸秆特性及其基因工程研究进展
1 秸秆的结构特征及其预处理方法
秸秆类生物质纤维素的结构特性直接影响纤维
素酶对其的降解效率，其表面粗糙度［3］、结晶度、
聚合度、木质素的组成和分布、半纤维素成分、粒度、
孔隙率［4］、疏水性［5］和水吸附值［6］等都会阻碍纤
维素酶的水解，故对秸秆本身的纤维素结构的研究
成为纤维素酶降解纤维素基础研究的一个重要方向。
纤维素是一种由 β-1，4 糖苷键联接的 n 个 D-吡
喃型葡萄糖链形成的大分子多糖，通过氢键的缔合
作用，形成纤维束，按分子密度大小分为结晶区和
无定形区，其中天然纤维素中主要为结晶纤维素。
纤维素一般均包埋或嵌合在半纤维素和木质素里，
形成网状结构［7］。通过预处理，破坏木质素对纤维
素的包裹及纤维素的晶体结构，使更多的纤维素裸
露出来，即去除大量木质素，并最小程度的进行多
糖结构修饰，保留纤维素的天然超微结构［8］，达到
提高工业中纤维素和半纤维素利用的目的。
甘蔗渣、玉米秸秆、小麦秸秆及稻草粉等秸秆
类生物质进行预处理的方法主要有物理法（机械粉
碎、辐射）、物理化学法（蒸汽爆破、AFEX、CO2 爆破、
湿氧处理和臭氧分解）、化学法（酸水解、碱水解、
离子液体处理和有机溶剂法）［9］。主要的成果归纳
于表 1 中。其中物理法对环境的污染小，但是其过
程耗能大，成本高，不适合大规模工业生产 ；化学
法极易产生发酵抑制物，且部分酸碱浓度过大会腐
蚀设备，污染环境 ；而物理化学法对其反应设备或
者反应试剂要求高，成本昂贵。
每年夏季，长江以南的江河湖泊生长着大量水
表 1 甘蔗秸秆、玉米秸秆、小麦秸秆、稻草秸秆的预处理研究结果
物料 预处理方法 处理效果 处理结果 文献
甘蔗渣
蒸汽爆破 92.7% 可溶性半纤维素溶解，81.3% 可溶性木质素溶解 酶解转化率达 80% ［10］
表面活性剂处理 晶粒尺寸减小 0.559 nm 转化率 66.1% ［11］
微波处理
结晶度增加了 6%，纤维素内氢键出现延伸，
晶粒尺寸变为 0.130 nm
产糖率 83% ［12］
玉米秸
秆
酸处理 只生产 0.4 g 糖醛 /L 55.1 g/L 糖，0.49 g 乙醇 /g 葡萄糖 ［13］
热水处理 14.1% 纤维素、47% 半纤维素、19.1% 木质素变为可溶 1 g 玉米秸秆酶解产糖 550 mg ［14］
微波处理 85.90% 半纤维素分解 糖转化率 90.66% ［15］
碱处理 移除了 79.49% 木质素 产率提高 34.59% ［16］
小麦秸
秆
酸处理
32.37 mg 甲酸，12.08 mg 糠醛，7.98 mg 醋酸，
1.14 mg 5- 氢甲基糠醛 /g 底物
理论产糖率 89% ［17］
臭氧处理 40% 木质素移除 产氢率提高 158% ［18］
离子试剂处理 60% 木质素移除 葡聚糖转化率 83.3% ［19］
稻草
酸处理 释放 16.44% 的木糖 86.5% 木糖理论产量，83% 酶解消化率 ［20］
有机溶剂 60% 木质素移除 产生 31 g/L 总糖 ［21］
离子液体 纤维素成分增加，木质素成分减少 93.3% 乙醇产量 ［22］
葫芦，引起大面积生物危害。对其综合利用，可达
到变废为宝的目的。常用的预处理方法，其能量损
耗及产生三废处理的成本压力是制约其工业化应用
的主要因素，深入研究其结构及化学特性，寻找一
种经济高效的预处理方法对秸秆的利用具有重要意
义。笔者所在实验室对木质纤维素成分达 50% 左右
的水葫芦进行预处理研究，结合物理法和化学法处
理，利用纤维素酶降解后糖量和糖类作为评价指标，
找到进行工业高效利用的预处理方法。
2 纤维素酶作用机理研究
纤维素酶是由多种水解酶组成的复合酶，也称
纤维素酶系，包含 ：内切葡聚糖酶（Endoglucanase，
EG ；EC 3.2.1.4）， 外 切 葡 聚 糖 酶（Exoglucanase，
CBH ；EC 3.2.1.91，EC 3.2.1.176），β-葡 糖 苷 酶
（β-glucosidase，BG ；EC 3.2.1.21）［23］。通常认为纤
维素酶降解纤维素的原理为协同作用，主要包括以
下 3 个步骤 ：（1）CBH 作用于纤维素线状分子末端，
水解 1，4-β-D 糖苷键，每次切下 1 个纤维二糖分子 ；
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（2）EG 作用于纤维素内部的非结晶区，随机水解
β-1，4 糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量含
非还原性末端的小分子纤维素 AAA9 家族（原 GH61
家族）的氧化降解酶类，具有微弱的内切葡聚糖
酶活性，起初一直被作为糖苷水解酶，后经研究发
现其三维结构与一般的 EG 不同，其可以通过氧化
反应使得纤维素被部分氧化降解，并在一定程度上
破坏其结晶结构，从而使纤维素更容易被纤维素酶
降解［24］；（3）BG 将纤维二糖和寡糖水解成葡萄糖
分子［25］。
Cao 等［26］通过利用纤维素酶降解不同类型的
纸浆发现，纤维素酶解必须首先对纤维素的晶体结
构进行破坏，并推断出纤维素结晶区的解聚与解链
是纤维素酶解过程的限速步骤，这导致 CBH 成为目
前的研究热点。CBH 是持续性催化酶类，酶分子能
相对线性底物进行单方向运动，在结合底物后至解
离前可执行上千次持续性催化。其具有 2 个独立的
结构域，即 1 个催化功能结构域（Catalytic domain，
CD）和 1 个纤维素结合功能结构域（Cellulose bin-
ding domain，CBD，或称 Carbohydrate binding module，
CBM）。其中 CD 代表 CBH 的催化活性及对特定水
溶性底物的特异性，其活性中心一般为孔道或者是
深陷的凹槽，不同于一般酶分子的开放裂痕型结构，
使其具有持续性酶解能力，其催化糖基转移的机制
与溶菌酶相似，是酸 / 碱催化的双置换机制，在异
头碳原子位通过构型的保留或构型的转化完成催化
反应，其中两个保守的羧基氨基酸分别作为质子供
体和亲核试剂［8，27，28］。CBM 具有维持酶分子的构
象稳定性，调节酶对可溶性、非可溶性底物专一性
活力的作用 ；能疏解结晶纤维素结构的能力，维持
纤维素酶的持续性降解，并利用吸附作用增大酶分
子与底物的结合，辅助外切葡聚糖酶对天然纤维
素底物的接近、定位与干扰等作用［28］。CBH 借助
CBM 的吸附作用，结合并水解结晶纤维素的疏水表
面，识别并解离纤维素链游离的还原末端，游离分
子链还原端进入 CD 催化孔道，形成复合物。每次
水解产生一个纤维二糖，然后发生初步线穿和去结
晶化运动，水解并排出纤维二糖，随后进入下一催
化循环过程进［27］（图 1）。
Ciolacu 等［32］对 CBD 进行吸附和解吸试验发现，ۜॆ㔃ᶴฏ 䘎᧕㛭⻣≤ॆਸ⢙㔃ਸ⁑ඇ䇶࡛≤䀓 ࡍ↕㓯ク৫㔃Ღॆ䟺᭮
图 1 CBH 线穿-释放催化循环
酶解过程中，纤维素酶需要通过 CBD 与结晶纤维素
Ⅰ型结合，使分子间或分子内的氢键断裂，之后酶
解反应开始进行，其吸附动力学受表面积和孔隙率
影响，解吸过程受无定形纤维素的疏水作用和 pH
及温度的影响。Ding［8］、Costaouec［30］和 Lou［31］的
研究发现，木质素会对 CBD 产生非必要性吸附，浪
费部分纤维素酶水解能力，而 CBM 对于纤维素酶降
解可溶性的纤维素没有辅助作用，但是对于结晶纤
维素的降解促进作用表现很明显。
虽然大量的研究成果使人们对纤维素酶的作用
2015,31(5) 23张森翔等：纤维素酶降解秸秆特性及其基因工程研究进展
机制有了更深入的了解，但是纤维素酶在底物上进
行持续性的水解纤维素的催化动力来源仍不明确，
如 CBD 打断分子链间和分子内氢键的动力机制。完
成对 CBH 这种典型的持续性酶的降解机制的原理，
将为人们研究其他类似持续性酶反应过程有一个指
导作用，并对利用分子改造技术提高酶分子转化效
率奠定正确的理论基础。
3 纤维素酶基因工程研究
纤维素酶工业化应用中有两大难题，一是生物
质细胞壁的抗降解屏障极大地制约了木质纤维素的
转化效率 ；二是现有的纤维素酶对于生物质中纤维
素的糖转化能力较低［8］。预处理技术能有效的解决
第一个难题，而第二个难题常见以下 2 种方法，一
种是筛选高效纤维素酶菌株，这是最常见的方法，
如笔者所在实验室筛选的一株高效的产纤维素酶菌
株 Trichoderma viride WUST 01［33］；另一种是采用基
因工程技术构建所需产酶菌株。
昆虫、软体动物、原生动物、细菌、放线菌、
真菌等都可以产生纤维素酶。通常真菌纤维素酶的
产量大，组成复杂，大部分为胞外酶，分离纯化操
作要求低。其中，最有代表性的为里氏木霉。所产
的纤维素酶是完整的纤维素酶复合体系，含有内切
葡聚糖酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，外切葡聚糖酶Ⅰ、Ⅱ，β-葡
萄糖苷酶Ⅰ、Ⅱ［25］。国际著名的纤维素酶制剂生产
公司 Novozyme 和 Genencor 多以里氏木霉为主要产
酶菌株［34］。但是不同霉菌的纤维素酶产量不同，活
性也不相同，如斜卧青霉易分泌较多的 β-葡萄糖苷
酶，里氏木霉分泌较多的外切葡聚糖酶，酶组分比
例并不合理，酶活性较低。而细菌培养基成分简单，
生长周期短，表达蛋白的转化及分离纯化技术易于
操作，其中大肠杆菌最具有代表性，将真菌中的纤
维素酶在细菌中的大量表达是目前纤维素酶基因工
程的一个研究方向。此外，酵母菌作为目前新型生
物能源工业特别是生物乙醇生产中主要菌株，将纤
维素酶基因重组到酵母菌中，可以实现从纤维素到
葡萄糖再到酒精的完整发酵过程，极大地减少中间
步骤，提高转化效率，成为了目前纤维素酶基因工
程的另一个研究方向。表 2 是对当前纤维素酶基因
表 2 部分纤维素酶分泌菌株及其基因工程应用情况
菌名
纤维
素酶
GHa
家族
催化
位点
催化断
键机制 b
空间
结构 c
蛋白质结
构模型 d
表达宿主 酶的性质 文献
Trichoderma reesei EG Ⅰ 7 Glu 保留机制 β-jelly roll
Concanavalin A-like
lectins/glucanases
Pichia pastoris
70 kD，最佳反应条件
为 ：35℃，pH5.0
［35］
Trichoderma reesei
QM9414
BG Ⅱ 1 Glu 保留机制 （β/α）8 - Escherichia coli
酶比活 14 600 mU/mg，
最佳反应条件为 ：
40℃，pH6.0
［36］
Trichoderma viride
EG Ⅴ 45 Asp 反构机制 - Double psi β-barrel Bombyx mori
36 kD，最适反应条件 ：
50℃，pH5.0
［37］
EG Ⅷ 5 Glu 保留机制 （β/α）8 TIM β/α-barrel
Saccharomyces
cerevisiae
438 aa protein，46.86
kD，等电点 4.32，最适
反应条件 ：60℃，pH6.0
［38］
Streptomyces sp. M 23 CBH Ⅱ 6 Asp 反构机制 -
7-stranded β/α
barrel
Streptomyces
lividans TK-24
453 aa protein，45.175
kD
［39］
Penicillium decumbens
114-2
EG Ⅱ 5 Glu 保留机制 （β/α）8 TIM β/α-barrel
Saccharomyces
cerevisiae
411 aa protein，最适反
应条件 ：60℃，pH4.0
［40］
Aspergillus niger
（CMI CC 324262）
BG Ⅰ 3 Asp 保留机制 - -
Saccharomyces
cerevisiae，Pichia
pastoris
92 kD ［41］
Clostridium thermocellum
EG A 8 Asp 反构机制 （α/α）6 α/α toroid Bacillus subtilis 477 aa protein ［42］
EG D 9 Asp 反构机制 （α/α）6 α/α toroid Escherichia coli 449 aa protein，68 kD ［43］
注 ：a ：Glycoside hydrolases ；b ：酶水解底物得立体化学机制，根据异头碳原子位的构型的保留或转化分为保留机制和反构机制 ；c ：3D structure status ；d ：
蛋白质结构分类数据库 ；- ：unclassified
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.524
工程的主要研究情况进行的综合。
半 纤 维 素 酶 基 因 克 隆 研 究 起 步 较 晚， 其 中
xylanase 作为半纤维素的主要成分——木聚糖降解
的关键水解酶研究较多。早期研究认为 xylanase 具
有的特殊密码子，N 末端糖基化及要形成特定的二
硫键，不易在大肠杆菌中功能性表达，后来探究发
现糖基化对木聚糖酶酶活性可能影响不大，其后陆
续有内切木聚糖酶和 β-木聚糖酶于大肠杆菌中表
达［44，45］， 如 Jun 等［46］ 利 用 噬 菌 体 T7 成 功 将
Trichoderma reesei Rut C-30β-木聚糖酶基因 Xyn2（570
bp） 在 E.coli 中 表 达， 所 产 酶 对 于 桦 木 木 聚 糖 有
60% 的水解率，而对麦麸的水解率低于 40%。Le 等［47］
则 利 用 OmsY 蛋 白 成 功 将 一 种 取 自 Thermomyces
lanuginosus 的 热 稳 定 性 高 的 xylanase 于 E.coli 中 表
达，其融合蛋白具有可溶性，不需要 IPTG 诱导表
达，在 pH6.0 和 65℃获得最高活性。而在酵母菌
中，Okada 等［48］ 将 两 种 Trichoderma reesei QM9414
的 xyn1 和 xyn2 在 Schizosaccharomyces pombe 中表达，
分别达到 25 mg/mL 和 170 mg/mL。此外，将木聚糖
酶于高产纤维素酶的丝状真菌表达，也是目前一种
提高真菌酶解能力的方法，Rose 等［49］通过对甘油
醛 -6-磷酸脱氢酶的控制，将 Trichoderma reesei QM6a
的 xyn2 和 eg Ⅰ于 Aspergillus niger 中表达，且两者
在 pH5.0 和 50℃下保持 3 h 后，仍有 80% 以上的酶
活力。Beak 等［50］分别用能表达 T. aurantiacus EGI，T.
reesei CBHII 和 Aspergillus aculeatus BGLI 的 3 种酵母
菌，按最佳酶配比 EGI∶CBHII∶BGLI=6∶2∶1 混
合发酵产乙醇，达到 2.1 g/L 乙醇产量，不过其中缺
少了半纤维酶，对生物质的利用并不完美。一般而言，
半纤维素酶和纤维素酶的反应温度在 45-60℃之间，
只是 pH 要求不同，寻找 pH 相近且酶活较高的纤维
素酶和木聚糖酶，配置合适的酶成分比例，于酵母
工程菌中联合表达，提高对生物质转化的利用率，
可能是一种较好的研究方向。
随着基因工程技术发展，其生物信息学和基
因组学数据的完善，利用蛋白质家族或结构生物信
息学对纤维素酶进行理性设计与进化改造，相较于
过去基于 DNA 序列改组，具有更高的效率，同时
可以有效地避免重组时的结构坍塌，利于快速筛选
出稳定性或其他性能得到提高或改善的突变体。其
中 SCHEMA、ProSAR、ASR 及 ROSETTA 是 较 为
常见的蛋白质空间结构优化的理性设计算法［23］，
其中 SCHMA 法已成功的用于纤维素酶 CBH Ⅰ和
CBH Ⅱ，并分别获得 Humicola insolens、Chaetomium
thermophilum、T. aurantiacus、H. jecorina、Acremon-
ium thermophilum 及 T. emersonii 的高热稳定性变异菌
株［51，52］。
4 结语
能源和环境的压力迫使我国急需将丰富的秸秆
类生物质转化技术产业化，纤维素酶是目前已知对
于该类转化过程中最好的处理方式之一。以纤维素
转化过程中的两大问题为主，前者以预处理技术为
手段，定性定量分析秸秆生物质结构对酶水解转化
率的影响，细化出酶水解的每一步带来的生物质结
构变化，同时要注意对反应后的废物下游技术的研
究。例如，热水解后产生的大量废水，酸碱处理后
水中的有毒物质的处理，后者通过对比不同秸秆中
的结构成分特点，设计能对其产生最大水解效率的
纤维素酶，同时优化选择出具有更高耐受性的工业
生产的菌株，对纤维素酶工业应用进行的深入研究
必将促进我国能源生物技术的发展与应用。
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（责任编辑 狄艳红）