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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(7):91-100
小桐子（Jatropha curcas L.）属大戟科麻疯树属
能源植物［1，2］，原产美洲，现广泛分布于全球的热
带地区，在中国主要集中在四川、云南、广西、海
南、福建等省区［3］。小桐子种子油含量高达 40%-
60%，流动性好，品质优良，是理想的柴油替代
品［4，5］。同时，小桐子还是干热河谷地区保水固土、
防止沙化、增加有机质、构建防护林的优良树种［6］，
极具开发与利用价值。
收稿日期 ：2014-11-05
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31260064，31460059，31460179），云南省教育厅科研基金重大专项项目（ZD2010004）
作者简介 ：王海波，男，博士研究生，研究方向 ：植物逆境生物学 ；E-mail ：bocai0406@163.com
通讯作者 ：龚明，男，博士，教授，博士生导师，研究方向 ：植物逆境生物学 ；E-mail ：gongming63@163.com
小桐子肌醇半乳糖苷合成酶 3 的基因克隆及其生物信息
学分析和功能初步验证
王海波1，2  邹竹荣1  龚明1
（1. 云南师范大学生命科学学院 生物能源持续开发利用教育部工程研究中心 云南省生物质能与环境生物技术重点实验室，昆明 650500 ；
2. 曲靖师范学院生物资源与环境科学学院，曲靖 655011）
摘 要 ： 旨在研究可溶性糖在小桐子抗冷性形成中的作用机制及其相关抗冷基因工程的应用。克隆了小桐子肌醇半乳糖苷
合成酶家族成员 3 基因（JcGS3）的全长 cDNA，序列长 1 053 bp，包含完整的开放阅读框 1 008 bp，编码由 335 个氨基酸组成的
酶蛋白（理论分子量为 38 kD、等电点为 5.44，含有典型的 DxD 基序）。对其相应基因组序列中启动子区域进行分析，鉴定到了
TATA 框、CAAT 框、CRT/DRE 低温响应元件以及 ABA 应答元件等。进一步将其在酵母中表达，发现该基因的表达能够显著提高
其重组酵母菌的低温抵抗能力。
关键词 ： 小桐子 ；肌醇半乳糖苷合成酶 3 ；cDNA 克隆 ；生物信息学分析 ；酵母表达
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.014
Gene Cloning，Bioinformatic Analysis and Preliminary Functional
Characterization of Gene Encoding Galactinol Synthase 3 in
Jatropha curcas
Wang Haibo1，2 Zou Zhurong1 Gong Ming1
（1. School of Life Sciences of Yunnan Normal University，Engineering Research Center of Sustainable Development and Utilization of Biomass
Energy of Ministry of Education，Key Laboratory of Biomass Energy and Environmental Biotechnology of Yunnan Province，Kunming 650500 ；
2. College of Biological Resource and Environmental Science，Qujing Normal University，Qujing 655011）
Abstract: It was to study the roles of soluble sugars in the cold-tolerance of Jatropha curcas and their related applications in genetic
engineering. The full length cDNA of J. curcas, a gene member of such enzyme family（JcGS3）was cloned herein, with a size of 1 053 bp
covering the entire open reading frame（ORF）of 1 008 bp. This ORF encoded a polypeptide of 335 amino acids, with theoretical molecular
weight of 38 kD, pI value of 5.44, and the typical DxD motif. Further promoter analysis of the genomic sequence of JcGS3 indicated the
occurrence of TATA-box, CAAT-box, cold responsive elements of CRT/DRE, and ABA responsive elements. In addition, JcGS3 was characterized
with a significant effect on improving the cold-tolerance of the recombinant yeast strain.
Key words: Jatropha curcas ；galactinol synthase 3 ；cDNA cloning ；bioinformatic analysis ；yeast expression
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.792
在植物中，棉子糖系列寡糖（Raffinose family
oligosaccharides，RFO）是由不同数量的半乳糖基通
过 α-1，6-糖苷键连接到蔗糖中葡萄糖基的 6 位羟基
上形成的，根据连接半乳糖基的数量不同，主要包
括 ：棉子糖（含 1 个半乳糖基）、水苏糖（含 2 个
半乳糖基）和毛蕊花糖（含 3 个半乳糖基）。近年
来的研究表明棉子糖系列寡糖的代谢在植物生长发
育、逆境胁迫反应中发挥重要作用，尤其在种子成
熟脱水过程中可以维持多种蛋白质的稳定性，更为
重要的是寡糖可以促进种子细胞的玻璃化、避免脱
水对细胞的伤害［7］。同时，棉子糖系列寡糖在植物
冷驯化中也起到重要作用，很多研究已经证实低温
导致植物叶片和种子中淀粉含量下降，而蔗糖和棉
子糖系列寡糖含量升高。棉子糖系列寡糖的积累，
特别是位于叶绿体外的寡糖，其通过储存碳源、渗
透调节以及为植物提供低温保护剂等功能，对于植
物抵抗低温环境有着重要帮助［8］。在棉子糖系列寡
糖合成途径中，肌醇半乳糖苷（Galaetinol）是目前
所知的唯一的半乳糖基供体，肌醇半乳糖苷合成酶
（Galaetinol synthase，GS，EC 2.4.l.123）催化肌醇半
乳糖苷的合成，被认为是棉子糖系列寡糖合成的关
键酶，其催化反应是寡糖积累的限速步骤。我们先
前通过 RNA-Seq 技术获得了小桐子低温锻炼下的转
录组和数字基因表达谱数据，从中筛选到在低温锻
炼过程中差异表达变化非常显著的小桐子肌醇半乳
糖苷合成酶 3 基因［9，10］。在此基础上，本研究进一
步克隆其全长 cDNA 序列，并对其进行比较完整的
生物信息学分析和转基因酵母的抗冷性功能初步验
证，以期为研究可溶性糖在小桐子抗冷性形成中的
作用机制奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料及处理 供试小桐子种子取自云南
省楚雄州元谋县。选取饱满的小桐子种子，用 1.5%
CuSO4 消毒 20 min，无菌水漂洗 5 次，于 26℃的恒
温培养箱中吸涨 24 h［11］。将吸涨的种子在无菌水中
漂洗 3 次，播于垫有 5 层用无菌水湿润滤纸的白磁
盘中，于相对湿度（RH）75%、26/20℃、16/8 h 光
周期的恒温培养箱中萌发 5 d。将发芽的种子播于
消毒的培养土中，并于同样设置条件下的恒温培养
箱中生长 15 d 至第 2 片真叶展开，每天用无菌水润
湿培养土。将生长 15 d 的小桐子幼苗置于相对湿度
（RH）75%、12℃、16/8 h 光周期的低温培养箱中进
行低温锻炼处理，分别取低温锻炼 12、24 和 48 h
与对照（正常培养）的第 2 片真叶，用铝箔纸包好，
液氮速冻后保存于 -80℃冰箱中用于 RNA 的提取。
1.1.2 菌株与主要试剂 大肠杆菌 Trans1-T1（DH-
5α）、BL21（DE3）及酵母菌 INVSc1 菌株由本实验
室保存 ；TransZol Up、DNase I、TransStart Taq DNA
Polymerase、氨苄青霉素（Amp）、X-gal、IPTG、2×
Easy Taq PCR SuperMix（+dye）、TransScript Two-Step
RT-PCR SuperMix、EasyPure Quick Gel Extraction Kit、
EasyPure Plasmid MiniPrep Kit、pEASY-T1 Cloning
Kit、pEASY-E1 Expression Kit、Trans 2K Plus II DNA
Marker 购自北京全式金生物技术有限公司 ；BamH I、
Xho I 限制性内切酶购自大连宝生物公司 ；引物合成
和测序由深圳华大基因有限公司完成。
1.2 方法
1.2.1 总 RNA 的提取及 cDNA 第一链的合成 利
用 TransZol Up 试剂提取小桐子 12℃低温锻炼 24 h
叶片的总 RNA，并利用 DNase I 消化 RNA 中的基
因组 DNA，得到纯化的总 RNA。以 Anchored Oligo
（dT）18 为 逆 转 录 引 物， 利 用 TransScript Two-Step
RT-PCR SuperMix 合成第一链 cDNA。
1.2.2 小桐子 JcGS3 基因全长 cDNA 的克隆 我们先
前获得了小桐子低温锻炼转录组和数字基因表达谱
数据，从中发现低温下差异表达变化非常显著的小
桐子肌醇半乳糖苷合成酶 3 基因（CL2440.Contig2_
JC-CK_1A）［9］。该基因序列长 1 463 bp，包含完整
ORF 编码框（1 008 bp）。以此序列为基础设计全长
扩增引物（上游 F ：5-TTCTTCTTTCCAAACTCG-3 ；
下 游 R ：5-TATAATCCACAACCACAT-3）， 并 送 深
圳华大基因公司合成。
以 1.2.1 反转录的 cDNA 为模板，使用热启动双
封 闭 DNA 聚 合 酶 TransStart Taq DNA Polymerase 进
行 PCR 扩增，扩增条件为 ：94℃ 5 min ；94℃ 30 s，
50.7℃ 30 s，72℃ 1.5 min，35 个循环 ；72℃ 10 min。
扩增完成后用 1% 的琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物，
2015,31(7) 93王海波等 ：小桐子肌醇半乳糖苷合成酶 3 的基因克隆及其生物信息学分析和功能初步验证
利用 EasyPure Quick Gel Extraction Kit 从琼脂糖凝胶
回收目的基因条带（1 053 bp）。将目的基因片段与
克隆载体 pEASY-T1 连接，转化大肠杆菌 Trans1-T1
感 受 态 细 胞， 涂 LB 抗 性 平 板（LB+Amp+IPTG+X-
gal），过夜生长，进行蓝白斑筛选。挑取白斑克隆，
进行菌落 PCR 验证，重组质粒命名为 pEASY-T1-
JcGS3，送深圳华大基因公司利用 pEASY-T1 质粒上
的 M13F 与 M13R 通用引物进行双向测序。
1.2.3 小 桐 子 JcGS3 基 因 的 生 物 信 息 学 分 析 对
于小桐子 JcGS3 基因的推导蛋白，利用在线工具
ProtParam 计算蛋白质的理论分子量、等电点等基本
参数 ；利用 WolfSport 在线软件对蛋白质亚细胞定位
进行预测 ；利用 SignalP 3.0 Server 分析蛋白质信号
肽序列 ；利用在线工具 TMHMM 与 Proscale 检测其
跨膜结构与亲水 / 疏水特性 ；利用 NCBI CDD 工具
进行结构域与功能元件的鉴定 ；利用 Swiss-Model 与
Phyre2 进行蛋白质三维结构的同源建模，利用 VMD
软件显示其三维空间结构，并结合 Ramachandram 图
验证其准确性。从 NCBI 下载其它物种的 GS 氨基酸
序列，利用 ClustalX 进行序列相似性比对，然后用
MEGA4.0 软件通过邻接法构建系统进化树，并采用
泊松法进行检验。利用 Spidey 软件将克隆的 JcGS3
cDNA 序列与其对应基因组序列（小桐子基因组数
据库 http ：//www.kazusa.or.jp/jatropha/）进行比对以
确定基因内含子与外显子的结构，同时利用在线软
件 PlantCARE 与 PLACE 进行启动子顺式作用元件的
分析。
1.2.4 小桐子 JcGS3 基因酵母表达载体的构建、转
化及功能验证 利用 BamH I 与 Xho I 双酶切质粒
pEASY-T1-JcGS3 与酵母表达载体 pYES2，切胶回收
JcGS3 片段与 pYES2 的酶切大片段，T4 DNA 连接酶
22℃连接 5 h，转化大肠杆菌 DH5α 感受态细胞，涂
LB+Amp 平板，过夜生长，经菌落 PCR 验证的阳性
克隆命名为 pYES2-JcGS3。提取重组酵母表达质粒
pYES2-JcGS3，转化酿酒酵母野生型菌株 INVSc1，
命 名 为 INVSc1-pYES2-JcGS3 ；同 时 将 对 照 空 载 体
pYES2 质粒也转化 INVSc1，命名为 INVSc1-pYES2 ；
通过酵母菌落 PCR 验证以确定阳性克隆。
分别挑取重组酵母 INVSc1-pYES2-JcGS3 及对照
INVSc1-pYES2 单菌落，接种于 15 mL YPD 培养基中，
30℃振荡过夜培养。用 YPD 培养基调至 OD600=0.4-
0.6，取 20 mL 菌液于 8 000 r/min 离心 1 min，弃上
清，用 20 mL YPG 诱导培养基重悬菌体，30℃诱导
表达 24-36 h 至 OD600>2.0。取诱导表达菌液 2 mL 至
60 mL YPG 诱导培养基中，调菌液 OD600=0.2，在正
常 30℃条件下或 18℃低温条件下继续振荡培养，每
3 h 间隔取样，测定样品的 OD600 值。以时间为横坐标，
OD600 为纵坐标，绘制酵母菌的生长曲线，比较重
组酵母菌与对照酵母菌在正常和低温条件下的生长
差异。
2 结果
2.1 小桐子JcGS3基因全长cDNA的克隆
以小桐子 12℃低温锻炼 24 h 的叶片材料提取总
RNA，并反转录成 cDNA 为模板，利用 JcGS3 上下
游引物扩增 JcGS3 基因的全长 cDNA。结果表明，扩
增产物约 1.1 kb，与预期大小一致（图 1-A）。将目
的条带切胶回收后与 T/A 克隆载体 pEASY-T1 连接、
转化大肠杆菌，并经菌落 PCR 鉴定（图 1-B），阳性
克隆命名为 pEASY-T1-JcGS3，接菌提取其质粒 DNA
（图 1-C）。
2.2 小桐子JcGS3基因的生物信息学分析
经 过 测 序， 克 隆 的 JcGS3 基 因 cDNA 序 列 全
长 为 1 053 bp， 已 提 交 至 NCBI GenBank（ 登 录 号
KJ670151.1）。 利 用 NCBI ORFfinder 分 析 表 明 其 包
含完整的开放阅读框（ORF）1 008 bp，编码一个由
335 个氨基酸（aa）组成的蛋白（图 2），其理论分
子量推测为 38 kD、等电点为 5.44。SOPM 服务器分
析该蛋白的二级结构，α-螺旋 109 aa，占 32.54% ；
β-折叠 76 aa，占 22.69％ ；β-转角 33 aa，占 9.85% ；
无规则卷曲 117 aa，占 34.93%。预测分析该蛋白质
没有信号肽、疏水区域及跨膜区的存在，说明该蛋
白质属于可溶性胞质蛋白，这与 PSORT 预测该蛋白
质主要定位在细胞质中相一致。
利用克隆得到的 JcGS3 cDNA 序列，对小桐子
基因组数据库（http ：//www.kazusa.or.jp/jatropha/）进
行在线 Blast 检索，得到其对应的基因组序列，发
现 JcGS3 基因包含 4 个外显子与 3 个内含子。同时，
也获取了该基因 ORF 上游 1 000 bp 的启动子序列，
利用在线软件 PlantCARE 与 PLACE 对其进行了顺式
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.794
作用元件分析发现，启动子区域转录因子结合位点
较多，调控特性也很复杂（图 3）。具备多个 TATA-
box，TATA-box 是 RNA 聚合酶 II 结合位点，保证转
录的精确起始，并调控上游激活蛋白的作用 ；同时，
其上游还包含多个 CAAT-box，CAAT-box 主要控制
转录起始的频率并增强转录活性。以上两个顺式作
用元件是启动子、增强子区域常见的作用元件，小
桐子 JcGS3 基因均具有。另外，还鉴定到植物特有
的 CRT/DRE 冷 响 应 元 件（CCGAC）， 以 及 脱 落 酸
（ABA） 应 答 元 件， 如 ABRE（PyCGTGGC）、MYB
1
91
181
271
361
451
541
631
721
811
901
991
起始密码子（ATG）与终止密码子（TAG）用下划线标注
图 2 小桐子 JcGS3 cDNA 与推导的氨基酸序列
CRT/DRE 䖜ᖅ䎧࿻ս⛩MYCR ABRETATA box-914 -910 -825 -818 -763 -707 -662 -264 -149 +1 JcGS3ATG-174-231
图 3 小桐子 JcGS3 基因启动子的顺式作用元件
A ：PCR 扩增 ；B ：菌落 PCR 鉴定 ；C ：重组质粒 pEASY-T1-JcGS3
图 1 小桐子 JcGS3 基因的 cDNA 克隆
5000
bp
M
3000
2000
1000
750
500
250
100
5000
bp
M
3000
1000
750
500
250
2000
5000
10000
bp
M
3000
2000
1500
800
500
300
A B C
2015,31(7) 95王海波等 ：小桐子肌醇半乳糖苷合成酶 3 的基因克隆及其生物信息学分析和功能初步验证
（PyAACT/GC）和 MYC（CANNTG）。除此以外，还
鉴定出的元件，包括 ASF、CCAAT-box、GATA-box、
W-box 等顺式作用元件。以上充分说明小桐子 JcGS3
基因是受多重信号系统的调节。
通过与 NCBI 中不同植物 GS 氨基酸序列进行
比对分析（图 4-A）发现，GS 氨基酸序列在 N 端和
C 端变化差异较大，而中间部位与 C 末端（PSAA）
的氨基酸残基则较为保守。小桐子 GS3 中存在一个
DxD 基 序（DGD，Asp121-Gly122-Asp123 位 ）， 该 基 序
是此类蛋白质的共同基序，也是 Ca2+、Mn2+ 的结合
位点（Asp121、Asp123、His258）。在 N 端还发现一个
β-α-β 超二级结构（图 4 中用 M 标识），这也是该类
蛋白催化所必须的。进一步通过 CDD 工具进行保守
结构域预测分析（图 4-B）发现，JcGS3 酶蛋白包含
RfaJ 结构域，该结构域具有脂多糖的合成活性及葡
萄糖基转移酶活性，同时还鉴定到 GAT 结构域。小
桐子 JcGS3 属于 GT8 糖基转移酶家族，该家族中除
了转移葡萄糖残基外，还可以转移半乳糖残基，另
外具有糖链分支的能力，负责形成脂多糖、寡聚糖
等。通过 CDD 比对已经测定结构的 GS3 蛋白，推测
小桐子 GS3 蛋白的催化活性中心由 19 个氨基酸残
基组成（图 4 中用 * 号标注），与文献报道的一致。
为 了 进 一 步 阐 明 植 物 GS 的 进 化 关 系， 通 过
ClustalW 软件对不同植物 GS 氨基酸序列进行了更广
泛的多重比对分析，并使用 MEGA 软件以邻接法构
建了其系统进化树（图 5）。生成的进化树分成两大
主要分支 ：在分支 I 中，单子叶植物与双子叶植物
都有 ；而在分支 II 中，全部是双子叶植物，小桐子
JcGS3 蛋白也归为 II 类。部分物种 GS 家族中的不同
成员出现在不同大分支中，如 ：拟南芥在两种类型
中基本数量一致，而与小桐子在进化上较近的毛果
杨，有很大一部分分布于 I 类型中。这些结果说明
植物 GS 在进化过程中不是平行渐进分化的，而是
表现出不同程度的跳跃进化。
根据已经测定的人类 GS 蛋白的晶体结构进行
小桐子 GS3 蛋白质三维结构的同源建模，发现该蛋
白质不仅在一级氨基酸序列非常保守，而且在空间
结构上更加保守 ：核心 7 条基本平行的 β-折叠构成
一个保守结构域，周围则由 5 段进化上不太保守但
不可或缺的 α-螺旋围绕形成（图 6-A）。在 β-折叠片
层的中间凹陷部位被认为是该酶的催化中心部位，
也是结合半乳糖与蔗糖的活性中心。
Ramachandran plots 是 反 映 立 体 化 学 质 量
（Stereochemical quality）的参数。通过分析 φ 角和 ψ
角的分布方式对模拟的三维结构是否与自然结构趋
势相同进行评估，蓝线区域是最理想的 φ 角和 ψ 角
分布区域，而蓝线区域外部则为不合理区域。如果
预测的蛋白质残基的二面角有 90% 以上位于蓝线
区域，则表明其有稳定的空间结构。图 6-B 显示，
构建的小桐子 GS3 蛋白三维结构的 φ 角和 ψ 角有
95.8% 位于 Ramachandran 图中能量稳定区域，表明
该结构是可靠的。
2.3 通过酵母表达初步验证小桐子JcGS3的功能
将 小 桐 子 JcGS3 基 因 通 过 BamH I 与 Xho I 双
酶切克隆到酵母表达质粒 pYES2 中，获得其重组酵
母表达载体 pYES2-JcGS3（图 7）。随后将其转化酵
母菌 INVSc1，利用 JcGS3 上下游引物进行酵母菌落
PCR 鉴定，结果（图 8）表明该重组酵母表达质粒
已经成功转化酵母。
通过比较重组酵母菌 INVSc1-pYES2-JcGS3 与对
照酵母菌 INVSc1-pYES2 的生长曲线（图 9）发现，
在无胁迫条件下，两者的生长速率基本相似，且几
乎不存在停滞期而直接进入对数生长期，在 27 h 时
基本进入稳定平台期，这表明正常条件下 JcGS3 基
因的表达对酵母菌生长几乎没有影响（图 9-A）。在
18℃低温胁迫条件下，JcGS3 重组酵母菌与对照酵
母菌刚开始都出现了约 3 h 的生长停滞期，之后逐
渐进入对数生长期 ；与对照相比，JcGS3 重组酵母
菌在生长的前 6 h 生长速率基本相同，之后到进入
平台期的 24 h 内，JcGS3 重组酵母菌的生长速率明
显快于对照（图 9-B）。另外，JcGS3 重组酵母菌在
进入平台期后，对照酵母菌虽受低温胁迫，但仍保
持生长的趋势，进入平台期的时间要稍晚 3-6 h。该
结果清楚表明 JcGS3 基因在酵母中过量表达能够显
著增强酵母菌的低温抵抗能力，与抗冷性直接相关。
3 讨论
植物在低温胁迫下，碳素同化总量下降，但可
溶性糖增加，这样可以降低植物细胞的渗透势以抵
抗逆境［12，13］。此过程不仅在于可溶性糖参与细胞
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.796
20A
B
40 60
100 120 140 160
M3M2M1
180
200 220
# #
* * * *
240 260 280
300
* * * * * * * * *
320 340
#
** *
80
Populus_trichocarpa_1 ˖
Populus_trichocarpa_2 ˖
Populus_trichocarpa_3 ˖
Jatropha_curcas_3 ˖
Capsicum_annuum ˖
Solanum_commersonii ˖
Manihot_esculenta ˖
Xerophyta_viscosa ˖
Camellia_sinensis ˖
Castanea_sativa ˖
Verbascum_phoeniceum_1 ˖
Verbascum_phoeniceum_2 ˖
Zea_mays_1 ˖
Zea_mays_3 ˖
Zea_mays_2 ˖
Salvia_miltiorrhiza_2 ˖
Boea_hygrometrica ˖
Ammopiptanthus_nanus ˖
Medicago_sativa ˖
Glycine_max ˖
Arabidopsis_thaliana_2 ˖
Arabidopsis_thaliana_3 ˖
Coffea_arabica ˖
Solanum_lycopersicum_1 ˖
85
85
85
84
84
76
84
83
89
87
75
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86
89
86
86
85
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85
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76
85
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Populus_trichocarpa_1 ˖
Populus_trichocarpa_2 ˖
Populus_trichocarpa_3 ˖
Jatropha_curcas_3 ˖
Capsicum_annuum ˖
Solanum_commersonii ˖
Manihot_esculenta ˖
Xerophyta_viscosa ˖
Camellia_sinensis ˖
Castanea_sativa ˖
Verbascum_phoeniceum_1 ˖
Verbascum_phoeniceum_2 ˖
Zea_mays_1 ˖
Zea_mays_3 ˖
Zea_mays_2 ˖
Salvia_miltiorrhiza_2 ˖
Boea_hygrometrica ˖
Ammopiptanthus_nanus ˖
Medicago_sativa ˖
Glycine_max ˖
Arabidopsis_thaliana_2 ˖
Arabidopsis_thaliana_3 ˖
Coffea_arabica ˖
Solanum_lycopersicum_1 ˖
175
175
175
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176
176
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Populus_trichocarpa_1 ˖
Populus_trichocarpa_2 ˖
Populus_trichocarpa_3 ˖
Jatropha_curcas_3 ˖
Capsicum_annuum ˖
Solanum_commersonii ˖
Manihot_esculenta ˖
Xerophyta_viscosa ˖
Camellia_sinensis ˖
Castanea_sativa ˖
Verbascum_phoeniceum_1 ˖
Verbascum_phoeniceum_2 ˖
Zea_mays_1 ˖
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Zea_mays_2 ˖
Salvia_miltiorrhiza_2 ˖
Boea_hygrometrica ˖
Ammopiptanthus_nanus ˖
Medicago_sativa ˖
Glycine_max ˖
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Arabidopsis_thaliana_3 ˖
Coffea_arabica ˖
Solanum_lycopersicum_1 ˖
269
269
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Populus_trichocarpa_1 ˖
Populus_trichocarpa_2 ˖
Populus_trichocarpa_3 ˖
Jatropha_curcas_3 ˖
Capsicum_annuum ˖
Solanum_commersonii ˖
Manihot_esculenta ˖
Xerophyta_viscosa ˖
Camellia_sinensis ˖
Castanea_sativa ˖
Verbascum_phoeniceum_1 ˖
Verbascum_phoeniceum_2 ˖
Zea_mays_1 ˖
Zea_mays_3 ˖
Zea_mays_2 ˖
Salvia_miltiorrhiza_2 ˖
Boea_hygrometrica ˖
Ammopiptanthus_nanus ˖
Medicago_sativa ˖
Glycine_max ˖
Arabidopsis_thaliana_2 ˖
Arabidopsis_thaliana_3 ˖
Coffea_arabica ˖
Solanum_lycopersicum_1 ˖
334
337
334
335
336
336
335
337
339
337
325
328
344
345
348
330
334
328
325
328
335
334
344
318
1 50 100
* *
swbstrate binding site
dimer interface
Manganese binding site
GT8_Glycogenin
Glyco_tranf_GTA_type superfamily
RfaJ
150 200 250 300 335
2015,31(7) 97王海波等 ：小桐子肌醇半乳糖苷合成酶 3 的基因克隆及其生物信息学分析和功能初步验证
双横线表示“β-α-β”超二级结构（M1、M2、M3）；组成活性中心的 19 个氨基酸残基用“*”表示；DxD 基序用单横线表示；Ca2+、Mn2+ 结合位点用“#”表示；
涉及的物种：沙冬青（Ammopiptanthus mongolicus），拟南芥（Arabidopsis thaliana），牛耳草（Boea hygrometrica），甘蓝型油菜（Brassica napus），茶树（Camellia
sinensis），辣椒（Capsicum annuum），欧洲板栗（Castanea sativa），阿拉伯咖啡（Coffea Arabica），大豆（Glycine max），小桐子（Jatropha curcas），木薯
（Manihot esculenta），紫花苜蓿（Medicago sativa），毛果杨（Populus trichocarpa），丹参（Salvia miltiorrhiza），马铃薯（Solanum commersonii），番茄（Solanum
lycopersicum），紫毛蕊花（Verbascum phoeniceum），复活草（Xerophyta viscose），玉米（Zea mays），下同
图 4 小桐子 JcGS3 推导氨基酸序列与其它植物 GS 的多重序列比对（A）及其 CDD 预测（B）
20A
B
40 60
100 120 140 160
M3M2M1
180
200 220
# #
* * * *
240 260 280
300
* * * * * * * * *
320 340
#
** *
80
Populus_trichocarpa_1 ˖
Populus_trichocarpa_2 ˖
Populus_trichocarpa_3 ˖
Jatropha_curcas_3 ˖
Capsicum_annuum ˖
Solanum_commersonii ˖
Manihot_esculenta ˖
Xerophyta_viscosa ˖
Camellia_sinensis ˖
Castanea_sativa ˖
Verbascum_phoeniceum_1 ˖
Verbascum_phoeniceum_2 ˖
Zea_mays_1 ˖
Zea_mays_3 ˖
Zea_mays_2 ˖
Salvia_miltiorrhiza_2 ˖
Boea_hygrometrica ˖
Ammopiptanthus_nanus ˖
Medicago_sativa ˖
Glycine_max ˖
Arabidopsis_thaliana_2 ˖
Arabidopsis_thaliana_3 ˖
Coffea_arabica ˖
Solanum_lycopersicum_1 ˖
85
85
85
84
84
76
84
83
89
87
75
81
85
86
89
86
86
85
82
85
82
76
85
80
Populus_trichocarpa_1 ˖
Populus_trichocarpa_2 ˖
Populus_trichocarpa_3 ˖
Jatropha_curcas_3 ˖
Capsicum_annuum ˖
Solanum_commersonii ˖
Manihot_esculenta ˖
Xerophyta_viscosa ˖
Camellia_sinensis ˖
Castanea_sativa ˖
Verbascum_phoeniceum_1 ˖
Verbascum_phoeniceum_2 ˖
Zea_mays_1 ˖
Zea_mays_3 ˖
Zea_mays_2 ˖
Salvia_miltiorrhiza_2 ˖
Boea_hygrometrica ˖
Ammopiptanthus_nanus ˖
Medicago_sativa ˖
Glycine_max ˖
Arabidopsis_thaliana_2 ˖
Arabidopsis_thaliana_3 ˖
Coffea_arabica ˖
Solanum_lycopersicum_1 ˖
175
175
175
174
174
167
174
173
179
177
165
171
176
179
182
176
176
175
172
175
173
167
175
160
Populus_trichocarpa_1 ˖
Populus_trichocarpa_2 ˖
Populus_trichocarpa_3 ˖
Jatropha_curcas_3 ˖
Capsicum_annuum ˖
Solanum_commersonii ˖
Manihot_esculenta ˖
Xerophyta_viscosa ˖
Camellia_sinensis ˖
Castanea_sativa ˖
Verbascum_phoeniceum_1 ˖
Verbascum_phoeniceum_2 ˖
Zea_mays_1 ˖
Zea_mays_3 ˖
Zea_mays_2 ˖
Salvia_miltiorrhiza_2 ˖
Boea_hygrometrica ˖
Ammopiptanthus_nanus ˖
Medicago_sativa ˖
Glycine_max ˖
Arabidopsis_thaliana_2 ˖
Arabidopsis_thaliana_3 ˖
Coffea_arabica ˖
Solanum_lycopersicum_1 ˖
269
269
269
268
268
261
268
267
273
271
259
265
270
273
276
270
270
269
266
269
267
261
269
254
Populus_trichocarpa_1 ˖
Populus_trichocarpa_2 ˖
Populus_trichocarpa_3 ˖
Jatropha_curcas_3 ˖
Capsicum_annuum ˖
Solanum_commersonii ˖
Manihot_esculenta ˖
Xerophyta_viscosa ˖
Camellia_sinensis ˖
Castanea_sativa ˖
Verbascum_phoeniceum_1 ˖
Verbascum_phoeniceum_2 ˖
Zea_mays_1 ˖
Zea_mays_3 ˖
Zea_mays_2 ˖
Salvia_miltiorrhiza_2 ˖
Boea_hygrometrica ˖
Ammopiptanthus_nanus ˖
Medicago_sativa ˖
Glycine_max ˖
Arabidopsis_thaliana_2 ˖
Arabidopsis_thaliana_3 ˖
Coffea_arabica ˖
Solanum_lycopersicum_1 ˖
334
337
334
335
336
336
335
337
339
337
325
328
344
345
348
330
334
328
325
328
335
334
344
318
1 50 100
* *
swbstrate binding site
dimer interface
Manganese binding site
GT8_Glycogenin
Glyco_tranf_GTA_type superfamily
RfaJ
150 200 250 300 335
Populus trichocarpa 6
Populus trichocarpa 8
Salvia miltiorhiza 3
Arabidopsis thaliana 1
Brassica napus
Xerophyta viscosa
Zea mays 1
Zea mays 3
Zea mays 2
Arabidopsis thaliana 4
Arabidopsis thaliana 7
Verbasoum phceiceum 1
Verbasoum phceiceum 2
Camellia sinensis
Castanea sativa
Populus trichocarpa 4
Pbpulus trichoc arpa 9
Ammopiptanthus mongolicus
Ammopiptanthus nanus
Manihct escutenta
Solanum commersonii
Glycine max
Medicago sativa
Salvia miltiontiza 2
Boea hygrometrica
Arabidopsis thaliana 2
Arabidopsis thaliana 3
Coffea arabica
Capsicum annuum
Solanum lycopersicum 2
Jatropha curcas 3
Populus trichocarpa 3
Populus trichocarpa 2
Populus trichocarpa 1
Populus trichocarpa 5
Populus trichocarpa 7
0.05
100
100
100
100
100
100
100
100
99
99
89
57
51
56
27
41
75
72
99
87
70
56
44
18
46
99
65
86
981410
10
26
19
65
Arabiodopsis thaliana 10
Arabiodopsis thaliana 5
Arabiodopsis thaliana 6
Solanum lycopersicum 1
II
I
图 5 通过 ClustalW 序列比对和 MEGA4.0 邻接法构建的植物 GS3 进化树
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.798
的渗透调节作用，更重要的原因可能在于许多可溶
性糖是植物适应环境的信号物质［14］。淀粉分解与
棉子糖系列寡糖合成代谢是诸多可溶性糖积累的枢
纽。在拟南芥中，Kaplan 等［15］通过代谢动力学研
究表明，低温胁迫下第一个含量直接增加的碳水化
合物是由淀粉经 β-淀粉酶水解而来的麦芽糖和麦芽
三糖，紧接着是 6-磷酸葡萄糖和 6-磷酸果糖，接下
来是蔗糖、以及葡萄糖和果糖。另外，肌醇半乳糖、
海藻糖、棉子糖以及水苏糖等低聚糖在之后的渗透
调节中起更重要的作用［12］。而作为棉子糖系列寡糖
合成中半乳糖基供体的肌醇半乳糖苷是此类低聚糖
合成的关键底物，催化它生成的肌醇半乳糖苷合成
酶（GS）已被认为是此代谢途径的限速关键酶。已
报道的 GS 为分子量在 36-38 kD 的单体蛋白，活性
最适 pH 为 7-8，且活性可进一步被 DDT（二硫苏糖
醇）和低浓度的 MnCl2 增强。GS 对其底物 UDP-半
乳糖和肌醇的米氏常数分别为 0.16-1.8 mmol/L 和
4.0-6.5 mmol/L，对 UDP-半乳糖和肌醇具有很强的
专一性，而对 ADP-Gal、GDP-Gal 等糖类或肌醇的
差向异构体均无作用［16］。
肌醇半乳糖苷合成酶属于多基因家族，已经报
道在拟南芥［17］、紫花苜蓿［18］、番茄［19］、玉米［20］
180
120
60
0Ps
i
-60
-120
-180
-180 -120 -60 0
Phi
60 120 180
A B
A ：三维结构卡通模型 ；B ：Ramachandran 能量图
图 6 同源建模得到的小桐子 JcGS3 蛋白三维空间结构
8000
A
bp
M
5000
3000
2000
1000
750
250
500
100
8000
B
bp
M
5000
3000
2000
1000
750
250
500
100
8000
C
bp
M
5000
3000
2000
1000
750
250
500
100
8000
D
bp
M
5000
3000
2000
1000
750
250
500
100
A ：BamH I 与 Xho I 双酶切目的基因片段 ；B ：BamH I 与 Xho I 双酶切 pYES2 ；C ：转化 DH5α 后菌落 PCR 验证 ；D ：提取的重组质粒 pYES2-JcGS3
图 7 pYES2-JcGS3 重组质粒的构建
bp
M
5000
3000
2000
1000
750
250
500
图 8 转 pYES2-JcGS3 重组酵母 INVSc1 的菌落 PCR 验证
2015,31(7) 99王海波等 ：小桐子肌醇半乳糖苷合成酶 3 的基因克隆及其生物信息学分析和功能初步验证
2.5A
B
2.0
1.0
O
D
60
0
1.5
0
0 3 6 9 12 15 18ᰦ䰤/h 21 24 27 30 330.5
2.5
2.0
1.0
O
D
60
0
1.5
0
0 3 6 9 12 15 18ᰦ䰤/h 21 24 27 300.5
pYES2
pYES2-GS3
pYES2
pYES2-GS3
图 9 重组酵母菌 INVSc1-pYES2-JcGS3 与对照酵母菌
INVSc1-pYES2 在无胁迫（A）与 18℃低温胁迫（B）
条件下的生长曲线
等植物中克隆到 GS 基因 40 多个。目前，在拟南
芥中发现了 10 个编码 GS 的基因，其中有 3 个基因
产物只存在于成熟后的种子中，AtGS1 与 AtGS2 受
干旱和高盐胁迫的诱导，但对低温没有响应，而
AtGS3 只在低温条件下被诱导表达［17］。玉米基因组
分析表明它含有 3 个 GS 基因，主要在种子成熟组
织中表达［20］。低温胁迫下，匍匐筋骨草的叶肉细胞
和韧皮部细胞中 GS1 与 GS2 表达上调，很大程度上
提高了其抗冷性［21］。Cunningham 等［18］从紫花苜蓿
（Medicago sativa）宿根中克隆得到一条长度为 1 326
bp 的 GS 全长 cDNA，编码 325 个氨基酸。实验表
明，未经低温处理的紫花苜蓿宿根中没有 GS 基因
表达，而将植株转移至低温环境则开始转录，并且
在 2℃下持续 2 d 后达到最大表达量，转移至常温
后，转录量再次减少直至消失。我们最近通过数字
基因表达谱分析发现，小桐子肌醇半乳糖苷合成酶
3 基因（CL2440.Contig2_JC-CK_1A）在 12℃低温锻
炼 12 h 后表达上调近 467.88 倍［9］，本研究中该基因
JcGS3 在酵母中过量表达能显著增强重组酵母菌的
低温抵抗能力，推测该酶能在酵母中催化合成一系
列起渗透调节作用的低聚糖类物质从而提高酵母的
抗冷性。这些研究事实充分表明，GS 与植物抗冷性
密切相关。但是，植物 GS 作为一个大家族，只有
部分 GS 基因的表达直接参与植物抗冷性形成，很多
与之相关的抗逆性存在交叉性，即不同的 GS 基因
可以被不同的逆境条件所诱导，同一逆境又可以同
时诱导多种 GS 基因的表达，所以对于小桐子 JcGS3
基因进行交叉抗逆性及差异表达特性研究进而获得
转基因小桐子株系是未来的研究方向。
4 结论
本研究基于我们获得的小桐子低温锻炼下的转
录组和数字基因表达谱数据，筛选到低温下差异表
达变化较显著的小桐子肌醇半乳糖苷合成酶 3 基因
JcGS3，并利用 RT-PCR 技术成功克隆到该基因。序
列分析表明，其包含 1 008 bp 的开放阅读框，编码
335 个氨基酸，理论分子量为 38 kD，等电点为 5.44。
生物信息学预测显示，该蛋白质没有信号肽、疏水
区域及跨膜区的存在，主要定位在细胞质中 ；启动
子序列中鉴定到了多个 TATA 框、CAAT 框、CRT/
DRE 冷响应元件、脱落酸（ABA）应答元件 ；包含
GT8 糖基转移酶家族的典型 RfaJ 与 GAT 结构域。将
JcGS3 基因构建了酵母表达载体，发现该基因的表
达能够显著提高其重组酵母菌的低温抵抗能力。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）