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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第5期
土壤盐渍化影响着人类的农业生产，生态环境
也面临着严峻的挑战。联合国粮农组织（FAO）和
联合国教科文组织（UNESCO）对地球土壤进行分析，
得出全世界约 1.5 亿 hm2 的耕地，0.77 亿 hm2 受到
盐化的影响［1］。我国的盐化地约 2 000 万 hm2，次
生盐化土壤约 670 万 hm2，约占全国耕地总面积的
14%，次生盐化土壤面积每年以 3% 的速度扩大［2］。
种子的萌发是植物生长的最关键时期，在一定
的温度、水分、湿度条件下萌发时蛋白质的变化反
映了植物基因组从休止到开启的表达情况［3］。近年
收稿日期 ： 2012-12-24
基金项目 ：山西省自然科学基金项目（2009011044-2），山西省高等学校大学生创新创业项目（2011159）
作者简介 ：刘向标，男，硕士研究生，研究方向 ：生物化学 ；E-mail ：lxb-19860112@163.com
通讯作者 ：段江燕，女，教授，硕士生导师，研究方向 ：生物化学 ；E-mail ：duanjiangyan @163.com
NaCl 胁迫对小麦种子胚在萌发时期蛋白含量的影响
刘向标  牛文婷  段江燕
（山西师范大学生命科学学院，临汾 041000）
摘 要 : 为比较不同浓度盐胁迫下小麦种子萌发前期胚蛋白表达情况，以“晋麦 -47”为试验材料。选取经 0、0.1 和 0.2
mol/L 处理过的种子，采用 2-DE 技术对 3 个浓度下胚蛋白含量变化进行研究。通过 PDQuest 图像分析软件分析盐胁迫下蛋白含
量的变化，检测到正常的种子胚有 121 个点，0.1 mol/L NaCl 胁迫下有 32 个蛋白点丰度下调，21 个蛋白点丰度上调 ；在 0.2 mol/L
NaCl 胁迫下，检测到 46 个蛋白质点丰度下调，16 个蛋白点的丰度上调。研究结果表明，盐胁迫对小麦种子萌发时期胚中部分蛋
白含量和表达产生不同程度的抑制与激活。
关键词 : 小麦 种子胚 双向电泳
Influence on Wheat Seed Embryo Proteins During the Germination
Period by Changed NaCl Stress
Liu Xiangbiao Niu Wenting Duan Jiangyan
（College of Life Science，Shanxi Normal University，Linfen 041000）
Abstract:  For the comparison of different concentrations of wheat under salt stress seed germination stage embryo protein expression,
“Jinmai -47” as the test material. Select the 3 concentrations of 0, 0.1 mol/L, 0.2 mol/L treated seeds, with the technology of 2-DE 3
concentrations under the embryo protein content changes have been studied. By PDQuest image analysis software analysis under salt stress
protein changes, detected in normal seed embryo has 121 points, 0.1 mol/L under NaCl stress 32 protein spots abundance down, 21 protein spots
increase in abundance ；0.2 mol/L NaCl stress condition, is detected by a 46 point cut protein abundance, 16 protein spots abundance increase.
Research results show that salt stress on seed germination of wheat embryos during part of the protein content and the expression have varying
degrees of inhibition and activation.
Key words:  Wheat Seed embryo Two-dimensional electrophoresis
来出现了大量的有关植物种子萌发时期蛋白质组学
研究的文献报道 ：Callard 等［4］以拟南芥种子为研
究对象，分离到 1 300 多种蛋白质。Fu 等［5］对拟南
芥做了进一步分析，鉴定出 355 个独立基因编码的
437 个蛋白点。Yang 等［6］对水稻种子萌发进行蛋
白质组研究发现，有 63 种蛋白下调，69 种蛋白上
调。这些研究中多集中于拟南芥、水稻等植物，而
在重要粮食作物小麦中却少有报道。小麦拥有抗盐
基因［7］，并且有类似的调节途径和抗盐因子。
2-DE 技术为研究蛋白质的动态变化提供了重要
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第5期64
的技术支撑，可以对生物细胞或组织的蛋白质表达
进行定量分析，用于揭示不同条件下蛋白质表达的
变化情况。该技术具有高通量、高灵敏度、高分辨
率、重复性好等优点［8］。蛋白质组学技术在植物种
子萌发过程中鉴定出的蛋白质，大部分是这一过程
中的下游成分，而不是上游成分［9］。同时在所鉴定
的相关蛋白质在数量、种类上还不能组建成详细的
动力学代谢途径。这些信息的缺乏对我们进一步了
解种子萌发机制是远远不足的。因此，我们通过识
别 NaCl 胁迫下小麦种子萌发的蛋白含量变化的研
究，对真正在蛋白质水平上进行种子萌发的研究有
重要的意义。
本研究以“晋麦 -47”为研究材料，比较不同
浓度的 NaCl 溶液对小麦种子萌发过程中的抑制作
用，确定小麦种子萌发的 NaCl 浓度伤害阈值和存活
阈值。在小麦萌发时 28 h（胚根突破种皮 2-3 mm）
时，把胚和胚乳（包含糊粉层）分离，将胚用于 2-DE
电泳、考马斯亮蓝染色、PDQuest 软件对其进行研究，
将有助于我们进一步从时空变化的角度理解 NaCl 胁
迫下对小麦种子萌发的伤害机制和适应机制。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 小麦种子 “晋麦 -47”由山西省农科院小麦
研究所提供。
1.1.2 主要试剂 曲拉通 X-100、超纯水、蒸馏水、
丙酮、过硫酸铵（AP）、尿素、硫脲、十二烷基硫
酸钠（SDS）、三羟基甲基氨基甲烷（Tris）、N、N、N、
N-四甲基乙二胺（TEMED）、0.1% HgCl2、牛血清蛋
白（BSA）、冰乙酸、甘油、两性电解质（Bio-Lyte）
1%溴酚蓝、1 mol/L 盐酸、CHAPS、碘乙酰胺（IAM）、
低熔点琼脂糖、甘氨酸、丙烯酰胺（Acr）、85%磷酸、
二硫苏糖醇（DTT）、95%乙醇、考马斯亮蓝 G-250、
甲叉双丙烯酰胺（Bis）。
1.2 方法
1.2.1 不同 NaCl 浓度对小麦种子萌发的影响 选取
干燥度一致、饱满、种皮色泽正常的种子 420 粒。
（经 0.1% HgCl2 溶液浸没消毒 2 min 后再用纯水漂洗
5 次），置于 25 mL 纯水，铺有双层定性滤纸的玻璃
培养皿中，每皿 60 粒盖上盖。25℃恒温避光处理发
芽。在 7 个培养皿内分别加入 0、0.05、0.1、0.15、0.2、
0.3 和 0.4 mol/L 浓度的 NaCl 溶液，实时对培养皿进
行称重补充蒸发的水分，保证各处理组浓度不变。
以 28 h 胚根突破种皮 2-3 mm 的种子为标准。在 4、
8、12、16、20、24 和 28 h 随机取 20 粒，统计每组
的发芽率，每组均重复 3 次。
1.2.2 取样 根据不同 NaCl 浓度对小麦种子发芽率
的影响，选出有显著差异的 3 个 NaCl 浓度，分别是
0、0.1 和 0.2 mol/L。选取干燥度一致、饱满、种皮
色泽正常的小麦种子，按照上述方法进行消毒、冲
洗、吸去多余的水分后，分别用 0、0.1 和 0.2 mol/L
的 NaCl 溶液中，在 25℃恒温箱中进行避光培养 28
h，以胚根突破种皮 2 mm 为准，进行取样，将胚和
胚乳（包含糊粉层细胞）进行分离。
1.2.3 小 麦 种 子 胚 中 可 溶 性 蛋 白 2-DE 样 品 的 制
备 按照上述 3 个浓度处理的小麦种子，用尿素 / 硫
脲法提取小麦种子胚蛋白。取出的胚样品在液氮中
磨成粉末加入离心管中，加入尿素 / 硫脲蛋白提取
液振荡 30 s，离心 15 min 后，取上清液再重复离心，
收集上清液，加入 3 倍体积冷丙酮，并放入 -20℃的
冰箱里过夜，次日收集沉淀（视具体情况可再加一
次，离心同上），4℃放置，使丙酮充分发挥，待沉
淀干燥后，溶于 400 μL 样品裂解液，4℃冰箱中过夜，
第 2 天离心取上清液，得到蛋白质样品液，4℃放置
待用。
1.2.4 小 麦 种 子 胚 中 可 溶 性 蛋 白 浓 度 的 定 量 测
定 把牛血清蛋白母液（100 mg/L）配成不同浓度
用分光光度计测其 OD 值，得出标准曲线。再根据
测得样品 OD 值估算出蛋白样品的浓度，以此确定
后续试验中加样量的一致。进行多次重复试验，减
少试验的偶然性几率。
1.2.5 小麦种子胚可溶性蛋白的 2-DE 取出已经配
好的水化上样液，加入 0.001 g DTT，5 μL 的 40%
Bio-Lyte（pH3-10），充分溶解，取均质的水化上样
液与蛋白样品溶液以 4∶1 混匀，即为上样液。采
用 pH3-10，7 cm 线性 IPG 预制胶条。主动水化在
50 V 电压下 12 h 后，经过 250 V 0.5 h、500 V 0.5 h、
4 000 V 3 h、最后稳定在 4 000 V 下进行 20 000 Vh，
500 V 快速保持时间视情况而定。聚焦完毕后，胶条
先在平衡液Ⅰ［尿素 36 g、SDS 2 g、Tris-HCl（pH8.8）
2013年第5期 65刘向标等 ：NaCl 胁迫对小麦种子胚在萌发时期蛋白含量的影响
25 mL、甘油 20 mL、DTT 0.2 g］中，在摇床上平衡
15 min，再在平衡液Ⅱ（0.25 g IAM 代替 0.2 g DTT，
其余组分同平衡Ⅰ）中平衡 15 min。然后进行第二
向 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离胶浓度为 12%。
1.2.6 考马斯亮蓝染色 剥离凝胶立即放入固定液
（12% TCA）中固定 2 h，充分固定后用双蒸水洗 3 次，
每次 5 min，取出放入考马斯亮蓝染液（20%甲醇、
1.8%磷酸、8%硫酸铵、0.08%的考马斯亮蓝 G250 染
色至少 2 h，脱色液（7%、5%甲醇）脱色 1 h 后换
用双蒸水进行脱色，直到蛋白点清晰为止。
1.2.7 2-DE 图像分析 凝胶用扫描仪（UMAX）进
行扫描，得到蛋白图像用 PDQest 软件进行分析包括
背景消减、斑点检测、匹配、蛋白含量表达分析等。
2 结果
2.1 NaCl胁迫下小麦种子萌发的浓度确定
随着浓度的增大，未萌发的种子数目的趋势增
强，选出具有代表不同盐胁迫下的 3 个 NaCl 浓度，
即 0（对照组）、0.1 mol/L（伤害阈值）、0.2 mol/L（存
活阈值），作为盐胁迫下对小麦种子胚蛋白影响的浓
度（图 1）。
由图 1 可知，通过不同浓度 NaCl 处理后小麦萌
发率均下降。浓度越高萌发率下降的程度越大，对
种子的危害程度也越大，这表明 NaCl 胁迫确实降低
了小麦种子的萌发能力。对不同浓度下 NaCl 对萌发
率的影响发现，0 mol/L 萌发率为 93%、0.05 mol/L
萌发率为 89%，发现之间的萌发率差异不明显，说
明 0.05 mol/L 的 NaCl 对小麦萌发的影响并不明显，
可以把 0.05 mol/L 视作小麦种子萌发过程中的抗盐
阈 值 ；0.1 mol/L 萌 发 率 为 68%、0.15 mol/L 萌 发 率
为 60%，发现萌发率差异不明显，但是与 0 mol/L
的萌发率差异显著，表明这时的浓度已经达到或者
超过了小麦种子抗伤害的界限，0.1 mol/L 可看作是
NaCl 溶液对小麦种子的伤害阈值 ；0.2 mol/L 萌发率
为 27%、0.3 mol/L 萌发率为 19%，此时的萌发率急
剧下降，0.2 mol/L 可看作是 NaCl 溶液对小麦种子存
活阈值 ；0.4 mol/L 这个浓度萌发率接近 0，可认为
0.4 mol/L 为致死浓度。根据不同浓度 NaCl 胁迫下萌
发情况，选取了有代表性的 3 个浓度，分别是 0（对
照组）、0.1 mol/L（伤害阈值）、0.2 mol/L（存活阈值）
作为以下研究的 NaCl 浓度。本研究讨论 NaCl 胁迫
下小麦种子萌发过程中胚蛋白含量的变化，因此致
死浓度 0.4 mol/L 不在本研究的考虑范围之内。
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 ᰦ䰤h
㨼ਁ
⦷%

0 mol/L
0.05 mol/L
0.1 mol/L
0.15 mol/L
0.2 mol/L
0.3 mol/L
0.4 mol/L
4 8 12 16 20 24 28
图 1 不同浓度 NaCl 对小麦种子萌发率的影响
2.2 标准曲线绘制
根据改良 Bradford 方法测定蛋白质含量，并制
成标准曲线（图 2）。蛋白质上样量为 0.5 mg。由图
2 可见，牛血清蛋白的含量与在 595 nm 的 OD 值呈
线性相关。
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0
A
59
5
BSA⎃ᓖmg
y = 5.1592x + 0.0284
R2 = 0.9902
0.05 0.1 0.15
图 2 标准牛血清蛋白曲线
由图 2 标准曲线公式可以得出 ：0.1 mol/L NaCl
时 样 品 的 OD 值 为 0.207， 浓 度 为 1.096 μg/μL ；
0 mol/L NaCl 时 样 品 的 OD 值 为 0.202， 浓 度 为
1.07 μg/μL ；0.2 mol/L NaCl 时样品的 OD 值为 0.197，
浓度为 1.045 μg/μL。
2.3 不同盐胁迫浓度下提取胚蛋白进行SDS-PAGE
所得凝胶胶图像
为了进一步确定盐胁迫下影响小麦种子蛋白含
量的浓度，分别提取 7 个浓度下的小麦胚蛋白样品
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第5期66
100 μg 进行 SDS-PAGE（图 3）。从图 3 可以清晰地
看到随着盐胁迫浓度的上升，在凝胶上出现的蛋白
条带出现的变化，充分说明盐胁迫确实对小麦胚的
蛋白含量产生了影响。
1 2 3 4 5 6 7
1-7 ：NaCl 浓度分别为 0、 0.05、0.1、0.15、0.2、0.3 及 0.4 mol/L
图 3 不同浓度的盐胁迫对小麦种子胚蛋白的 SDS-PAGE
2.4 不同NaCl浓度处理后小麦种子胚差异蛋白变化
选取 0、0.1 及 0.2 mol/L 浓度的 NaCl 处理过的
小麦种子露白时期的小麦胚蛋白 100 μg，选用 10 cm
pH3-10 的非线性胶条对上述的材料进行双向电泳。
3 种浓度的蛋白样品都进行 3 次重复操作。重点检
测变化点，用来了解不同 NaCl 浓度处理对小麦种子
萌发过程中蛋白质变化的影响。2-DE 上的污点的灰
度和位置的变化可以理解为蛋白质点的降解、合成
或翻译后修饰。以 0 mol/L NaCl 处理的种子胚作为
参考胶与其他两块胶 0.1 mol/L NaCl 胁迫、0.2 mol/L
NaCl 胁迫，通过用 PDQuest8.0 进行比对分析发现 ：
在检测到的种子胚中以 0 mol/L 时为对照胶约有蛋白
点 121 个（图 4）；0.1 mol/L NaCl 胁迫下（图 5）有
117 个，其中有 32 个蛋白点丰度下调，21 个蛋白点
丰度上调，其中包括 10 个表达消失的点，3 个新表
达的点 ；在 0.2 mol/L NaCl 胁迫下（图 6）有 102 个
蛋白点，检测到 46 个蛋白质点丰度下调，16 个蛋
白点的丰度上调，其中包括 16 个表达消失的点，7
个新表达的点。为了使差异蛋白点更清楚的观察，
对部分变化的蛋白点进行了放大（图 7）。
3 讨论
3.1 盐胁迫条件下NaCl浓度的选择
从不同 NaCl 浓度对小麦种子萌发率影响来看，
明显地呈现出随着浓度的升高未萌发的种子数量的
IEF pH 310
94.0
67.0
43.0
30.0
20.0
14.4
kD
图 4 0 mol/L NaCl 胁迫下小麦种子 2-DE 图谱
图 6 0.2 mol/L NaCl 胁迫下小麦种子 2-DE 图谱
图 5 0.1 mol/L NaCl 胁迫下小麦种子 2-DE 图谱
IEF pH 310
94.0
67.0
43.0
30.0
20.0
14.4
kD
IEF pH 310
94.0
67.0
43.0
30.0
20.0
14.4
kD
趋势加强。同时，对各浓度下小麦种子蛋白的 SDS-
PAGE 上更显著地体现出图一相同的特点，即 0 和
0.05 mol/L 之 间，0.1 mol/L 和 0.15 mol/L 之 间，0.2
mol/L 和 0.3 mol/L 之间对种子萌发的胁迫程度相近。
因此，从中选出具有代表不同盐伤害程度的 3 个
NaCl 浓度，即 0（CK 对照）、0.1 mol/L（伤害阈值）、
0.2 mol/L（存活阈值），作为本研究的 NaCl 处理浓度。
2013年第5期 67刘向标等 ：NaCl 胁迫对小麦种子胚在萌发时期蛋白含量的影响
因本研究只讨论 NaCl 胁迫下萌发种子的胚蛋白含量
的变化，所以致死浓度 0.3 mol/L 不在选择范畴内。
3.2 双向电泳分析差异蛋白
植物的整个生命活动周期中，种子的萌发过程
是一个异养过程。对不同浓度处理后的小麦种子，
很清楚地发现盐胁迫延迟了小麦种子的萌发。植物
在受到非生物胁迫的时候，有些蛋白在萌发的过程
中表达丰度上调了，这体现了植物体内会诱导产生
一些新蛋白质或原有的蛋白含量的明显增加以适应
逆境胁迫。本试验中 NaCl 胁迫下处理的小麦种子，
其胚蛋白的凝胶图谱与正常的不同，说明 NaCl 胁迫
处理影响了小麦种子胚中蛋白含量和组分。这与前
人的研究结果一致。在盐胁迫、臭氧等外界因素的
胁迫下，小麦种子中 SAM 基因的表达增强［10］。大
麦、玉米、拟南芥种子中 LEA 蛋白质丰度的降低程
度与种子处于寒冷和干旱胁迫有关［11］，LEA 蛋白
能够通过束缚水分子来保护萌发中的活性组织，进
而起到稳定蛋白的作用。盐胁迫下水稻、拟南芥中
PSCS 基因的转录水平提高了 5 倍［12］，说明 PSCS 基
因可被盐胁迫下诱导表达。山梨醇和海藻糖等也都
是细胞渗透调节时产生的重要的可溶性物质，有利
于增强植物的耐盐性［13］，超氧化物歧化酶（SOD）、
过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）等在清除
盐胁迫情况下产生的有害物质起到重要作用，同时，
在转基因植物中也发现保护植物组织的相关蛋白表
达含量提高了植物的耐盐性［14-16］。本研究中通过对
不同浓度盐胁迫下 2-DE 分析发现，蛋白含量有下降
和上升，也出现一些新蛋白。我们推测，这些变化
都是植物体调节自身的理化反应，从而减缓盐胁迫
情况下给机体带来的损伤。胁迫影响了胚正常发育
过程中蛋白质的表达，并随胁迫程度的加强而加大。
无规律变化上调的蛋白质，多是种子萌发过程中新
产生的蛋白质，下调蛋白质是成熟种子原来贮藏的
蛋白或是原有的 mRNA 翻译来的，对上调点和下调
点影响的不同，说明盐胁迫的危害主要是由于影响
了种子萌发过程中新蛋白的表达模式。
4 结论
代表不同盐伤害程度的 3 个 NaCl 处理浓度，即
0 mol/L（CK 对照）、0.1 mol/L（伤害阈值）、0.2 mol/L
（存活阈值）；在该处理浓度下，既有新的蛋白质的
出现，也有原蛋白子含量的增加和减少。检测到正
常的种子胚有 121 个点，0.1 mol/L NaCl 胁迫下有 32
个蛋白点丰度下调，21 个蛋白点丰度上调，其中
包括 10 个表达消失的点，3 个新表达的点 ；在 0.2
mol/L NaCl 胁迫下，检测到 46 个蛋白质点丰度下调，
16 个蛋白点的丰度上调，其中包括 16 个表达消失
的点，7 个新表达的点。
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0 mol/L 0.1 mol/L 0.2 mol/L 0 mol/L 0.1 mol/L 0.2 mol/L
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（责任编辑 李楠）