全 文 ：·技术与方法·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(3):43-48
在生物个体间，最本质的差异是 DNA 分子水平
间的差异，DNA 分子标记技术是对遗传物质本身差
异的直接检测，能准确地反映动植物遗传组成全貌，
因此 DNA 是最为可靠的遗传标记。DNA 分子标记
能对不同发育时期的个体、任何组织甚至器官作检
测，其具有数量丰富、涉及全基因组、遗传稳定、
多态性高、不受外界环境影响、无上位性作用等一
系列显著优点［1］，DNA 分子标记技术自诞生之日
起，就引起了生物科学家们极大的兴趣。自 1974 年，
Grozdicker 等［2］ 利用限制性内切酶酶解后得到的
DNA 片段的差异鉴定温度敏感表型的腺病毒 DNA
突变体，首创了 DNA 分子标记技术以来，DNA 分
子标记技术日趋成熟、完善［3］。目前最常用的分子
标 记 有 RFLP、RAPD、AFLP、SSR 和 ISSR 等。 与
其他几种常用的分子标记技术相比，SSR 标记具有
信息量更高、多等位点、共显性、稳定可靠及操作
简便等显著优点，在基础理论研究和实际应用等方
面取得了巨大的成绩，广泛地应用于遗传育种、物
种亲缘关系鉴别、基因组作图、基因定位、基因库
构建和基因克隆等方面。
收稿日期 ：2014-7-30
基金项目 ：国家烟草专卖局重点项目（110200902043）
作者简介 ：陈杰，男，硕士研究生，研究方向 ：烟叶生产及科技推广应用 ；E-mail ：hnchenjie002@126.com
通讯作者 ：王维，男，博士，副教授，硕士生导师，研究方向 ：烟草栽培与生理 ；E-mail ：wangwei@scau.edu.cn
SSR 分子标记在烟草研究中的应用进展
陈杰1  杨静1  龙胜贤1  肖慈平1  杨昌义1  黄清忠1  王维2
（1. 贵州省黔东南州烟草公司，凯里 556000 ；2. 华南农业大学农学院 华南农业大学烟草研究室，广州 510642）
摘 要 ： SSR 分子标记技术作为最常用的分子标记技术之一，该标记技术重复性好，结果可靠，近年来在烟草遗传育种中
展示了广阔的应用前景，是应用潜力较大的分子标记技术。介绍了 SSR 分子标记的原理及其分布特征，对其在烟草基因定位及分
子标记辅助选择、种质资源研究、遗传图谱构建及种子纯度及真伪鉴定研究中的应用等方面进行了综述，并探讨了 SSR 分子标记
技术在烟草遗传育种中的应用前景，以期为烟草 SSR 分子标记技术的研究提供参考。
关键词 ： 烟草 ；分子标记 ；SSR ；遗传育种
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.04.006
Advance of the Application of SSR Molecular Markers in
Tobacco Research
Chen Jie1 Yang Jing2 Long Shengxian1 Xiao Ciping1 Yang Changyi1 Huang Qingzhong1 Wang Wei2
（1. Qiandong-nan Tobacco Company in Guizhou Province，Kaili 556000 ；2. Tobacco Laboratory，College of Agriculture，South China
Agricultural University，Guangzhou 510642）
Abstract: SSR molecular marker technology as one of the most commonly used molecular markers, the marker technique result is reliable
and good repeatability. In recent years, SSR marker shows a broad application prospect in tobacco genetic breeding, is a large potential for
application of molecular markers. This paper introduced the principle and distribution characteristics of SSR molecular marker, and summarized
the study of gene location and molecular marker-assisted selection, germplasm research, the construction of molecular genetic maps and the seed
purity identification and authenticity of tobacco, and analysed the application prospect of molecular markers in tobacco genetic breeding. The
main aim is to supply useful information so as to promote the development of SSR molecular marker technology research in tobacco.
Key words: tobacco ；molecular marker ；SSR ；genetic breeding
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.344
1 SSR 分子标记技术的原理和特点
简单重复序列（simple sequence repeat，SSR），
又称微卫星 DNA（micro-satellite DNA），是指以少
数几个核苷酸（1-6 个）为单位多次串联重复的
DNA 序列，重复次数一般为 10-50，亦称简单序列
长 度 多 态 性（simple sequence length polymorphism，
SSLP）。同一类微卫星 DNA 可分布在基因组的不
同位置上，由于基本单元重复次数的不同，而形成
SSR 座位的多态性。每个 SSR 座位两侧一般是相对
保守的单拷贝序列，因此可根据两侧序列设计一对
特异引物来扩增 SSR 序列，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，
比较扩增带的迁移距离，从而获知不同个体在某个
SSR 座位上的多态性。
这种重复序列存在于几乎所有真核生物的基因
组中，含量丰富，且呈随机均匀分布。微卫星由核
心序列和两侧的保守侧翼序列构成，保守的侧翼序
列使微卫星特异地定位于染色体某一区域，核心序
列重复数的差异则形成微卫星的高度多态性。近年
来，SSR 分子标记技术成为种群研究和进化生物学
最常用的分子标记之一，广泛地应用于种群遗传多
样性分析、基因定位及分子标记辅助选择、遗传连
锁图谱的构建［4］。与其他作物相比，烟草 SSR 标记
开发研究起步较晚。近年来，随着烟草基因组计划
取得的巨大成就，SSR 分子标记技术在烟草遗传育
种中运用越来越广泛及深入。
2 烟草 EST-SSR 分布特征
随着分子生物学技术的高速发展，植物表达序
列标签（expressed sequence tags，ESTs）得到大量测
定，EST 数据的快速增长为 SSR 标记的开发提供了
丰富的序列资源，使得基于 EST 序列进行 SSR 标记
开发的能力大大增强。
王卫锋等［5］通过对绒毛状烟草基因组中 SSR
位点的信息分析发现，A/T 碱基出现的频率显著高
于 G/C，二、三碱基重复基元的 SSR 占 SSR 总体的
94.8%，出现频率最高。而（CG）n、（GTG）n、（GTC）n、
（GCA）n、（CGC）n 这些重复单元的 SSR 在绒毛状
烟草基因组中非常少见，分别只出现了 1 次，得出
烟草 SSR 序列显示出显著的碱基偏好性的结论。薛
金爱等［6］对 GenBank 上公布的 158 098 条 EST 序列
及 10 647 条 GSS 序列进行大规模微卫星位点搜索，
在 EST 和 GSS 中搜索到的重复单元中二核苷酸发
生的次数最多，在 EST 中 TC 发生的频率最高，在
GSS 中出现最多的是 TA ；其次是三核苷酸，其中发
生次数最多的分别是 TGA 和 CAA。李绪英等［7］对
烟草叶绿体和线粒体基因组数据中的 SSR 信息进行
了分析，分别获得 186 和 578 个 SSR 位点，且这些
SSR 重复碱基类型绝大部分为二、三碱基重复。
在大多数植物中，EST-SSR 分布以二、三核苷
酸重复类型为主，而且在二核苷酸重复的 EST-SSRs
中，含 AG/TC 的重复单元最多，烟草 EST-SSR 的分
布特征与其他大多数植物基本一致［8-15］。
3 SSR 标记在烟草遗传育种中的应用
3.1 基因定位及分子标记辅助选择
传统的烟草育种主要依赖于植株表型选择和抗
性鉴定，要求育种者须有丰富的经验，育种周期也
较长，且极易受到病虫害发生状况及气候条件的限
制，导致鉴定结果出现偏差，甚至造成优良抗性基
因的丢失，选择效率较低［16，17］。因此，如何快速
选育抗病优质烟草新品种是广大烟草育种工作者面
临的主要问题之一。分子标记辅助选择（molecular
marker-assisted selection，MAS）利用与目标性状相
连锁的分子标记可以对育种材料从 DNA 水平上进行
高效选择，从而对作物产量、品质和抗性等性状进
行改良，同时因其不受基因效应和环境因素的影响，
选择结果可靠性比较高，从而解决了育种年限长的
问题，大大提高育种进程［17］。SSR 分子标记辅助选
择近年来在烟草上得到了越来越多的应用。
范静苑、文轲等［18，19］利用抗 CMV 的烤烟品
种台烟 8 号构建分离群体进行遗传分析，分别筛选
到一个与抗性基因相关的 SSR 标记，并探讨了烟
草 CMV 的抗性遗传规律，认为台烟 8 号对 CMV 的
抗性由多基因控制。同时范静苑等还筛选到一个与
来源于铁把子的与 CMV 抗性基因相关的 SSR 标记。
吴海乔［20］利用 1 152 对 SSR 标记对烟草青枯病抗病
品种岩烟 97 与感病品种红花大金元构建的 F2 群体
进行分析，筛选出 4 个在抗、感池间表现差异的标
记。范江等［21］以抗青枯病的烟草品种‘Oxford207’
与感病品种红花大金元为亲本构建群体，从 800 多
2015,31(3) 45陈杰等：SSR 分子标记在烟草研究中的应用进展
条 SSR 引物中筛选出 3 个在抗感池之间有多态性
的引物，并得出来自‘Oxford207’的青枯病抗性基
因属于加性基因控制的结论。蒋彩虹等［22］在筛选
到的一个与净叶黄抗赤星病基因的遗传距离为 9.37
cM 标记的基础上，在该标记的两侧 10 cM 范围内
分别选择 15 对 SSR 引物对抗病亲本净叶黄与感病
亲本 NC82 的杂交 F2 进行 SSR 标记分析，筛选到一
个与来源于净叶黄的赤星病抗性基因间的遗传距离
为 4 cM 的标记。牟建英等［23］从 2 317 对 SSR 引物
中筛选得到 61 对多态稳定的引物，用其对台烟 7 号
（♀）×NC89（♂）构建的 285 株 F2 群体进行分析，
检测到 1 个与烟草白粉病抗性基因紧密连锁的 SSR
标记。
分子标记辅助选择育种的关键是寻找与目的基
因紧密连锁的分子标记，两者连锁越紧密，则标记
与目的基因的重组率越低，选择效率也就越高。分
子标记辅助选择将现代分子生物学与传统育种学结
合，为植物育种工作提供不受环境影响、可量化的
标准方法，使作物遗传育种进入了一个崭新的阶段。
近年来，利用 SSR 分子标记辅助选择技术已在水稻、
小麦、玉米、棉花和番茄等作物的抗病性育种中取
得了巨大的成就，并且通过分子标记辅助选择技术
将多个抗病基因进行有效聚合，培育出广谱抗性持
久、稳定的品种，解决了利用转基因技术进行抗性
育种耗时、成本昂贵，基因沉默、遗传不够稳定及
安全性等问题［24-29］。然而，分子标记辅助选择聚合
育种在烟草育种中还未见相关报道，这主要可能是
由于目前在烟草的抗性基因定位中还没有找到一个
与目的基因紧密连锁的标记造成的。
3.2 烟草分类及遗传多样性研究
DNA 多样性是遗传多样性的本质，种质资源遗
传多样性的发展经历了形态学标记（morphological
markers）、细胞学标记（cytological markers）、生物化
学标记（biochemical markers）和分子标记（molecular
markers）4 个主要阶段。由于分子标记技术不受环
境、季节的影响，与其他遗传标记相比，更适合用
于动、植物分类和遗传多样性研究。刘胜传、叶兰
钦和李文平等［30-32］分别应用 SSR 分子标记技术分
析了部分烟草种质的遗传多样性，都得出了烟草品
种间遗传差异较小的结论。聂琼等［33］利用从番茄、
辣椒的 SSR 引物中筛选出 8 对重复性好、多态性高
的同源性 SSR 引物对 24 份烤烟材料进行遗传差异性
分析得出，同科植物的 SSR 引物也能够较好地揭示
烟草种质资源遗传背景和亲缘关系，可应用于烟草
品种资源的遗传差异分析的结论。徐军等［34］利用
SSR 标记构建了 80 份普通烟草种质的指纹图谱。王
曼等［35］利用 10 对 SSR 引物对吉林省 11 份晒烟种
质和 2 份烤烟种质进行遗传多样性与亲缘关系进行
分析，得出不同烟草类型种间遗传差异明显，而种
内遗传基础相对狭窄的结论。黄莉莎等［36］从 62 对
SSR 引物中筛选出 21 对多态性高、稳定性好的核心
引物对 9 份烟草主栽品种进行 DNA 指纹图谱构建，
发现 9 个品种间遗传关系较近。杨柳等［37］利用 14
对多态性好、条带清晰的烟草 SSR 引物，对 25 份
烟草种质资源亲缘关系进行分析，其研究认为 25 份
普通烟草种质间的遗传差异与其品种特性、调制类
型、地理来源的差异没有必然联系，但较好地反映
了烟草种质间亲缘关系。
遗传多样性不仅反映出物种变异水平的高低，
而且能体现变异的分布格局，准确反映物种的血缘
关系、育种背景和利用价值，对优质种质资源的保护、
育种潜力的发掘利用、杂交种的选配、育种效率的
提高具有重要意义［38，39］。对烟草种质资源亲缘关系
的研究表明，我国烟草品种间遗传距离较窄，烟草
育种工作面临亲本匮乏，主体亲本使用过度、重复
性大等问题，因此在今后的育种工作中要积极引入
外源基因，加大优质野生种质资源的利用，拓宽种
质的遗传基础［40，41］。
3.3 遗传图谱的构建及种子纯度和真伪鉴定
拥有一张高密度分子标记遗传图谱是开展分子
标记辅助选择以及基因定位工作的基础，1978 年
Donis-Keller 等［42］首次利用 RFLP 标记构建了人类
的第一张基因连锁图谱，从此 DNA 分子标记技术就
开始广泛地应用于各种动、植物遗传图谱的构建中。
目前，在水稻、小麦、玉米和番茄等作物中已经拥
有了高密度甚至饱和的遗传连锁图谱［43-46］。近年来，
随着 SSR 分子标记的大量开发，SSR 分子标记技术
越来越多地应用到烟草遗传连锁图谱的绘制。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.346
2001 年，Lin 等［47］ 利 用 RFLP 标 记 技 术 构 建
了第一张烟草分子标记遗传连锁图谱。肖柄光等［48］
以烤烟品种杂交得到的 137 个 DH 系为作图群体，
利用 ISSR 和 RAPD 标记的遗传连锁分析构建了包
括 27 个连锁群在内的国内外第一张烤烟分子标记遗
传连锁图谱。Bindler 等［49］利用 Hicks Broad Leaf 和
Red Russian 杂交产生的 186 个 F2 单株作为作图群
体，构建了第一张烟草 SSR 标记遗传连锁图，之后
Bindler 等［50］在 2007 年工作的基础上，利用已经公
开发表的 1379 067 个烟草原始基因序列（GSS）和
55 411 个表达序列（ESTs）设计出 5 500 个 SSR 引物，
从这 5 500 个引物中筛选出 2 317 个多态性、重复性
好，条带清晰的 SSR 标记，利用 Hicks Broad Leaf 和
Red Russian 杂交产生的 186 个 F2 单株作为作图群体，
构建了包括 2317 个 SSR 标记，2 363 个位点在内的
24 个连锁群，总遗传长度为 3 267 cM，标记间的平
均距离小于 1.5 cM。这是目前包含标记位点最广、
标记密度最大、平均图距最小的烟草分子连锁图谱。
随着我国烟草育种研究的不断深入，越来越多
的优良、抗逆性强的品种被选育和引进，为解决我
国烟草品种单一问题提供了有力的支撑，然而同时
也增大了品种混杂的可能性。烟草种子纯度和真实
性是优良品种生产的保证。建立快速、准确的烟草
种子纯度鉴定技术是对规范我国烟草种子市场和促
进我国烟草产业发展的迫切需要。随着科技进步，
分子标记技术已经开始用于作物种子纯度的鉴定。
利用 SSR 标记技术构建指纹图谱鉴定种子纯度和真
伪在水稻、玉米、棉花和油菜［51-54］等作物中具有
较多的研究，但在烟草种子方面的应用很少有文献
报道。
总体上，烟草分子标记遗传图谱构建及在种子
纯度和真伪鉴定等研究中的应用程度远远落后于其
他作物，这可能是由于栽培种烟草属于异源四倍体，
有 48 条染色体，全长约 4 600 Mb，约为人类基因组
全长的 1.5 倍，基因组巨大和分子标记在烟草中开
发利用较少造成的［55］。
4 前景
加强作物育种，必须加大对分子育种技术的应
用。近年来，育种学家对利用分子生物学手段进行
作物育种表现出浓厚的热情，但目前烟草 SSR 标记
的开发远远落后于其他作物。烟草染色体数目较多，
基因组庞大，包含大量的重复序列，这给烟草基因
组物理图谱的构建和测序造成了极大的困难。因此
到目前为止可利用的分子标记数量也十分有限，难
以构建高密度的烟草遗传连锁图谱，无法筛选到与
目标基因紧密连锁的分子标记。将与目标基因连锁
的分子标记运用于遗传育种的早期辅助选择，仍停
留在基础理论研究阶段，目前还没有通过有利基因
聚合的分子育种烟草产品的报道［56］，尤其是在烟草
抗旱、耐寒、抗早花基因筛选方面缺乏相关研究。
近年来，烟草单染色体分离扩增技术在烟草中开始
有研究，对于烟草这类大基因组的物种而言，构建
高覆盖率的单染色体文库能够解决高密度烟草遗传
图谱的绘制和烟草基因组测序的难题［57］。
目 前 烟 草 基 因 组 计 划（TGI） 已 取 得 巨 大 进
展，近几年各国启动的烟草基因组计划将烟草基础
研究推向了高潮。据报道，我国现已成功完成绒毛
状烟草与林烟草全基因组序列图谱，这是全球第
一套烟草全基因组序列（http ：//scitech.people.com.
cn/GB/16572602.html）。同时基因比较作图研究也成
为国际研究热点，SSR 标记同源性、通用性的研究
也在烟草中展开［58，59］。这些技术的发展及取得的成
果为烟草 ESTs 数量迅速增加、SSR 标记的开发和高
密度的分子连锁图谱的构建提供重要的依据，为获
得与目标基因紧密连锁的分子标记、基因的精确定
位、分子标记辅助选择提供重要前提，从而达到简
化传统育种方法的目的。在未来，利用 SSR 分子标
记技术开展烟草分子设计育种一定会成为烟草育种
的热点。
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（责任编辑 狄艳红）