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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(7):226-230
肺 炎 链 球 菌（Streptococcus pneumoniae，S.pn）
是引起细菌性肺炎、中耳炎、脑膜炎等疾病的一种
常见致病菌。其在婴幼儿及老年人中具有较高的发
病率与死亡率，全世界每年约有 160 万人死于与 S.pn
感染相关的疾病［1］。毒力因子在肺炎链球菌致病过
程中扮演着较为重要的角色，针对不同的感染局部
微环境，其可通过自身转录因子调控荚膜多糖、磷
壁酸等重要毒力因子的表达，以利于其建立感染及
适应宿主局部微环境［2］。因此，研究肺炎链球菌毒
力基因的转录调控机制，对于了解肺炎链球菌逃避
宿主防御、建立感染的分子机制有重要意义。
Mga 蛋白是 A 群链球菌中一种重要的转录因子，
可调节多种重要毒力基因的表达［3］。SPD1587 蛋白
是肺炎链球菌中的一种与 Mga 蛋白结构相似的转录
因子。研究显示，其在肺炎链球菌鼻咽部定植及肺
部感染中发挥着重要作用［4］。但其调控毒力基因表
达的具体分子机制目前还了解较少，为了能更深入
研究 SPD1587 蛋白在肺炎链球菌转录调控过程中的
收稿日期 ：2015-03-26
基金项目 ：国家自然科学基金项目（81460317），贵州省社会发展公关计划（2012GZ83293）
作者简介 ：黄健，男，硕士，研究方向 ：细菌致病分子机制研究 ；E-mail ：81537648@qq.com
通讯作者 ：闵迅，男，博士，研究方向 ：细菌蛋白疫苗及结构研究 ；E-mail ：zmchj2001@163.com
肺炎链球菌 SPD1587 蛋白的表达纯化及晶体生长研究
黄健1  黄美容2  骆诗露1  朱杰华1  闵迅1
（1. 遵义医学院附属医院医学检验科，遵义 563003 ；2. 遵义医学院附属医院输血科，遵义 563003）
摘 要 ： SPD1587 蛋白是肺炎链球菌 D39 菌株中的一种转录因子，其在鼻咽部定植和肺部感染过程中发挥着重要作用。生
物信息学分析提示其具有与 A 群链球菌的转录因子 Mga 蛋白相似的结构，目前其三维结构尚未被解析。成功构建了 SPD1587 蛋白
的全长表达载体 PET28a-spd1587，利用大肠杆菌 BL21（DE3）菌株进行原核表达，获得了以可溶形式表达的目的蛋白。经 Ni-NTA
柱亲和层析及 DEAE 阴离子交换层析纯化后，获得了高纯度的目的蛋白。采用悬滴气相扩散法获得了 SPD1587 蛋白晶体。
关键词 ： 肺炎链球菌 ；SPD1587 蛋白 ；原核表达 ；晶体生长
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.035
Expression，Purification，Crystallization of SPD1587 Protein from
Streptococcus pneumoniae
Huang Jian1 Huang Meirong2 Luo Shilu1 Zhu Jiehua1 Min Xun1
（1. Department of Laboratory Medicine，Affiliated Hospital of Zunyi Medical College，Zunyi 563003 ；2. Department of Blood Transfusion，
Affiliated Hospital of Zunyi Medical College，Zunyi 563003）
Abstract: SPD1587 protein is a transcription factor of streptococcus pneumoniae D39 strains, which plays an important role in
nasopharyngeal colonization and lung infection. It has a conserved domain that was similar to transcription factors Mga of group A streptococcus,
but the protein three-dimensional structure is unclear. In this study, the protein expression vector of PET28a-spd1587 was successfully
constructed and a soluble form of SPD1587 protein was acquired in Escherichia coli BL21（DE3）strain. High purity SPD1587 protein was
obtained by Ni-NTA affinity chromatography and DEAE negative ion exchange chromatography. The crystal of SPD1587 protein was obtained by
the vapor diffusion method.
Key words: Streptococcus pneumoniae ；SPD1587 protein ；prokaryotic expression ；crystal grow
2015,31(7) 227黄健等 ：肺炎链球菌 SPD1587 蛋白的表达纯化及晶体生长研究
生物学功能，本研究拟对 SPD1587 蛋白进行原核表
达、纯化及晶体生长，以期为下一步的蛋白晶体衍射、
结构解析及功能研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株与质粒 肺炎链球菌 D39 菌株、大肠杆
菌 DH5α 菌株、BL21（DE3）菌株、PET28a 质粒均
为本室保存。
1.1.2 试剂 细菌基因组 DNA 提取试剂盒购自北京
天根生化科技有限公司 ；Primer star 高保真 DNA 聚
合酶，限制性内切酶 BamH I、Xho I，T4 DNA 连接
酶购自大连宝生物工程有限公司 ；His Bind Column
（Ni-NTA） 树 脂、DEAE 阴 离 子 交 换 柱 购 自 美
国 GE 公司 ；蛋白晶体筛选试剂盒 Crystal Screen Kit
I&II 及 PEG screen I&II 购 自 美 国 Hampton Research
公司。
1.2 方法
1.2.1 生物信息学分析 采用 NCBI 保守结构域在
线分析软件（Conserved Domain Search Service），分
析 SPD1587 蛋白结构域以预测其可能的生物学功能。
1.2.2 SPD1587 蛋 白 原 核 表 达 载 体 构 建 以 肺
炎 链 球 菌 D39 菌 株 基 因 组 DNA 为 模 板， 以 上 游
引 物 ：5-CGCGGATCCATGAGAGATTTATTATCT
-3（ 下 划 线 为 BamH I 酶 切 位 点 ）， 下 游 引 物 ：
5-CCGCTCGAGTTACTCATCTAATCGAAT -3（ 下 划
线为 Xho I 酶切位点）扩增 spd1587 基因。扩增产物
和 PET28a 质粒经 BamH I，Xho I 双酶切后进行连接
构建 PET28a-spd1587 重组表达质粒，转化入大肠杆
菌 DH5α 菌株，在含 50 mg/L 卡那霉素的 LB 平板上
筛选阳性克隆，提取质粒后行双酶切鉴定后，送南
京金斯瑞生物科技有限公司进行测序鉴定。
1.2.3 SPD1587 蛋 白 表 达 及 纯 化 将 鉴 定 正 确 的
PET28a-spd1587 表达质粒转入大肠杆菌 BL21（DE3）
表达菌中，接种于 LB 培养液（含 50 mg/L 卡那霉
素）中，37℃培养至光密度 A600=0.5-0.6 时，加入 0.2
mmol/L 的 IPTG，25℃ 诱 导 8 h，12 000×g 离 心 10
min 收集菌体，超声破菌后 SDS-PAGE 鉴定蛋白表
达形式。破菌液经 12 000×g 离心 10 min 收集上清液，
用 His Bind Column（Ni-NTA）对蛋白进行亲和层析
纯化，并进一步利用 DEAE 阴离子交换柱对蛋白进
行纯化，后行 SDS-PAGE 电泳鉴定蛋白纯度，纯化
的蛋白经脱盐、超滤浓缩后分装，-80℃保存备用。
1.2.4 SPD1587 蛋白的晶体生长 以 5 mmol/L Tris-
HCl 缓冲液（含 50 mmol/L NaCl，pH8.0）稀释蛋白
浓度为 20 mg/mL，用 Crystal screen Ⅰ和Ⅱ、PEG Ⅰ
和Ⅱ试剂盒以悬滴气相扩散法行晶体初筛，池液
200 μL，将 1 μL 母液与 1 μL SPD1587 蛋白混合后加
样于硅化处理的玻片上，用凡士林封板，在 20℃恒
温条件下进行晶体生长。
2 结果
2.1 生物信息学分析
保守结构域分析（图 1）显示，该蛋白拥有与
Mga 蛋白结构相似的 2 个 DNA 结合的 HTH 结构域
和 1 个具有转录调控功能的 PRD 结构域。
HTH_Mga
HTH_XRE swperfamil
Mga
HTH_XRE superfamily
PRD_Mga
493450375300225150751
PRD_Mga superfamily
Query seq.
Specific hits
Superfamilies
图 1 SPD1587 蛋白保守结构域分析
2.2 目的基因的扩增及表达载体构建
挑选阳性克隆经菌液 PCR 鉴定正确后，提取重
组质粒经双酶切鉴定，能够获得 1 483 bp 大小的酶
切产物（图 2），经测序鉴定插入序列与 GenBank 中
肺炎链球菌 D39 菌株的 spd1587 基因序列完全相同
（图 3）。
2.3 SPD1587蛋白的表达及Ni-NTA纯化
含 PET28a-spd1587 重组表达质粒的大肠杆菌
BL21（DE3） 表 达 菌， 经 IPTG 诱 导 后 SPD1587 重
组蛋白主要以可溶形式表达，分子量约为 59 kD，与
预期结果相符，经 Ni-NTA 亲和纯化后，获得了纯
度较好的目的蛋白（图 4）。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.7228
2.4 重组蛋白SPD1587的DEAE阴离子交换纯化
以 DEAE 阴离子交换层析进一步对 SPD1587 蛋
白进行纯化，从层析图谱上可见一个较大的洗脱峰
（图 5-A），收集该洗脱峰处的蛋白行 SDS-PAGE 分析，
SPD1587 蛋白纯度达到了预期要求（图 5-B），可用
于后续晶体生长。
2.5 SPD1587蛋白晶体生长
SPD1587 蛋白在 20℃条件下生长后，在多种条
件下培养出了大小不一、呈长棒状、欠规则的方形
晶体（图 6-A），挑取晶体行 SDS-PAGE 电泳，结果
不致病，当宿主免疫力低下时，其会侵入肺、血液
等部位，引起肺炎、败血症等严重疾病［5］。从鼻咽
部迁移侵袭到肺的过程中，肺炎链球菌会调节相应
毒力基因的表达，可呈现出透明型和不透明型细菌
形态间的转换［6］。不透明菌株较透明菌株在定植、
生物被膜形成及上皮细胞粘附等能力上显著减弱，
但抗吞噬能力更强，可利于建立系统感染［7］。近年
来肺炎链球菌的毒力基因调控网络的研究成为其致
病分子机制领域的一个热点。鉴定出毒力基因相关
的调控网络将有助于设计新的抗菌药物靶点从而抑
制毒力基因的表达。目前，仍然有许多重要毒力基
因的调控机制尚不清楚。
Mga 蛋白是 A 群链球菌中一种重要的转录因
子，与细菌毒力基因的表达调控密切相关［8］。最近
研究发现，当 Mga 蛋白 201 位的组氨酸突变为精氨
酸后，会显著增强细菌的毒力，这与此突变可显著
2000
bp
M 1 2
1000
M ：Marker ；1 ：spd1587 基因 PCR 产物 ；2 ：PET28a-spd1587 重组质粒双酶
切图
图 2 PET28a-spd1587 重组表达质粒双酶切鉴定
150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260
图 3 PET28a-spd1587 原核表达质粒测序图
130
kD M 1 2 3 4
100
70
55
40
35
25
10
5
M ：蛋白质分子量标准 ；1 ：表达菌未诱导 ；2 ：表达菌诱导 ；3，4 ：Ni-NTA
亲和纯化的 SPD1587 蛋白
图 4 重组蛋白 SPD1587 的 SDS-PAGE 电泳图
（图 6-B）显示其分子量大小与 SPD1587 蛋白相符，
提示生长的晶体为 SPD1587 蛋白结晶而成。
3 讨论
肺炎链球菌通常定植于健康人群的鼻咽部但并
2015,31(7) 229黄健等 ：肺炎链球菌 SPD1587 蛋白的表达纯化及晶体生长研究
增加 mga 基因表达，从而上调其他 54 种毒力相关
基因表达有关［9］。SPD1587 蛋白具有与 Mga 蛋白相
似的 DNA 结合 HTH 结构域和转录调控功能域，它
在不同血清型肺炎链球菌间高度保守，提示其可能
在调控毒力基因表达过程中发挥着重要作用。利用
基因芯片筛选发现 SPD1587 蛋白可抑制肺炎链球菌
rlrA 致病岛中多种毒力基因的表达［10］，但目前 rlrA
致病岛仅存在于较少血清型肺炎链球菌中［11］，提
0.10
00:00 01:03 02:06 03:09 04:12 05:15
Elution time
06:18 07:21 08:24 09:27 10:30
0.20
0.30
0.40
0.50
O
D
25
0/m
A
U 0.60
0.70
0.80
0.90
1.00
੨ݹᓖA ቲ᷀䉡മA
66.4
kD
M
44.3
20.1
B
图 5 阴离子交换层析（A）及 SPD1587 蛋白 SDS-PAGE
电泳图（B）
kD
M
170
130
100
70
55
40
35
25
10
A B
A ：SPD1587 蛋白晶体 ；B ：SPD1587 蛋白晶体溶解 SDS-PAGE 电泳
图 6 SPD1587 蛋白晶体（A）及 SDS-PAGE（B）
示在不同血清型肺炎链球菌中或不同生长环境下，
SPD1587 基因的调控网络可能存在差异。
目前，SPD1587 蛋白的三维结构尚未被解析，
而蛋白结构解析对于弄清其转录调控过程中的 DNA
结合方式、调控功能具有重要意义。因此，为开展
对 SPD1587 蛋白晶体结构解析的工作，本研究对
其进行了原核表达、纯化及晶体生长研究。采用大
肠杆菌表达系统，本研究获得了以可溶形式表达的
SPD1587 蛋白。经 Ni 柱亲和纯化以及 DEAE 纯化后，
得到了纯度较高的目的蛋白用于晶体培养，并成功
培养出来质量较好的蛋白晶体，为下一步的蛋白晶
体优化、X 射线衍射及结构解析奠定了很好的工作
基础。
4 结论
成功在大肠杆菌中表达出可溶形式的 SPD1587
蛋白，经 Ni 柱亲和纯化以及 DEAE 纯化后，得到了
纯度较高的目的蛋白用于晶体生长，最终获得了质
量较好的蛋白晶体。
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）