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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(7):194-199
收稿日期 ： 2015-12-02
基金项目 ：国家自然科学基金资助项目（81460317），贵州省科技攻关项目（黔科合 SY 字（2012）3092 号）
作者简介 ：韩道宾，男，硕士研究生，研究方向 ：细菌致病分子机制研究 ；E-mail ：you15865885832@126.com
通讯作者 ：闵迅，男，博士，教授，研究方向 ：细菌致病分子机制研究 ；E-mail ：2815400619@qq.com
肺炎链球菌 TCSs 中 WalR 的克隆表达、保守性及抗原
表位分析
韩道宾1  骆诗露1  黄健2  朱杰华2  陈泽慧2  闵迅1
（1. 遵义医学院医学检验系，遵义 563000 ；2. 遵义医学院附属医院检验科，遵义 563000）
摘 要 ： 通过构建 PET28a-WalR表达载体并在大肠杆菌 BL21中表达WalR重组蛋白，以评价其对 C57小鼠的免疫原性；
并分析其在不同血清型肺炎链球菌中的保守性和 B细胞的抗原表位。以肺炎链球菌 D39血清型WalR基因为模板，构建重组质粒
PET28a-WalR并转入 BL21诱导表达目的蛋白质。采用 ClustalX 2.1软件对WalR蛋白在不同血清型 S.pn中的保守性进行分析；利
用 DNASTAR软件对其 B细胞抗原表位进行分析。结果显示，成功构建 PET28a-WalR重组表达载体，经 IPTG诱导后有大量高纯
度的目的蛋白质，但其主要以包涵体形式存在；WalR蛋白在不同血清型肺炎链球菌中高达 99.4%，其 B细胞抗原表位可能位于 9-16、
35-42、95-111、113-135、150-161、200-218等氨基酸序列位点。成功获得大量以包涵体形式表达的肺炎链球菌WalR重组蛋白，
并对其保守性和抗原表位进行了系统分析。
关键词 ： 肺炎链球菌；WalR ；重组蛋白；保守性；抗原性
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.028
Clone and Expression of WalR in Streptococcus pneumonia TCSs and
Analyzation of Conservation and Antigenic Epitope
HAN Dao-bin1 LUO Shi-lu1 HUANG Jian2 ZHU Jie-hua2 CHEN Ze-hui2 MIN Xun1
（1. Department of Medical Laboratory of Zunyi Medical University，Zunyi 563000 ；2. Clinical Laboratory Department of Zunyi Medical
University Affiliated Hospital，Zunyi 563000）
Abstract: This work aims to express WalR protein in Escherichia coli BL21 through constructing recombinant expression vector PET28a-
WalR and to analyze the immunogenicity in the experimental animal C57 mice，as well as to test the conservation in different Streptococcus
pneumonia serotypes and B cell antigenic epitopes. Using the WalR gene of S. pneumonia D39 as the template，the recombinant expression
vector PET28a-WalR was constructed and then transferred into Escherichia coli BL21 for induced expressing target protein. The conservation
of WalR protein in varied S. pneumonia serotypes was analyzed by ClustalX 2.1 software，and the B cell antigenic epitopes was analyzed by
DNASTAR Lasergene v7.1. As result，recombinant expression vector PET28a-WalR was constructed successfully and much target protein
was obtained by inducement of IPTG，however mainly in inclusion body. The conservation of WalR protein was up to 99.4% among different
S. pneumonia serotypes，and the antigenic epitopes of WalR protein were likely located in 9-16，35-42，95-111，113-135，150-161，
and 200-218 of amino acid sequence. In conclusion，recombinant S. pneumonia WalR protein in the form of inclusion body was successfully
acquired，and the conservation and antigenic epitope were analyzed.
Key words: Streptococcus pneumonia ；WalR ；recombinant protein ；conservation ；antigenicity
2016,32(7) 195韩道宾等：肺炎链球菌 TCSs 中 WalR 的克隆表达、保守性及抗原表位分析
肺炎链球菌（Streptococcus pneumonia，S.pn）又
称为肺炎（双）球菌，主要引起儿童和成年人肺炎、
败血症、脑膜炎等疾病，也是导致流行性中耳炎的
唯一病原体［1，2］。由于青霉素等抗生素的大量使用，
s.pn 的耐药性逐年走高。临床上广泛出现了多重耐
药的 S.pn 菌株，甚至耐万古霉素的 S.pn 菌株［3］。因
此，通过研发免疫原性强、保守性高、价格低廉的 S.pn
蛋白质疫苗，是解决 S.pn 耐药问题的关键［4，5］。
双 组 分 系 统（two-component systems，TCSs）
是革兰阳性菌特有的信号转导系统，是 S.pn 通过
感受外界环境变化、生长繁殖和维持自身存活的
重 要 感 应 系 统［6，7］。 组 氨 酸 蛋 白 激 酶（Histidine
kinase，HK/WalK） 及 其 受 体（Response regulator，
RR/WalR）是 S.pn TCS 中的一对调节蛋白，其在细
胞的能量信号转导上起着至关重要的作用［8］。WalR
主要通过磷酸化和去磷酸化使信号逐级放大，从而
引起细胞能量代谢反应。研究证实，这些信号的传
递往往与细菌的耐药性和致病性密切相关，也与其
生物膜的形成存在一定的关系［9］。因此，以 WalR
为蛋白质疫苗作用靶点的相关研究可能具有重要价
值。本研究拟通过蛋白重组技术获得高纯度的 WalR
目的蛋白以观察其保护效应，并探讨其在不同血清
型 S.pn 中的保守性，以期为后续蛋白疫苗的研发提
供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株和质粒 肺炎链球菌 NCTC7466（D39）
标准菌株。大肠杆菌 DH5α 和 BL21（DE3）菌株，
原核表达质粒 PET28a 为本课题组保存。
1.1.2 试剂 基因组 DNA 提取试剂盒（北京天根公
司），DNA 片段纯化试剂盒（TaKaRa），质粒提取试
剂盒（美国 Omega 公司），限制性内切酶 BamH Ⅰ、
Xhol Ⅰ（TaKaRa），PrimerStar 高保真 DNA 聚合酶、
DNA marker、T4DNA 连接酶（TaKaRa），异丙基 -β-D-
硫代半乳糖苷（IPTG）、卡那霉素、LB 培养基（上
海生工）。
1.2 方法
1.2.1 高保真 PCR 获取目的基因 用基因组提取试
剂盒对过夜培养后的 S.pn 菌株 D39 进行基因组 DNA
提取，在 NCBI 基因库中查找 WalR 目的基因（705
bp）并且用 Primer premier5.0 引物设计软件设计引
物，引物如下 ：
上游引物 ：CGGGATCC ATGAAAAAAATACTA-
ATTGTAG，
下游引物：CCGCTCGAG TCAAGCATTATTTCTC-
ATGT。
PCR 扩增体系 ：反应体系为 50 μL ：ddH2O 32
μL、5×PS Buffer 10 μL、dNTP Mixture 4 μL、 肺 炎
链球菌模板 DNA 1.5 μL、上游引物 F 和下游引物 R
各 1 μL、Prime Star 酶 0.5 μL。反应条件 98℃ 20 s，
54℃ 15 s，72℃ 43 s，30 cycles，72℃延伸 5 min。
PCR 产物经过 1% 琼脂糖凝胶电泳鉴定后，用 DNA
纯化试剂盒纯化后测得浓度储存于 -20℃备用。
1.2.2 PET28a-WalR 重 组 质 粒 的 构 建、 筛 选 将
PET28a 质粒和目的基因同时用 BamH Ⅰ、Xhol Ⅰ双
酶切，酶切后纯化并且用 T4DNA 连接酶连接。连接
后转化到大肠杆菌 DH5α 感受态中，并且接种于 LB
培养基平板（含 50 μg/mL 卡那霉素）。过夜后挑取
单个菌落增菌进行菌液 PCR，对 PCR 阳性的菌液增
菌提取重组质粒行双酶切鉴定。
1.2.3 重 组 WalR 蛋 白 的 表 达 将 上 一 步 筛 选 得
到的重组质粒 PET28a-WalR 转化至大肠杆菌 BL21
（DE3）感受态细胞中，挑取单个菌落增菌并且进
行阳性鉴定，将阳性菌接种到 LB 培养基中（含 50
μg/mL 卡那霉素）培养，37℃监测光密度 A600=0.4-
0.6 时，加入终浓度为 0.2 mmol/L 的 IPTG，12℃诱
导 12 h 后 9 000×g 离心 3 min 收集细菌，重悬细菌
后用超声破菌仪破菌，12 000×g 离心 30 min 后行
SDS-PAGE 检测目的蛋白的表达形式。
1.2.4 B 细胞抗原表位预测 用 DNASTAR Lasergene
v7.1 软 件 结 合 ameson-Wolf 法、Emini 法、Kyte-
Doolittle 法、Karplus-Schulz 法，分别对 WalR 蛋白抗
原指数、表面可能性、亲水性、可塑性进行分析来
分析 WalR 蛋白 B 细胞抗原表位。
1.25 保守性分析 从 NCBI GenBank 数据库中获取
不同型别肺炎链球菌的 WalR 蛋白氨基酸序列，用
ClustalX 2.1 软件分析对 WalR 蛋白的序列保守性。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.7196
2 结果
2.1 WalR基因扩增
肺炎链球菌 D39 全基因组 DNA 为模板扩增目
的片段，经 1% 琼脂糖凝胶电泳分析（图 1-A），可
见大小约为 705 bp 的目的条带，与预期值相符。
2.2 重组表达载体的构建
将扩增的目的基因片段与表达载体 PET-28a 连
接， 转 化 入 大 肠 杆 菌 DH5α， 菌 液 PCR 鉴 定 如 图
1-B 所示。对阳性菌提取重组质粒双酶切鉴定如图
1-C 所示。
形式存在。
2.4 WalR蛋白保守性分析
从 NCBI 蛋白数据库中获得不同型别肺炎链球
菌 WalR 蛋白氨基酸序列 ：SP SMRU1009（登录号 ：
COO32846.1）、SP S-019（ 登 录 号 ：CMX77473.1）、
SP 208_80（登录号 ：CKH25805.1）、SP 0311（登录
号 ：CKI97140.1）、SP 14（ 登 录 号 ：CRH98180.1）、
SP 28F（登录号 ：CRH96017.1），对以上氨基酸序列
进行比对分析，结果（图 3）显示 WalR 蛋白在不同
型别菌株间保守性达 99.4%。
2.5 B细胞抗原表位分析
从图 4 可看出，以亲水性、可塑性、抗原指
数以及表面可能性 4 种方法预测的 WalR 蛋白 B 细
胞抗原表位位置比较接近，综合得到的结果显示其
较可能成为 B 细胞抗原表位的氨基酸区段为 9-16、
35-42、95-111、113-135、150-161、200-218。
3 讨论
肺炎链球菌疫苗的研发对于减缓肺炎链球菌的
耐药具有不可或缺的作用，其发展共经历了 3 代［10］，
第 1 代为 23 价多糖疫苗，第 2 代为 7 价结合疫苗，
第 3 代为蛋白质疫苗。蛋白疫苗的研发已经取得重
要进展，研究证实，对鸭疫里默氏杆菌（Riemerella
anatipestifer）重组外膜蛋白（OmpA）对家禽具有
显著的保护效果［11］。肺炎链球菌谷氨酰胺 tRNA 合
成酶（glutamyl tRNA syn-thetase，Gts）作为肺炎链
球菌疫苗候选蛋白质，其保护效果也在 BALB /c 小
2000
bp
1000
750
500
2000
bp
1000
750
500
1A BM 2 3 M
2000
bp
1000
750
500
C 4 5 M
M ：Marker ；1 ：WalR 基因扩增产物 ；2，3 ：阳性克隆菌的菌液 PCR 产物 ；
4，5 ：重组质粒 PET28a-WalR 双酶切鉴定阳性
图 1 目的基因的扩增（A），重组质粒菌液 PCR（B）与
重组质粒双酶切鉴定（C）
2.3 重组蛋白的诱导表达
重组质粒转化入大肠杆菌 BL21（DE3）后挑取
菌落诱导表达，在经过诱导的菌中看到一条明显的
条带，分子量约为 32 kD 大小，即等于 26 kD 大小
的 WalR 蛋白与 6 kD 大小的 PET28a 标签蛋白的分
子量之和，与预期相符。WalR 蛋白主要集中在破菌
液离心后的沉淀中（图 2），即蛋白主要是以包涵体
117
90
49
35
19
M1 2 3 4 5
M ：maker ；1 ：PET28a 空载诱导 ；2 ：PET28a-WalR-BL21 未诱导 ；
3 ：PET28a-WalR-BL21 破菌液 ；4 ：PET28a-WalR-BL21 上清 ；
5 ：PET28a-WalR-BL21 沉淀
图 2 WalR 重组蛋白表达 SDS-PAGE 鉴定图
2016,32(7) 197韩道宾等：肺炎链球菌 TCSs 中 WalR 的克隆表达、保守性及抗原表位分析
鼠体内得到了验证［12］。有关肺炎链球菌蛋白疫苗
Audouy［13］等已在人体中用单一重组 PspA 变体进
行Ⅰ期临床试验，结果证实此疫苗能诱导针对异源
PspA 分子的广谱交叉反应抗体，产生的抗体可以保
护小鼠抵抗腹腔注射 S.pn 的攻击。Intercell 公司的
S.Pn 三联蛋白疫苗已进入了Ⅱ期临床试验，目前还
没有上市的 S.pn 蛋白疫苗。
双组分系统（TCSs）中蛋白调节对 WalK/R 在
低 GC 含量的革兰氏阳性细菌中具有维持细胞壁及
表面稳态的双重作用［14，15］。研究证实，在金黄色葡
萄球菌（Staphylococcus aureus）RN4220 血清型中通
过基因沉默低表达 WalR 蛋白质后发现细胞对于外
50
50
50
50
50
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100
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100
100
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200
200
200
200
200
200
234
234
234
234
234
234
图 3 不同型别肺炎链球菌 WalR 蛋白保守性分析
230220210200190180170160150140130120110100908070605040302010
0
F
0
-4.5
-1.7
Ӣ≤ᙗਟກᙗᣇ৏ᤷᮠ㺘䶒ਟ㜭ᙗ6
1
图 4 WalR 蛋白 B 细胞抗原表位分析
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.7198
界水解抵抗能力降低［16］。低表达 WalR 蛋白使得细
菌产生侵袭性酶的量减少，细菌的自我保护机制减
弱，从而就容易被杀灭。WalR 蛋白在细胞生长代谢
中的重要地位为其成为肺炎链球菌候选疫苗提供了
保障和支持。
实验通过 ClustalX 2.1 软件对 WalR 的保守性进
行了分析，从它的保守性来看在不同的型别的肺炎
链球菌中 WalR 的保守程度高达 99.4%，这一点为后
期的 WalR 蛋白疫苗制备奠定了基础，使得 WalR 蛋
白疫苗可以产生广泛的保护效果（针对更多的肺炎
链球菌血清型）。对其 B 细胞抗原表位分析显示在
氨基酸序列 9-16、35-42、95-111、113-135、150-
16 1、200-218 可能成为抗原表位。这些抗原表位为
后期抗原表位鉴定提供了依据。实验首先构建重组
表达载体并且在大肠杆菌中表达出 WalR 蛋白，受
翻译速率、折叠速率等因素影响蛋白大部分以包涵
体的形式存在，上清中蛋白量很少，课题组通过摸
索不同温度、转速及 IPTG 浓度（如诱导温度设置
为 12℃、18℃、25℃等 ；转速为 60 r/min、80 r/min、
100 r/min 等；IPTG 浓度为 0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.5
mmol/L、1.0 mmol/L 等）诱导条件，但遗憾的是仍
然未获得呈上清表达的目的蛋白。可溶性蛋白的获
取还需要进一步的摸索诱导表达条件［17］。包涵体中
的蛋白量很大，并且包涵体的致密结构可以使蛋白
质的空间结构得以保留。可以采取进一步的包涵体
溶解和复性获取可溶性蛋白［18，19］。在后续的研究中，
本课题组拟通过蛋白质复性、重新构建质粒等手段，
以期获得上清表达的重组目的蛋白。
4 结论
通过基因重组对 WalR 蛋白质进行了原核表达
得到大量包涵体形式的蛋白质，ClustalX 2.1 软件分
析得出其在不同血清型肺炎链球菌中具有高保守性，
利用 DNASTAR Lasergene v7.1 软件对 B 细胞抗原表
位分析显示在氨基酸序列 9-16、35-42、95-111、
113-135、150-161、200-218 可能成为抗原表位。
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）