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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第3期
收稿日期 : 2011-07-28
基金项目 : 国家自然科学基金项目（31071837）, 华南农业大学“211 工程”项目（2009C010500001）
作者简介 : 黄秀琴 , 女 , 硕士研究生 , 研究方向 : 功能基因挖掘与开发利用 ; E-mail: huangxiuqin001@yahoo.com.cn
通讯作者 : 林俊芳 , 研究员 , 博士生导师 , 研究方向 : 合成生物学工程与生物活性物质 ; E-mail: junfanglin2003@yahoo.com.cn
花生白藜芦醇合酶基因的克隆与生物信息学分析
黄秀琴1, 2 郭丽琼1, 2 李小明1, 2 林俊芳1, 2 袁致浩1 谭铭琛1
（1 华南农业大学食品学院，广州 510640 ；2 华南农业大学生物质能研究所，广州 510640）
摘 要： 利用 Protparam、iPSORT prediction、ProtScale、SOPMA、Swiss-Modeling和 Scan Prosite等生物信息学工具分别对其
理化性质、信号肽、疏水性、亲水性、二级结构和三级结构进行分析。以花生粤油 45总 DNA和总 RNA为模板，采用 PCR和 RT-
PCR技术克隆花生白藜芦醇合酶基因的 DNA和 cDNA序列，并利用 SWISS-PROT、DNAMAN等生物信息学工具对其基因和蛋白质
序列进行了分析。测序结果显示，该基因的DNA和 cDNA序列长度分别为 1 498 bp和 1 251 bp，cDNA序列具有完整的开放性阅读框，
编码 389个氨基酸的多肽。该白藜芦醇合酶氨基酸 368-378位点上存在芪合酶家族的特征位点 GVLFGFGPGLT。同源性分析表明，
其碱基序列与已报道的花生白藜芦醇合酶基因的一致性为 99%，其氨基酸序列与已报道的花生白藜芦醇合酶氨基酸序列的一致性
为 100%。
关键词： 花生 白藜芦醇合酶 基因克隆 序列分析
Cloning and Sequence Analysis of Resveratrol Synthase Gene from
Peanut（Arachis hypogaea L.）
Huang Xiuqin1, 2 Guo Liqiong1, 2 Li Xiaoming1, 2 Lin Junfang1, 2 Yuan Zhihao1 Tan Mingchen1
（1College of Food Science，South China Agriculture University，Guangzhou 510640；2 Institute of Biomass Energy，
South China Agricultural University，Guangzhou 510640）
Abstract: The DNA sequence and cDNA sequence of RS gene were cloned from peanut. The bioinformatics of RS, including physical
and chemical properties, the signal peptide, hydrophobicity, hydrophilicity, secondary structure, and tertiary structure, were analyzed with
bioinformatics softwares, such as Protparam, SignalP, ProtScale, SOPMA, Swiss-Modeling, Scan Prosite. DNA and RNA from peanut Yueyou
45 were used as the template to clone the DNA sequence and cDNA sequence of RS gene by the methods of PCR and RT-PCR. Bioinformatics
softwares were used to analysis the gene and protein sequence. The result showed that DNA and cDNA sequence is 1 498 bp and 1 251 bp,
respectively. The cDNA sequence contained an opening reading frame of 1 170 bp, which coded for 389 amino acid residues.The amino acid
sequence GVLFGFGPGLT was found at position 368-378, which is the family signature sequence for stilbene synthase. The result of alignment
showed that its cDNA sequence has 99% similarity to the RS gene of peanut which has been reported in NCBI, and its protein sequence has
100% similarity to that of peanut.
Key words: Peanut Resveratrol synthase Gene cloning Sequence analysis
白藜芦醇（Res）化学名 3，4，5- 三羟基二苯乙烯，
属于非黄酮类多酚化合物，是一些种子植物受到病
原性进攻和环境恶化时产生的植物抗毒素。随着对
白藜芦醇研究的深入，人们发现其具有广泛的药理
作用，如抗肿瘤［1］、抗心血管疾病［2］、抗炎［3］、免
疫调节［4］、抗菌抗病毒［5］、抗氧化［6］及雌激素样
活性［7］等。此外，它还具有减轻多种因素造成的组
织器官损伤及保护肝细胞的作用。在白藜芦醇的多
种药理作用中最引人注目的是抗肿瘤作用，其抗肿
瘤作用表现为对肿瘤的起始、促进和发展 3 个阶段
均有抑制作用。白藜芦醇通过多种机制对人类肝细
胞癌、乳腺癌、胃癌、肺癌、直肠癌、前列腺癌及
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第3期70
白血病等多种肿瘤细胞产生不同程度的拮抗作用［8］，
其抗肿瘤作用的机制主要表现为抑制肿瘤细胞增殖
和诱导肿瘤细胞凋亡［9］等。
研究表明，在 Res 合成的全过程中，白藜芦醇
合酶（RS）是代谢途径中最后一个起作用的关键
酶［10］，也是合成途径中唯一必须的合成酶，它催
化 1 分子 4- 香豆酰辅酶 A（p-Coumaroyl-CoA）和
3 分子丙二酰辅酶 A（Malonyl-CoA）反应合成白藜
芦醇［11］。白藜芦醇合酶属于芪合酶家族，芪合酶
（stilbene synthase，STS）是芪类化合物合成中的主
要酶类。Res 合成的前体分子在植物体内广泛存在，
它的合成及含量控制主要依赖于 RS 基因的表达状
况［12］。但在自然的条件下，白藜芦醇在植物体内的
含量较低，要用传统的提取方法得到高丰度的白藜
芦醇较困难，并且成本较高。因此，利用基因工程
技术生产白藜芦醇，提高白藜芦醇的产量，满足人
们的医疗保健需求就成为研究的热点。本研究以花
生粤油 45 总 DNA 和总 RNA 为模板，采用 PCR 和
RT-PCR 技术克隆出花生白藜芦醇合酶基因的 DNA
和 cDNA 序列，cDNA 序列命名为 pnrs，同时对其核
酸序列和氨基酸序列进行分析，为利用基因工程方
法生产白藜芦醇提供分子基础。
1 材料与方法
1.1 材料
花生种子粤油 45 购自广东省农业科学院作物
所，并栽种在本实验室。E.coli DH5α 由本实验室保存。
TaKaRa Ex Taq DNA 聚 合 酶、dNTP、TaKaRa
EcoR Ⅰ限制性内切酶、RT-PCR 试剂盒 PrimeScript
RT-PCR Kit 购自大连宝生物工程有限公司。RNA 提
取试剂盒购自天泽基因工程有限公司。T4 DNA 连接
酶、克隆载体 pGEM-T Easy vector 购自广州莱德尔
生物科技有限公司。PCR 产物纯化试剂盒、质粒提
取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司。其他化
学试剂均为分析纯，购自广州威佳公司。引物合成
于上海生工生物工程有限公司。测序由华大基因科
技有限公司完成。
1.2 方法
1.2.1 总 DNA 及总 RNA 的提取 以花生新鲜嫩叶
为材料提取基因组 DNA 和总 RNA。基因组 DNA 的
提取用 CTAB 法，提取步骤参考文献［13］，并略
作修改 ；总 RNA 的提取采用天泽基因工程有限公
司的 RNA-out 试剂盒。用微量紫外分光光度计测定
DNA 和 RNA 浓度，选取 A260/A280 值在 1.8-2.0 的样
品于 -20℃保存备用。
1.2.2 PCR 引物的设计与合成 根据已报道的花
生 RS 基 因 序 列（GenBank 登 录 号 AF227963 和
HP010936）分别设计 PCR 引物。DNA 扩增上游引
物 1F: 5-AGTATGGTGTCTGTGAGT-3， 下 游 引 物
1R: 5-AGTTATATGGCCACACTG-3；cDNA 扩 增 上
游引物 2F: 5-CATAGCTAATAAGCTTTGCTC-3，下
游引物 2R: 5-TAAGTGTATCAGATGGTCACA-3。引
物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
1.2.3 白藜芦醇合酶基因的 PCR 扩增 以提取的
总 RNA 为模板，根据 TaKaRa PrimeScript RT-PCR
Kit 的说明书进行反转录，合成第一链的 cDNA。分
别使用 1F/1R 和 2F/2R 引物对，Ex Taq酶，以提取
的总 DNA 以及合成的 cDNA 为模板进行 PCR 扩增，
50 μL 的反应体系中，分别加入 dNTP Mixture（each
2.5 mmol/L）2.0 μL，10×PCR Buffer 5.0 μL，DNA 模
板 1.0 μL，5端引物和 3端引物各 2.0 μL（浓度为
10 μmol/L），Ex Taq酶 0.5 μL，ddH2O 37.5 μL。PCR
程序 : 94℃ 4 min，94℃ 45 s，44℃（cDNA 扩增时
退火温度为 46℃）40 s，72℃ 1 min 40 s，35 个循环；
最后 72℃延伸 10 min。PCR 产物经 1% 的琼脂糖凝
胶电泳检测。
1.2.4 TA 克隆及序列测定 回收目的片段，与
pGEM-T Easy vector 连接。连接体系如下 ：pGEM-T
Easy Vector 1 μL，2×Rapid Ligation Buffer 5 μL，T4
DNA Ligase（3 Weiss units/μL）1 μL，上述纯化 PCR
产物 3 μL，4℃连接过夜。全量连接产物（10 μL）
转化 E.coli DH5α 感受态细胞（100 μL）。蓝白斑筛
选获得单克隆，EcoR Ⅰ酶切鉴定正确后送到华大基
因测序。
1.2.5 序列分析 核酸序列比对在 NCBI BLAST
（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov）上进行，氨基酸序列比
对、蛋白质结构与功能的预测在Swiss-Prot（http://www.
expasy. ch/sprot/）网站提供的链接平台上进行。序
列分析用 DNassist2.0 和 NCBI Spidey 完成，核酸与
氨基酸序列绘制用 DNAMAN 完成。利用 Protparm、
2012年第3期 71黄秀琴等 ：花生白藜芦醇合酶基因的克隆与生物信息学分析
iPSORT prediction、Scan Prosite、ProtScale、SOPMA、
Swiss-Modeling［14］等生物信息学工具分别对其理化
性质、信号肽、结构域、疏水性、亲水性、二级结
构和三级结构进行分析。
2 结果
2.1 花生粤油45总DNA和RNA的提取
CTAB 法提取花生粤油 45 基因组 DNA 的结果
如图 1 所示。从图 1-A 中可以看出，花生粤油 45
基因组 DNA 序列大于 21 kb，提取的基因组 DNA
条带清晰，A260/A280 值在 1.8-2.0 之间，该样品纯
度较高。
用 RNA-out 试剂盒提取花生粤油 45 总 RNA（图
1-B），28S 和 18S 的 RNA 条带清晰，比例适当，没
有明显的降解痕迹，说明 RNA 样品完整性良好。
A260/A280 值 >1.9，RNA 纯度较高。因此，所获得的
DNA 和 RNA 在纯度和完整性方面均符合要求，可
用于后继试验。
2.2 白藜芦醇合酶基因的克隆
以花生粤油 45 基因组 DNA 为模板，1F 和 1R
为引物，进行 PCR 扩增，获得一条特异性扩增的
PCR 产物，大小约为 1 500 bp（图 2）。其片段大小
与预期特异条带相符。
提取花生总 RNA，反转录为 cDNA 后，以 2F
和 2R 为引物，cDNA 为模板进行 PCR 扩增，同样
获得一条特异性扩增的条带，大小约为 1 250 bp（图
2）。其片段大小与预期特异条带相符，且 PCR 扩增
产物纯度较高，无其他非特异条带。
2.3 阳性克隆质粒的鉴定
将 PCR 产物和 RT-PCR 产物分别回收纯化后，
与 pGEM-T Easy 载体连接，转化 E.coli DH5α 感受
图 1 花生粤油 45总 DNA（A）和 RNA（B）的电泳分析
2.4 白藜芦醇合酶基因序列比对
阳性重组质粒测序后表明，已获得的花生粤油
45 白藜芦醇合酶基因的 DNA 片段长度为 1 498 bp，
cDNA 片段为 1 251 bp。cDNA 序列命名为 pnrs，包
含 1 170 bp 的完整阅读框，在 NCBI 上进行比对，
与花生 RS 基因序列相似性达到 99%，有 11 个碱基
的差异，氨基酸序列在 Swiss-Prot 上进行比对（图 4）
显示与花生白藜芦醇合酶基因相似性为 100%。这些
结果表明，成功克隆了花生 RS 基因，序列结果和
推导的氨基酸序列。该基因 DNA 序列与 cDNA 序列
的比对结果及 NCBI Spidey 分析表明，该基因具有 1
图 2 花生粤油 45白藜芦醇合酶基因 PCR扩增和
RT-PCR扩增
M.DNA Marker ；CK. 对照 ；1，2. 表示重组质粒经 EcoR Ⅰ酶切后条带
图 3 重组质粒的酶切鉴定
态细胞，利用蓝白斑菌落筛选阳性重组克隆 pGEM-
RSDNA 和 pGEM-RScDNA。阳性克隆质粒经 EcoR Ⅰ
单酶切鉴定，都出现与预期大小相符的条带，其大
小分别约为 1 500 bp 和 1 250 bp（图 3）。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第3期72
个内含子，位于 DNA 序列的 179-501 bp 处，外显
子和内含子的连接具有保守的 GT-AG 组成，把整个
基因分为 2 个外显子。利用 gene-regulation 网站的
AliBaba2.1 对启始密码子前面的 73 bp 碱基序列进行
了转录因子结合位点预测，最可能的转录因子结合
位点（图 4）。
圆圈表示起始密码子和终止密码子 ；方框表示转录因子结合位点 ；三角形表示蛋白激酶 C 磷酸化作用位点 ；单下
划线表示芪合酶活性部位 ；双下划线表示芪合酶家族的特征位点 GVLFGFGPGLT ；波浪线表示 N- 糖基化位点
图 4　pnrs cDNA序列和推导的氨基酸序列
2.5 pnrs基因的生物信息学分析
2.5.1 理化性质预测 序列比对得到 pnrs 基因的编
码区并推导其氨基酸序列，结果显示 pnrs 基因编码
一个长为 389 个氨基酸的多肽，利用 ProtParam 工具
2012年第3期 73黄秀琴等 ：花生白藜芦醇合酶基因的克隆与生物信息学分析
预测表明其相对分子量为 42.8 kD，等电点为 5.70，
半衰期理论值为 30 h，不稳定参数为 33.64，属于稳
定蛋白，有利于进一步对其进行研究。
2.5.2 信号肽预测和分析 分泌蛋白及细胞膜蛋白
均以前体物质多肽的形式合成，其 N- 末端含有作为
通过膜时信号的氨基酸序列，这种氨基酸序列称信
号肽或信号序列，由 15-25 个氨基酸所组成。利用
在线网站 iPSORT prediction 预测信号肽定位，结果
显示该氨基酸序列不含信号肽，含有一个线粒体转
运肽。用 SignaIP 3.0 Server 分析此蛋白，结果显示
pnrs 基因表达的蛋白是非分泌型蛋白，信号肽可能
性值为 0.015，信号结合可能性值为 0。
2.5.3 亚细胞定位和分析 导肽是一段引导新合成
的肽链进入细胞器的识别序列。因此，预测和分析
导肽，对正确认识蛋白质的亚细胞定位和功能作用
的途径与机制有一定的意义。利用 TargetP 1.1 Server
工具预测此蛋白的亚细胞定位，结果表明此蛋白为
叶绿体转运蛋白（分值为 0. 061）和分泌蛋白（分
值为 0.146，）的可能性较小，推测该蛋白不含信号肽，
可能为线粒体转运蛋白（分值为 0.247）。
2.5.4 结构域分析 ScanProsite 分析（图 4）显示，
该氨基酸序列含有完整的芪合酶家族的特征位点
GVLFGFGPGLT。通过 NCBI 网站的 conserve domains
分析氨基酸序列的保守结构域，结果（图 4）显示
该序列具有芪合酶活性部位。MotifScan 分析（图 4）
显示该氨基酸序列含有 2 个 N-糖基化位点，1 个蛋
白激酶 C 磷酸化作用位点，7 个 N-酰基化作用位点，
1个cAmp和 cGmp依赖的蛋白激酶磷酸化作用位点，
7 个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化作用位点。
2.5.5 疏水性和亲水性的预测与分析 利用 prots-
cale 在线预测 pnrs 氨基酸序列的亲疏水性，结果如
图 5 所示，整个肽链中最高疏水峰值为 2.322，最高
亲水峰值-2.533，利用 ProtParam 工具预测显示其总
平均疏水值为-0.074。总体来看，亲水性氨基酸较为
均匀的分布在整个肽链中，且略多于疏水性氨基酸。
因此，除了局部的疏水区域，整个肽链表现为弱亲
水性。
2.5.6 二级结构的预测和分析 通过 SOMPA 预测
PNRS 的二级结构，结果显示 PNRS 含有 41.13% 的 α-
螺旋，17.74% 的延伸链，9.51% 的 β-转角和 31.62%
的无规则卷曲可以看出，PNRS 蛋白含有较多的 α-
螺旋和无规则卷曲，而延伸链和 β-转角则散布于整
个蛋白中（图 6）。
2.5.7 三级结构预测与分析 利用 Swiss-Modeling 工
峰值大于零为疏水性峰，峰值小于零为亲水性峰
图 5　pnrs基因编码蛋白的氨基酸序列疏水性 /亲水性预测
α- 螺旋，延伸链，β- 转角，无规则卷曲分别用高度依次降低的竖线表示
图 6　pnrs基因编码蛋白的二级结构预测
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第3期74
具对 pnrs 的氨基酸序列进行蛋白质三维结构的同源
建模，获得 PNRS 氨基酸序列的预测三级结构（图 7），
可以更直观地看出，结构中含有较多的 α- 螺旋和无
规则卷曲。
图 7　PNRS蛋白三级结构预测图
3 讨论
白藜芦醇（Res）作为植物抗毒素不仅能使植物
对某些疾病产生抗性，而且对人体有重要的保健作
用。RS 在 Res 的合成中起着重要的作用，伴随着基
因工程技术的建立与发展，RS 基因的研究己成为目
前的一大热点。RS 基因序列虽然已被报道，但并未
对其进行详细的生物性息学分析。
白藜芦醇合酶基因是一个多基因家族，目前已
经从葡萄、花生、松树等植物种类中发现此基因［15］，
并且已成功导入多种植物中。本研究从花生粤油 45
嫩叶中克隆得到了 RS 基因的 cDNA 和 DNA 全长序
列，与已报道的花生 RS 基因的核酸序列相似性达
到 99%，氨基酸序列的相似性达到 100%。
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（责任编辑 狄艳红）