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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(7):201-206
传统中医理论认为金银花具有清热解毒、疏
利咽喉、消暑除烦的功效。新鲜金银花含水量约为
80%，颜色嫩绿，但新鲜金银花不利于运输及储存，
必须及时干燥。干燥过程极易造成金银花外观颜色
严重褐变，同时，其主要功效成分绿原酸和木犀草
苷含量明显下降，金银花药用价值损失很大［1］。为
探究金银花在干燥过程中酶促褐变的机理，有必要
提取分离高纯度的 PPO 作酶学性质的相关研究。
目前，PPO 提取方法有匀浆法和丙酮粉法。匀
浆法操作简单，所得酶液活性较强，但多酚类物质
残留量较高，酶液纯度偏低。丙酮粉法主要是通过
丙酮使细胞膜的磷脂结构破坏，从而改变细胞膜的
通透性，再经过提取可使膜结合的 PPO 或胞内的
PPO 释放出胞外。相对于匀浆法而言，其酶粉活性
尚可、体积小且便于贮存，可直接应用［2］。田玉庭［3］
曾用丙酮粉法提取澳洲青苹 PPO，经初步纯化后，
SDS-PAGE 凝胶电泳检测仅显示一条电泳带。Ben-
Shalom 等［4］用丙酮粉法提取橄榄果实中的 PPO，也
取得了良好的效果。目前，尚未有响应面优化丙酮
粉法提取金银花多酚氧化酶的相关研究报道，本研
收稿日期 ： 2014-11-18
基金项目 ：国家自然科学基金（U1304330）
作者简介 ：屈政，男，硕士研究生，研究方向 ：天然活性物质的提取 ；E-mail ：402526581@qq.com
通讯作者 ：罗磊，男，博士，副教授，研究方向 ：天然活性物质 ；E-mail ：13623896431@139.com
响应面优化丙酮粉法提取金银花多酚氧化酶
屈政  罗磊  杨彬  康新艳 
（河南科技大学食品与生物工程学院，洛阳 471023）
摘 要： 对丙酮粉法提取金银花多酚氧化酶的工艺进行研究，结果表明，缓冲液 pH、料液比、提取时间对 PPO 比活力影响显
著。缓冲液 pH 与料液比交互作用极其显著，回归模型拟合性良好（R2=99.31%）；影响显著顺序为 ：静置时间 > 缓冲液 pH 值 > 料
液比 ；最优化工艺参数为 ：缓冲液 pH7.5，料液比为 1∶120，提取时间为 14.5 min。在此条件下，酶比活力为 137.389 U/mg。
关键词 ： 金银花 ；多酚氧化酶 ；丙酮粉 ；提取 ；响应面
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.031
Optimizing the Method of Acetone Powder to Extract Polyphenoloxidase
from Honeysuckle Using Response Surface Methodology
Qu Zheng Luo Lei Yang Bin Kang Xinyan
（College of Food and Bioengineering，Henan University of Science and Technology，Luoyang 471023）
Abstract: In this study, the method of acetone powder was optimized to extract the polyphenoloxidase（PPO）from honeysuckle flowers
（Lonicera japonica）by response surface methodology. The results showed that three operating parameters had great effects on the PPO specific
activity, and their effects were ranked as follows ：extraction time > buffer pH > material-to-liquid ratio. The established regression model was
highly fitting（R2 = 99. 31%）, and the interaction effect between buffer pH and material-to-liquid ratio was extremely significant. The optimal
extraction condition was pH 7. 49, material-to-liquid ratio 1∶120 and extraction time 14. 5 min, under which the PPO specific activity was 137.
389 U/mg.
Key words: Lonicera japonica ；polyphenoloxidase ；acetone powder ；extract ；response surface
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.7202
究对其进行初步探索。
1 材料与方法
1.1 材料
无损伤、未开花、品质良好的新鲜金银花，购
于河南省孟津县益丰金银花生产基地，品种为金丰
一号。丙酮、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸、氢
氧化钠、邻苯二酚、考马斯亮蓝 G-250、牛血清蛋白。
以上均为分析纯。
飞利浦 HR2850 搅拌机、天孚 DT510L 电子天平、
湘仪 H1850R 冷冻离心机、SHB- Ⅲ循环水式多用真
空泵，郑州长城科工贸易有限公司；DYY-6C 电泳仪，
北京市六一仪器厂 ；UV2400 紫外可见分光光度计，
舜宇恒平科学仪器有限公司 ；PHS-3C PH 计，上海
越平科学仪器有限公司。
1.2 方法
1.2.1 酶的提取 10 g 样品加入一定体积 -20℃ 丙
酮中，打浆 1 min（打 10 s 停 5 s），迅速用布氏漏斗
抽滤，将滤饼溶于冷冻丙酮中反复抽滤，至滤饼无
色为止。将滤饼置于培养皿中，在室温下干燥，待
丙酮完全挥发后，即得丙酮粉。丙酮粉溶于一定 pH
磷酸盐缓冲液中，静置若干时间，用八层纱布过滤
后在冻离心机中离心，取上清液，即为 PPO 粗酶液［5］。
1.2.2 酶活力的测定 向 3 mL pH 7.0 的磷酸盐缓冲
液和 1 mL 0.01 mol/mL 的邻苯二酚的混合溶液中加
入 1 mL PPO 粗酶液，混合均匀后，测定其在 2 min
内 420 nm 下的吸光度，从加入粗酶液开始计时，每
10 s 记录一次 OD 值，用 PBS 和邻苯二酚混合液为
参比，通过最初直线段较稳定的斜率来计算 PPO 活
力［6］。一个酶活力单位（U/mL）定义为 ：每单位时
间内引起吸光度改变 0.001 所需的酶量。
ΔA × Vr
W × Vs × t × 0.001
䞦⍫=
其中，A ：吸光度的变化量 ；Vr ：加样缓冲液
总体积（mL）；Vs ：取样比色体积（mL）；W ：取样
质量（g）。
1.2.3 蛋白质浓度的测定 采用 Bradford 考马斯亮
蓝法测定 PPO 含量，用牛血清蛋白制作标准曲线［7］，
标准曲线方程为 ：
y=4.8279x-0.0158，R2=0.9992
其中，y：吸光度，x：蛋白质质量浓度（mg/mL）。
1.2.4 PPO 比活力的测定 PPO 比活力是指每毫克
PPO 所具有的活力数。比活力越大，表示 PPO 的纯
度越高［8］。计算公式如下：比活力 = 活力（U/mL）/ 蛋
白质质量浓度（mg/mL）。
1.2.5 单因素试验
1.2.5.1 缓冲液 pH 值的选择 按料液比为 1∶100，
取 1 g 丙酮粉，分别加入 100 mL pH 为 6.0、6.5、7.0、
7.5、8.0 的 PBS 中，静置 30 min 后，8 层纱布过滤。
用高速冷冻离心机在 4℃、10 000 r/min 的条件下离
心 15 min，分别测定上清液中酶的比活力。
1.2.5.2 料液比的选择 取 1 g 丙酮粉，分别加入
60、100、140、180、220 mL pH 为 7.5 的磷酸盐缓
冲液中，静置 30 min 后，8 层纱布过滤。用高速冷
冻离心机在 4℃、10 000 r/min 的条件下离心 15 min，
分别测定上清液中酶的比活力。
1.2.5.3 提取时间的选择 取 1 g 丙酮粉，加入料液
比 1∶100，pH 为 7.5 的磷酸盐缓冲液中，分别静置
0 min、30 min、1 h、1.5 h、2 h 后，八层纱布过滤。
用高速冷冻离心机在 4℃、10 000 r/min 的条件下离
心 15 min 后，测定各上清液中酶的比活力［9-11］。
1.2.6 丙 酮 粉 法 提 取 金 银 花 PPO 工 艺 响 应 面 实
验 根据单因素实验结果，以缓冲液 pH 值、料液比、
提取时间构建二元回归模型，采用响应面分析方法
对提取金银花 PPO 比活力大小的影响进行分析。
2 结果
2.1 缓冲液pH值的影响
由图 1 可知，不同 pH 值的磷酸盐缓冲液提取
20
40
60
80
100
6 6.5 7 7.5 8㕃ߢ⏢pHPPO∄⍫࣋U·mg-1 
图 1 缓冲液 pH 值对 PPO 比活力的影响
2015,31(7) 203屈政等 ：响应面优化丙酮粉法提取金银花多酚氧化酶
金银花 PPO 丙酮粉，所得 PPO 比活力有明显的差异。
当 pH 小于 7.5 时，PPO 比活力随着缓冲液 pH 值的
增大而增大。当 pH 到达 7.5 时，PPO 比活力到达一
个峰值。当 pH 大于 7.5 时，PPO 比活力出现明显下
降的趋势。
2.2 料液比的影响
由 图 2 可 知， 当 料 液 比 大 于 1∶100 时，PPO
比活力随着料液比的增加上升明显，当料液比小于
1∶100 时，PPO 比活力出现了略微下降的趋势后基
本保持不变。
2.4 响应面试验设计与分析
2.4.1 响应面因素水平的选取 综合单因素实验结
果，缓冲液 pH 值、料液比、提取时间三因素对金
银花 PPO 的比活力有较为明显的影响。根据 Box-
Behnken 的原理，在单因素数据结果的基础上，采
取三因素三水平响应面实验设计分析方法，实验因
素与水平设计见表 1。
表 1 响应面试验设计的因素和水平
水平
因素
X1 pH X2 料液比 X3 提取时间 /min
-1 7.2 1∶80 10
1 7.5 1∶100 15
0 7.8 1∶120 20
2.4.2 响应面试验设计与结果 以 pH 值（X1）、料
液比（X2）、提取时间（X3）为自变量，以比活力（Y）
为响应值，设计实验方案及结果见表 2。
表 2 Box-Behnken 试验设计与结果
实验号 X1pH X2 料液比 X3 提取时间 Y 比活力
1 -1 -1 0 92.6
2 1 -1 0 118
3 -1 1 0 112.7
4 1 1 0 110.6
5 -1 0 -1 68.5
6 1 0 -1 80
7 -1 0 1 58.5
8 1 0 1 68.5
9 0 -1 -1 100
10 0 1 -1 109.7
11 0 -1 1 87.1
12 0 1 1 86.7
13 0 0 0 130.2
14 0 0 0 136.3
15 0 0 0 130.4
16 0 0 0 136
17 0 0 0 129.8
2.4.3 回归方程的建立与检验 表 2 中 17 个实验选
择分为响应面的析因点和零点，其中序号 1 到 12 的
实验为析因试验，13 到 17 为中心实验。析因点自
变量在由 X1、X2、X3 因素所构成的三维顶点上取值，
零点则在对应区域的中心点。一般情况下，零点实
70
90
100
1:60 1:100 1:140 1:180 1:220ᯉ⏢∄PPO∄⍫࣋U·mg-1  80
图 2 料液比对 PPO 比活力的影响
2.3 静置时间的影响
由图 3 可知，随着提取时间的延长，PPO 比活
力逐渐增加，15 min 时达到峰值。随着提取时间的
继续增加，PPO 比活力开始下降。可能的原因是随
着提取时间的增加，越来越多的 PPO 溶入到了缓冲
液中，比活力随之增加。当在某一时间，PPO 完全
溶入缓冲液后，随着提取时间的继续增加，受提取
环境的影响，本身构相并不稳定的 PPO 活力开始下
降，因此比活力逐渐降低。
20
40
60
80
0 15 30 45 60䶉㖞ᰦ䰤min
图 3 提取时间对 PPO 比活力的影响
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.7204
验要重复进行 5 次，以便于实验的估计误差。由于
各因素对比活力的影响均不是简单的线性关系，所
以采用 Design-Expert 软件对表 2 的响应值分别进行
多元回归拟合，并确定各因素对响应值的影响。各
因素回归拟合后，响应变量 Y 对 pH 值、料液比、
提取时间的二次多项回归模型如下 ：
Y=-17189.37750+4392.41667X1+8.37625X2+4
8.72400X3-1.14583X1X2-2.5000X1X3-0.025250X2X3-
283.69444X1
2+3.66875E-0.003X2
2-1.52530X3
2。
表 3 回归模型方差分析表
方差来源 平方和 自由度 df F 值 P 值 拟合优度 R2
模型 10281.19 9 111.93 <0.001 0.9931
X1 250.88 1 24.58 0.006
X2 60.5 1 5.93 0.0451 调整后拟合优度
X3 411.84 1 40.35 0.004 adjR
2
失 失拟 27.77 3 0.85 0.5354 0.9842
2.4.4 回归方程的参数评估 由表 4 可知，X1、X3、
X1X2、X1
2、X3
2 对提取金银花 PPO 比活力影响极显
著，X2 对提取金银花 PPO 比活力影响显著。其中，
三因素对提取金银花中 PPO 比活力影响的主次顺序
是 pH 值 > 浸提时间 > 料液比。
表 4 回归模型系数显著性检验表
来源 平方和 自由度 df 均方 F 值 P 值 显著性
X1 250.88 1 250.88 24.58 24.58 **
X2 60.5 1 60.5 5.93 5.93 *
X3 411.84 1 411.84 40.35 40.35 **
X1X2 189.06 1 189.06 18.52 18.52 **
X1X3 0.56 1 0.56 0.055 0.055 不显著
X2X3 25.5 1 25.5 2.5 2.5 不显著
X1
2 2744.84 1 2744.84 268.95 268.95 **
X2
2 9.07 1 9.07 0.89 0.89 不显著
X3
2 6122.47 1 6122.47 599.89 599.89 **
注 ：* P<0.05，表示差异显著 ；** P<0.01，表示差异极显著
2.4.5 最佳提取工艺的优化及验证 通过 Design-
Expert 的最优化模型回归分析，得到最佳的提取工
艺 条 件 为，pH7.49， 料 液 比 1∶120、 静 置 时 间 为
14.37 min，此条件下 PPO 酶的比活力的预测值为
137.389 U/mg。为便于实际操作，把最佳提取工艺修
正为 pH 7.5，料液比 1∶120、静置时间为 14.5 min。
为验证响应面法优化结果的可靠性，在修正条
件下，采用丙酮粉法对金银花 PPO 进行了提取，进
行 5 次验证试验，得到平均比活力为 131.732 U/mg，
结果与预测值相近。验证表明，拟合模型对于提取
金银花 PPO 比活力的影响有较好的预测能力。
3 讨论
3.1 缓冲液pH值对PPO比活力的影响
PPO 在弱碱性条件下构相稳定性最高，活性最
大［12］；而在酸性或者强碱性条件下，PPO 会聚集、
变性，从而影响比活力。
3.2 料液比对PPO比活力的影响
料液比过高，使丙酮粉未能完全溶于缓冲液中，
提取不彻底造成 PPO 比活力不高。随着缓冲液体积
的增加，丙酮粉中的 PPO 开始逐渐完全的溶入到缓
冲液中，从而比活力增加［13］。当料液比达到一定值
时，丙酮粉中 PPO 和缓冲液的溶合达到一种平衡状
态，当料液比继续增加时，PPO 可能会从缓冲液中
溶出，造成比活力的降低［14］。
3.3 静置时间对PPO比活力的影响
随着提取时间的增加，越来越多的 PPO 溶入
到了缓冲液中，比活力随之增加。当在某一时间，
PPO 完全溶入缓冲液后，随着提取时间的继续增加，
受提取环境的影响，本身构相并不稳定的 PPO 活力
开始下降，因此比活力逐渐降低。
3.4 回归方程的方差分析
对该模型进行方差分析（表 3），模型的 F 值为
111.93，P 值 <0.001，远小于一般显著性检验规定
（P<0.05 为显著，P<0.01 为极显著），说明二次多项
式模型极显著 ；失拟项的 P 值 0.5354>0.05，说明
模型失拟度不显著。回归方程的拟合度还可通过拟
合优度 R2 和调整后拟合优度 adjR2 来验证，二次多
项式的模型的预测值与试验真实值之间的相关性达
99.31%，调整拟合优度 98.42%，表明该模型能够解
释 98.42% 响应值的变化，模型拟合程度良好。故可
用此模型对丙酮粉法提取 PPO 粗酶液的比活力的大
小进行分析和预测。
3.5 响应面交互作用分析
如图 4 所示，X1、X2 在不同程度上对 PPO 比
2015,31(7) 205屈政等 ：响应面优化丙酮粉法提取金银花多酚氧化酶
活力有影响，且二者交互作用极为显著，可能是 pH
影响酶液的总酶活，料液比影响酶液中酶的浓度。
二者的变化，引起了 PPO 比活力的变化 ；或者是料
液比对酶浓度的影响随着 pH 值的变化而变化，进
而影响 PPO 比活力的变化。X1、X3 对 PPO 比活力
影响最大，但二者交互作用却不显著，可能是 pH
对酶活性的影响和提取时间对酶浓度的影响的差异
不显著。X2X3 亦是如此。
3.6 匀浆法和丙酮法的对比研究
有文献报道，罗磊等［7］曾用响应面优化匀浆法
提取金银花中 PPO 酶，得到酶的比活力为 654.998
U/mg。丙酮粉法虽然对酶活性损失较大，但其酶
粉活性尚可，且纯度较高，可直接应用，并为研究
PPO 酶学性质打下了良好的基础。采用聚丙烯酰胺
凝胶电泳对罗磊优化的匀浆法和本试验优化的丙酮
粉法提取的粗酶液进行检测［18］，结果显示丙酮粉法
140
130
120
110
100
90
1.00
0.50
0.00
-0.50
-1.00 -1.00
-0.50
0.00
0.50
1.00
-1.00
-0.50
0.00
0.50
1.00
-1.00 -0.50 0.00 0.50 1.00A: pH
A: pH
B: ᯉ⏢∄ B: ᯉ⏢∄∄⍫࣋U·mg-1 
∄⍫࣋U·mg-1
140
120
100
80
60
40
1.00
0.50
0.00
-0.50
-1.00 -1.00
-0.50
0.00
0.50
1.00
-1.00
-0.50
0.00
0.50
1.00
-1.00 -0.50 0.00 0.50 1.00A: pH
A: pH
C: 䶉㖞ᰦ䰤 C: 䶉㖞ᰦ䰤∄⍫࣋U·mg-1 
∄⍫࣋U·mg-1
140
130
120
110
100
90
80
1.00
0.50
0.00
-0.50
-1.00 1.00
-0.50
0.00
0.50
-1.00
-1.00
-0.50
0.00
0.50
1.00
-1.00 -0.50 0.00 0.50 1.00C: 䶉㖞ᰦ䰤
B: ᯉ⏢∄B: ᯉ⏢∄ C: 䶉㖞ᰦ䰤∄⍫࣋U·mg-1 
∄⍫࣋U·mg-1
100
100
100
100
100
110
110
110
110
110
120
120
120
120
130
130
130
130
130
130
5
5
5
120
120
图 4 缓冲液 pH 值与料液比 pH 与静置时间、料液比、与静置时间交互作用的响应面和等高线
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.7206
提取的酶液清晰，在没有进一步提纯的条件下仅有
4 条谱带 ；匀浆法提取的酶液谱带较多，且不清晰。
由此可见，匀浆法的酶液含有较多的杂蛋白，而丙
酮法提取的酶液蛋白纯度较高。因此，为了进一步
研究金银花在干燥过程中的褐变机理，应选用丙酮
粉法。
4 结论
由单因素试验可知，缓冲液 pH 值、料液比、
提取时间对 PPO 比活力有显著的影响。构建的二次
回归模型，拟合性良好，验证了三因素对 PPO 比活
力影响显著。其中 pH 值和静置时间极其显著、pH
值和料液比交互作用极其显著。
优化条件为缓冲液 pH 7.5，料液比为 1∶120，
静置时间为 14.5 min，并与验证试验相符。经电泳
检测，丙酮粉法提取酶液纯度较匀浆法高，因此选
用丙酮粉法提取金银花 PPO。
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）