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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第5期
氧化还原酶是催化制备羟基酸、手性醇、氨基
酸等的一类重要的酶类。而在氧化还原酶所催化的
反应中，约 80% 的反应需要尼克酰胺腺嘌呤二核苷
酸（NAD，NADH）作为辅酶，一定量的辅酶会随
着合成产物的生成而消耗，因此氧化还原酶在应用
中特别需要高效、低成本的辅酶再生系统 ［1］。
甲酸脱氢酶（Formate Dehydrogenase，FDH，EC1.
收稿日期 ：2012-11-27
作者简介 ：李天明，男，硕士，研究方向 ：分子定向进化与生物催化 ；E-mail ：iamltm2000@hotmail.com
通讯作者 ：冯惠勇，女，教授，硕士生导师，研究方向 ：分子定向进化与生物催化 ；E-mail ：fenghuiyong@163.com
Pseudomonas sp. 101 甲酸脱氢酶基因的合成、表达及
定点饱和突变
李天明1  朱灵桓2  刘天佳1  戴宝新1  冯惠勇1
（1. 河北科技大学生物科学与工程学院，石家庄 050018 ；2. 大连工业大学生物工程学院，大连 116034）
摘 要 : 甲酸脱氢酶（FDH）是氧化还原酶辅酶 NAD+ 和 NADH 再生循环体系中的关键酶，具有重要的应用价值和产业化
应用前景。通过采用重叠延伸 PCR 技术，人工合成编码 FDH 的基因 fdh，构建原核表达载体 pET30a-fdh，以 E.coli BL21（DE3）
为表达宿主，获得了能可溶性表达的甲酸脱氢酶的重组菌 ；经 16℃ IPTG 诱导表达，重组酶的比活力为 8.7 U/mgPro ；为了提
高 FDH 的稳定性，采用融合 PCR 方法对 fdh 基因进行了定点饱和突变，经筛选，获得了酶活未变但稳定性有所提高的突变酶
Cys146AlaCys354Ala，其稳定性比野生酶提高了 2.5 倍。
关键词 : 甲酸脱氢酶 基因合成 原核表达 饱和突变
Synthesis，Expression and Directed Evolution of the Formate
Dehydrogenase Gene from Pseudomonas sp. 101 by
Saturation Mutagenesis
Li Tianming1 Zhu Linghuan2 Liu Tianjia1 Dai Baoxin1 Feng Huiyong1
（1. College of Biological Science and Engineering，Hebei University of Science and Technology，Shijiazhuang 050018 ；2. College of
Biological Engineering，Dalian Polytecnic University，Dalian 116034）
Abstract:  Formate dehydrogenase （FDH） is a key enzyme in NAD+-NADH coenzyme regeneration system, which has an important
application value and industrial application prospect. In the paper, the gene （fdh） encoding format dehydrogenase （FDH） was artificially
synthesized by overlapping PCR. Recombinant plasmid pET30a-fdh was constructed and transformed to E.coli BL21 （DE3）. The recombinant
FDH expressed in E.coli induced with IPTG at 16℃, mainly existed in a soluble form and reached a specific activity of 8.7 U/mgPro after
purification. To improve the stability of FDH, the saturation mutagenesis of fdh was performed by using the overlapping PCR and the mutant
enzyme Cys146AlaCys354Ala was screened. The activity of the two had no change, but the mutant gave rise to 2.5 fold enhancement of stability
compared to that in its wild type.
Key words:  Formate dehydrogenase Gene synthesis Prokaryotic expression Site-directed mutagenesis
2.1.2）是氧化还原酶辅酶 NAD+ 和 NADH 再生循环
体系中的关键酶，它可以将甲酸氧化为 CO2，同时
将 NAD+ 还原为 NADH ［2］。甲酸 / 甲酸脱氢酶作为
NADH 再生系统，其优势在于反应不可逆，甲酸价
格低廉且很多酶对此有很高的耐受性 ；此反应只产
生一种副产物 CO2，对任何酶的活性均没有任何影
响，而且很容易从反应体系中释放出来，有利于产
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第5期106
物的分离、纯化［3］。在需要辅酶 NADH 再生的反应中，
甲酸脱氢酶具有重要的应用价值和产业化应用前景。
德 国 Degussa 公 司 利 用 博 伊 丁 假 丝 酵 母（Candida
boidinii）FDH 再生 NADH 生产 ter-L-亮氨酸，是成
功利用酶法生产医药产品的典型例子之一［4］。
人工合成 DNA 是合成生物学研究的基础，利
用重叠延伸 PCR（gene splicing by overlap extension，
SOE PCR）技术合成所需要的目的基因序列，在
多个领域广泛应用［5］。本研究采用利用重叠延伸
PCR，根据 Pseudomonas sp. 101 来源的甲酸脱氢酶
氨基酸序列［6］，成功合成了具有大肠杆菌碱基偏好
性的 FDH 编码基因，并在 E.coli BL21（DE3）中得
到高效表达 ；为提高 FDH 的稳定性，采用融合 PCR
方法对 FDH 基因进行了饱和定点突变，旨在为 FDH
的广泛应用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种和质粒 试验中需用的大肠杆菌 E.coli
DH5α，E.coli BL21（DE3）和 pET-30a 均为实验室保藏。
1.1.2 主 要 试 剂 重 叠 PCR DNA 聚 合 酶 Phusion
High-Fidelity DNA Polymerase 购自 NEB 公司，限制
性内切酶、TaKaRa Ex Taq DNA 聚合酶、T4 DNA 连
接酶、DNA 分子量标准、蛋白质分子量标准购自大
连宝生物工程公司（TaKaRa）；pEASY-T1 克隆载体
购自北京全式金生物技术有限公司 ；DNA 回收试剂
盒、质粒提取试剂盒均购自天根生化科技（北京）
有限公司 ；PCR 引物由上海英骏生物技术有限公司
合成；其他试剂均为分析级产品，购自生工生物（上
海）股份有限公司。
1.2 方法
1.2.1 基因操作及蛋白质操作 LB 培养基、分子克
隆、表达产物 SDS-PAGE 分析参照文献［7，8］进行。
DNA 回收、质粒提取等根据试剂盒提供方法进行。
1.2.2 甲酸脱氢酶基因的合成
1.2.2.1 FDH 的基因设计 按照 Pseudomonas sp. 101
来源的甲酸脱氢酶氨基酸序列，选用大肠杆菌中高
表达基因常用密码子编码，利用 DNAWORKS 在线
软件设计，将全长 1 203 bp 的 fdh 基因分为 48 个片段，
每个片段长 46 个碱基，相邻片段重叠部分为 21 bp，
其中第一个和最后一个引物分别带酶切位点 BamH I
和 Hind III［9］。
1.2.2.2 fdh 基因的合成 将 1.2.2.1 设计各引物等比
例混和，引物之间互相搭桥、互为模板进行 PCR，
PCR 反 应 条 件 ：98℃ 预 变 性 30 s ；98℃ 变 性 10 s，
63℃退火 30 s，72℃延伸 23 s，循环 30 次 ；72℃延
伸 10 min。将上述 PCR 的弥散产物作为模板，由两
端引物再次进行 PCR。PCR 反应条件 ：98℃预变性
30 s ；98℃变性 10 s，60℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，
循环 30 次 ；72℃延伸 10 min。
1.2.2.3 fdh 基因的克隆 纯化第二次的 PCR 产物，
与 pEASY-T1 连接，构建 pEASY-fdh 质粒，转化 E.coli
DH5α 感受态细胞，涂布含 100 μg/mL 氨苄青霉素、
IPTG 和 X-Gal 的 LB 平板，37℃培养过夜。挑取白
色菌落，提质粒，用 BamH I 和 Hind III 双酶切验证，
阳性克隆进行 DNA 序列测定。
1.2.3 表达载体的构建及 fdh 基因的表达 将测序正
确的 pEASY-fdh 质粒和 pET-30a 质粒分别用 BamH I
和 Hind III 进行双酶切，片段与载体连接，构建表
达载体 pET30a-fdh，转化感受态 E.coli BL21（DE3），
涂布含 50 μg/mL 卡那霉素的 LB 平板，37℃培养 12 h，
得到含 fdh 基因的重组 E.coli。
把 重 组 E.coli 接 种 于 含 50 μg/mL 卡 那 霉 素 的
LB 培养基，37℃培养至 OD=0.6 左右，加入诱导剂
IPTG，使其终浓度为 1 mmol/L，16℃摇床培养。从
加诱导剂时开始计时，在 0、2、4 和 6 h 时分别取
样 1 mL，用于 SDS-PAGE 电泳检测［7］。
1.2.4 重组的甲酸脱氢酶分离纯化 将 1.5 mL 的菌
液离心后收集菌体，重悬于 20 mmol/L 磷酸钠缓冲
液（pH7.5）中，悬浮后的菌体用超声波破碎仪短时
多次超声破碎（工作功率为 200-300 W，工作 6 s，
间歇 6 s，破碎 20 次以上）。超声破碎后的溶液低温
高速离心机离心后，取上清粗提液经过用上述缓冲
液平衡的亲和层析微型镍离子螯合柱，上柱结合后，
用 100 mmol/L 咪唑充分洗脱，收集目的蛋白，测定
FDH 的蛋白浓度（Bradford 法）。
1.2.5 甲酸脱氢酶的酶活测定 测定 FDH 酶活可利
用产物 NADH 在 340 nm 有最大吸收峰，通过测定
不同浓度的 NADH 在 340 nm 处的 OD 值，绘制标准
曲线。反应体系如下 ：在 10 mmol/L pH7.5 的磷酸溶
2013年第5期 107李天明等 ：Pseudomonas sp. 101 甲酸脱氢酶基因的合成、表达及定点饱和突变
液（ 含 0.1 mol/L β-巯 基 乙 醇 ），1.67 mmol/L NAD+，
167 mmol/L 甲 酸 钠， 共 200 μL， 加 入 100 μL FDH
酶液，利用酶标仪检测，30℃反应，每隔 30 s 检测
NADH 在 340 nm 处的吸收光度，作图得出时间与吸
光度增加量的斜率。配置不同浓度的 NADH 标准溶
液（0-0.6 mmol/L）在 340 nm 处测定吸光值，绘制
标准曲线。拟合回归方程 y=4.2429x-0.0093，计算每
分钟 NADH 的增加量。
FDH 活力定义为在 pH7.5，30℃条件下，每分钟
生成 1 μmol NADH 所需的酶量为 1 个单位（U）［10］。
1.2.6 甲酸脱氢酶基因定点饱和突变 根据 fdh 基因
序列以及要突变的位点设计引物。第 146 氨基酸位
点突变引物，上游引物 FDH146F ：5-CGCTGAGG-
TTACTTACNNKAACTCCATAT-3 ；下游引物 FDH14-
6R：5-AACTGATATGGAGTTMNNGTAAGTAACCT-3；
PCR 扩增各段小片段基因 ：146-1、146-2，获得片段
后，用两端引物进行搭接。以搭接后的 PCR 产物为
模板，再进行第 354 氨基酸位点突变，引物分别为：
上游引物 FDH354F ：5-TCTTGGAGNNKTTCTTCGA-
GGGTC-3 ；下游引物 FDH354R ：5-GACCCTCGAA-
GAAMNNCTCCAAGATT-3，获得 354-1 以及 354-2 片
段，用两端引物进行搭接。两次搭接反应体系如下：
146-1 和 146-2 片段（或者 354-1 和 354-2 片段）各 0.5
μL，上下游引物（20 μmol/L）各 0.5 μL，10×Buffer 2.5
μL，dNTPs 4 μL，TaKaRa Ex Taq 1 μL。将 PCR 产物
纯化、连接 pET-30a，转化 E.coli BL21（DE3）［11］。
利用 LB 培养基，37℃培养转化子，诱导表达
FDH，菌液离心，溶菌酶磷酸缓冲液裂解细胞，获
得粗酶液［12］，30℃保温 10 h，用 96 微孔板分别测
定保温前后酶的酶活，酶活降低小的突变酶，为稳
定性高的突变酶。
2 结果
2.1 fdh基因合成和表达载体构建
FDH 基因合成、克隆及表达载体构建的技术路
线如图 1 所示。
图 1 fdh 基因合成、克隆及表达载体构建技术路线图
pET-30a
5 422 bp
Hind III
BamH I
Kanamycin
T7 promoter
pEASY-fdh
5128 bp
Hind III
BamH I
fdh
Kanamycin
Ampicillin
pEASY-T
3 928 bp
T cloning site
LacZ
Kanamycin
Ampicillin
R3R2
F3F2F1
R1
PCR
pET30a-fdh
6 622 bp
Hind III
BamH I
T7 promoter
Kanamycin
fdh
Hind IIIǃBamH I digestion
T4 DNA ligase
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第5期108
2.1.1 fdh 基因的合成和克隆 通过重叠 PCR 扩增
得到弥散条带，见图 2-A，以此产物为模板，加入
两端引物，通过 PCR 扩增得到 1 200 bp 的条带，与
预计 fdh 基因大小一致，见图 2-B。纯化 PCR 产物，
采用 TA 互补将回收的片段直接克隆法连接到 T 载
体 pEASY-T1 上。挑选阳性克隆，提质粒，用 BamH
I 和 Hind III 对构建的 pEASY-fdh 进行酶切验证，从
图 2-C 可以看出，fdh 与 T 载体连接成功。
2.2 FDH蛋白诱导表达
在 OD 达到 0.6 时，加入终浓度 1 mmol/L 的诱
导剂 IPTG，16℃培养，分别在 2、4 和 6 h 时取样，
收集菌体，破碎细胞后利用 12% 的 SDS-PAGE 对诱
导后的菌液进行分析，其蛋白电泳结果（图 4）显
示，在 45 kD 处发现目的条带，在诱导 2-6 h 后，
FDH 蛋白均有表达，并且蛋白的表达量随着诱导时
间的延长而有所增加。由此可分析到，pET30a-fdh
诱导后表达的蛋白约为 45 kD，此分子量与在线软
件 ExPASy-Compute pI-Mw tool 分析的分子量 44.5 kD
大小相符，说明该蛋白诱导表达成功。
M ：DNA Marker ；（A）1. 重 叠 PCR 扩 增 弥 散 条 带 ；（B）2，3 ：PCR 扩 增
fdh 基因 ；（C）：4 ：重组质粒 pEASY-fdh 双酶切验证
图 2 fdh 基因的合成和克隆
2000
bp
M 1 M 3 M 42
1000
750
500
250
100
A B C
15000
bp
M 1
7500
5000
2500
1000
M ：DNA Marker ；1 ：重组质粒 pET30a-fdh 双酶切鉴定
图 3 重组质粒 pET30a-fdh 酶切验证
100
kD
M 1 2 3 4
62
40
30
24
14
ⴞⲴӗ⢙
M：预染蛋白分子量标准；1：未经 IPTG 诱导的 FDH；2：FDH 经 IPTG 诱导 2 h；
3 ：FDH 经 IPTG 诱导 4 h ；4 ：FDH 经 IPTG 诱导 6 h
图 4 IPTG 诱导 fdh 基因表达
表 1 FDH 比活力的测定
每分钟 NADH 的
增加量（μmol）
酶液的蛋白浓度
（mgPro/mL）
比酶活
（U/mgPro）
10.28 1.17 8.7
2.1.2 序列测定和分析 重组阳性质粒 pEASY-fdh
经测序结果表明，甲酸脱氢酶 fdh 的基因长 1 203
bp，将基因序列用 DNAclub 软件翻译为氨基酸序列
后，与 DNAWORKS 在线软件设计的序列比对同源
性达 100%，说明 pEASY-fdh 构建成功。
2.1.3 表达载体 pET30a-fdh 的构建和验证 构建了
质粒 pET30a-fdh，用 BamH I 和 Hind III 酶切分析，
酶切结果如图 3 所示，质粒 pET30a-fdh 被切成两条
带，分别为 5 400 bp 的 pET-30a 质粒和 1 200 bp 的
fdh 基因条带，与预期结果相符。
2.3 FDH的比酶活
将诱导后的菌液经镍柱纯化后，测定纯化后的
酶液蛋白浓度，进行酶活检测，根据回归方程得出
每分钟 NADH 的增加量，其获得结果如表 1 所示，
计算得到重组酶 FDH 的比活力为 8.7 U/mg。
2.4 甲酸脱氢酶基因的饱和定点突变
2.4.1 甲酸脱氢酶基因 146、354 位点突变 表达
的 FDH 在使用中不稳定，极易失活，主要是因为由
于空气中氧或基质中其他化学物质的作用，半胱氨
酸的氧化使 FDH 失去活性。根据 α 螺旋疏水化处
理静电作用和多肽的优化可以提高蛋白稳定性的原
2013年第5期 109李天明等 ：Pseudomonas sp. 101 甲酸脱氢酶基因的合成、表达及定点饱和突变
理［13］，选择对 Cys146 和 Cys354 两个位点先后进行
饱和突变，以获得高稳定性的突变酶。通过重叠延
伸 PCR，在 1 200 bp 左右获得条带，位置与目的片
段位置一致，结果如图 5 所示，为获得有效的突变
体文库提供充足的基因片段。
变后 fdh 基因的热稳定性远高于野生型。
M M1 2 3 4
2000
bp
1000
750
500
250
100
A B
M ：DNA Marker ；1，2 ：Cys146 位 点 PCR 搭 接 结 果 ；3，4 ：Cys354
位点 PCR 搭接结果
图 5 重叠延伸 PCR 扩增电泳图
2.4.2 饱和突变体库筛选结果分析 构建了突变后
的质粒 pET30a-fdh，经诱导表达后，用 96 微孔板进
行突变体筛选。共筛选了 763 个转化子，转化子中
大部分的酶活保温前后变化较大，经过多轮复筛，
只筛选出一个突变子酶活变化较小的突变酶（数据
略），经测序是 Cys146Ala 和 Cys354Ala 双位点突变。
2.4.3 突 变 子 比 酶 活 的 研 究 野 生 型 菌 株 和
Cys146AlaCys354Ala 的突变型菌株，同时进行诱导
表达，将诱导后的菌液经镍柱纯化后，测定酶活，
经计算得出结果如表 2 所示，突变前后 FDH 的比活
力相差无几，没有明显变化。
表 2 突变前后 FDH 比活力的测定
每分钟 NADH 的
增加量（μmol）
酶液的蛋白浓度
（mgPro/mL）
比酶活
（U/mgPro）
野生型 10.32 1.22 8.5
突变型 10.24 1.19 8.6
2.4.4 突变子热稳定性的研究 将野生型菌株和
Cys146AlaCys354Ala 的突变型菌株，分别 16℃诱导
培养 24 h，制成粗酶，置于 30℃水浴中保温，分别
于 0、2、4、6、8 和 10 h 取样，测定其酶活力，以
保温前的酶活力为 100%，结果如图 6 所示，酶活呈
指数型下降，利用指数函数对其拟合，经推算野生
酶的半衰期为 5.4 h，突变酶的半衰期为 13.8 h，突
100
90
80
70
60
50
40
30
20
0 5 10
ᰦ䰤h
⴨ሩ
䞦⍫
%
䟾⭏රケਈර
图 6 稳定性变化曲线
3 讨论
甲酸脱氢酶在辅酶再生中的应用已成为辅酶法
再生领域的热点之一。甲酸 / 甲酸脱氢酶体系是最
成功的再生系统，并且已经应用于工业生产中。其
最大优势在于反应的不可逆性，原料甲酸价格低廉
以及唯一副产物 CO2 不会残留在体系中。人工合成
基因已经是分子生物学中的一种常规技术，并且成
为修改和克隆基因的强力工具。目前，虽然经过十
几年的不断实践和总结，重叠延伸 PCR 方法已日益
成熟，并在许多领域发挥重要作用，但是作为一种
尚未标准化反应条件的技术，重叠延伸 PCR 技术在
应用过程中还有许多问题急需解决，例如，最适合
的引物长度大小，最优连续延伸的循环数，还有对
合成进程中最佳分步控制等。这些问题还需进一步
系统研究，为该技术的应用提供更多理论支持［14］。
本研究按照 Pseudomonas sp. 101 来源的甲酸脱
氢酶氨基酸序列，采用重叠延伸 PCR 技术，设计引
物，并且通过不断调整退火温度及延伸循环数，合
成了具有大肠杆菌密码子偏好性的 fdh 基因，经测
序核酸序列与设计的同源性达到 100%，合成过程
中没有出现错配等现象。同时构建了原核表达载
体 pET30a-fdh，获得了基因工程菌 pET30a-fdh/BL21
（DE3）。通过 IPTG 诱导后，经 SDS-PAGE 电泳分析
可发现 FDH 蛋白得到表达，并且蛋白的表达量随着
诱导时间的延长而有所增加。由于重组的 FDH 在蛋
白质 C 端融合有 6×His 标签，并且它对 FDH 的酶
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第5期110
活性没有影响，从而将诱导后的菌液经镍柱纯化后，
测得 FDH 的酶比活力达到 8.7 U/mg，与 Tishkov［6］
报道的 FDH 的比活力 9.5 U/mg 相近。由于空气中氧
或基质中其他化学物质的作用，同时半胱氨酸的氧
化也会使 FDH 失去活性，因而表达的 FDH 在使用
中不稳定，极易失活。根据 α 螺旋疏水化处理静电
作用和多肽的优化可以提高蛋白稳定性的原理，选
择对 Cys146 和 Cys354 两个位点进行饱和突变，筛
选出突变体后诱导表达，测定发现突变前后酶活变
化不明显，但突变后酶的热稳定性得到提高。
随着氧化还原酶在催化制备有机化学品等方面
优势的凸显，FDH 的改造及在辅酶再生方面的应用
越来越受到研究者的关注。但是，目前 FDH 的稳定
性、催化效率还有待进一步提高 ；还需建立高效的
表达体系和优化催化反应体系，降低生产成本，拓
展 FDH 的更广泛的应用［15］。
4 结论
利用重叠延伸 PCR 技术，按照 Pseudomonas sp.
101 来源的甲酸脱氢酶氨基酸序列设计重叠引物，
合成了具有大肠杆菌密码子偏好性的 fdh 基因，与
DNAWORKS 在线软件设计的基因序列 100% 同源。
构建了原核表达载体 pET30a-fdh，获得了基因工程
菌 pET30a-fdh/BL21（DE3）， 在 595 nm 下 OD 达 到
0.6 时，加入终浓度 1 mmol/L 的 IPTG 诱导，实现了
FDH 的可溶性活性表达，酶的比活力达到 8.7 U/mg。
由于 FDH 不稳定，极易失活，根据 α 螺旋疏水化处
理静电作用和多肽的优化可以提高蛋白稳定性的原
理，选择对 Cys146 和 Cys354 两个位点进行饱和突变；
经筛选，获得的 Cys146AlaCys354Ala 突变酶与野生
酶相比，比酶活没有变化，但突变酶的热稳定性提
高了 2.5 倍。
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（责任编辑 马鑫）