全 文 ：第 １３卷第 ４期
２０１５年 ７月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １３ Ｎｏ􀆰 ４
Ｊｕｌ􀆰 ２０１５
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１５􀆰 ０４􀆰 ００５
收稿日期：２０１４－０６－１６
基金项目：国家自然科学基金杰出青年基金（２１２２５６２６）；国家高技术研究发展计划（８６３计划）（２０１１ＡＡ０２Ａ２０９）；江苏高校优势学科建设工程
作者简介：刘维明（１９８７—），山东郯城人，博士研究生，研究方向：生物催化；黄　 和（联系人），教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｂｉｏｔｅｃｈ＠ ｎｊｔｅｃｈ􀆰 ｅｄｕ􀆰 ｃｎ
重组大肠杆菌共表达亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶
发酵条件优化
刘维明１，杨震炯２，罗积杏３，壮晓健３，沈文和３，胡　 燚１，黄　 和１
（１􀆰 南京工业大学 生物与制药工程学院，江苏 南京 ２１１８００；２􀆰 浙江省永康市质量监督检测中心，
浙江 永康 ３２１３００；３􀆰 浙江九洲药业股份有限公司，浙江 台州 ３１８０００）
摘　 要：在摇瓶中对共表达亮氨酸脱氢酶（ＬｅｕＤＨ）和甲酸脱氢酶（ＦＤＨ）的重组大肠杆菌（Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ）的发酵条件进行
优化。 首先考察基础培养基中碳、氮源种类和浓度及初始 ｐＨ等因素对重组大肠杆菌生长和产酶的影响，实验结果
表明甘油和酵母膏为最佳碳源和氮源，最适质量浓度均为 １０ ｇ ／ Ｌ，培养基最适初始 ｐＨ为 ８􀆰 ０。 然后对诱导条件进
行优化，确定最适的诱导时机为菌体密度（ＯＤ６００）达到 ０􀆰 ６时，最适的诱导温度、诱导剂 ＩＰＴＧ浓度和诱导时间分别
为 ２５ ℃、０􀆰 ２ ｍｍｏｌ ／ Ｌ和 ２０ ｈ。 在优化后的培养条件下，菌体密度（ＯＤ６００）可达 ８􀆰 ６，ＬｅｕＤＨ和 ＦＤＨ酶比酶活分别达
１ ５４３􀆰 ３和 ２ ５７２􀆰 ４ Ｕ ／ Ｌ，是优化前的 ２􀆰 ０和 ３􀆰 １倍。
关键词：重组大肠杆菌；亮氨酸脱氢酶；甲酸脱氢酶；诱导
中图分类号：Ｑ５５４　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１５）０４－００２３－０６
Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ｆｏｒ
ｃｏｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｌｅｕｃｉｎｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ａｎｄ ｆｏｒｍａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ
ＬＩＵ Ｗｅｉｍｉｎｇ１，ＹＡＮＧ Ｚｈｅｎｊｉｏｎｇ２，ＬＵＯ Ｊｉｘｉｎｇ３，ＺＨＵＡＮＧ Ｘｉａｏｊｉａｎ３，ＳＨＥＮ Ｗｅｎｈｅ３，
ＨＵ Ｙｉ１，ＨＵＡＮＧ Ｈｅ１
（１􀆰 Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｔｅｃｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１１８００，Ｃｈｉｎａ；
２􀆰 Ｑｕａｌｉｔｙ Ｓｕｐｅｒｖｉｓｉｏｎ ａｎｄ Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｙｏｎｇｋａｎｇ，Ｙｏｎｇｋａｎｇ ３２１３００，Ｃｈｉｎａ；
３􀆰 Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｊｉｕｚｈｏｕ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ􀆰 ，Ｌｔｄ􀆰 ，Ｔａｉｚｈｏｕ ３１８０００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ｆｏｒ ｃｏｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｌｅｕｃｉｎｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ
ａｎｄ ｏｒｍａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｗｅｒｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｉｎ ｓｈａｋｅ ｆｌａｓｋｓ． Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃａｒｂｏｎ ａｎｄ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｓｏｕｒｃｅ ａｎｄ
ｔｈｅｉｒ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ， ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ ｉｎｉｔｉａｌ ｐＨ ｏｆ ｍｅｄｉｕｍ ｏｎ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｅｎｚｙｍｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｗｅｒｅ
ｓｔｕｄｉｅｄ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｃａｒｂｏｎ ｓｏｕｒｃｅ ｗａｓ ｇｌｙｃｅｒｏｌ （１０ ｇ ／ Ｌ） ａｎｄ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｓｏｕｒｃｅ ｗａｓ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ （ １０
ｇ ／ Ｌ）． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｉｎｉｔｉａｌ ｐＨ ｏｆ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ ｗａｓ ８􀆰 ０． Ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｆｕｒｔｈｅｒ
ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ：ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｃｃａｓｉｏｎ ＯＤ６００ ０􀆰 ６，ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ２５ ℃，ＩＰＴＧ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ０􀆰 ２
ｍｍｏｌ ／ Ｌ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ２０ ｈ． Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ａ ｈｉｇｈ ｃｅｌｌ ｄｅｎｓｉｔｙ（ＯＤ６００）ｏｆ ８􀆰 ６ ｗａｓ
ｏｂｔａｉｎｅｄ． Ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＬｅｕＤＨ ｒｅａｃｈｅｄ １ ５４３􀆰 ３ Ｕ ／ Ｌ ａｎｄ ｔｈａｔ ｏｆ ＦＤＨ ｒｅａｃｈｅｄ ２ ５７２􀆰 ４ Ｕ ／ Ｌ，
ｗｈｉｃｈ ｗｅｒｅ ２􀆰 ０⁃ｆｏｌｄ ａｎｄ ３􀆰 １⁃ｆｏｌｄ ａｓ ｔｈａｔ ｂｅｆｏｒｅ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ； ｌｅｕｃｉｎｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ； ｆｏｒｍａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ； ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ
＼ ＼ＤＺ１９ ＼Ｄ ＼孙桂云 ＼生物加工 ２０１５ ＼第 ４期 ＼第 ４期．ＰＳ　 ４校样　 排版：孙桂云　 修改日期：２０１５ ／ ０７ ／ ０８
　 　 亮氨酸脱氢酶（ ｌｅｕｃｉｎｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，ＬｅｕＤＨ，
ＥＣ １􀆰 ４􀆰 １􀆰 ９）是一种 ＮＡＤ＋依赖型的氧化还原酶，在
芽胞杆菌属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）中具有较高的表达水平，首先
于 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ 中被发现并纯化［１］，此后 Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｐｅｃ􀆰 、 Ｂ􀆰 ｓｐｈａｅｒｉｕｓ、 Ｂ􀆰 ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｌｉｕｓ、 Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ
ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃｕｍ 等产 ＬｅｕＤＨ 菌株相继被筛选出
来［２－５］。 ＬｅｕＤＨ能够可逆地催化 Ｌ 亮氨酸和支链
Ｌ 氨基酸反应生成相应的 α 酮酸及其类似物，可
用于测定支链脂肪酸及其酮酸类似物［６］，同时可以
催化 α 酮酸还原制备 Ｌ 亮氨酸及 Ｌ 叔亮氨酸等
氨基酸［７－１０］。
近年来，不同来源的 ＬｅｕＤＨ基因工程菌已成功
构建［１１－１３］，实现了 ＬｅｕＤＨ 的高密度表达和规模化
制备，并对其结构和功能进行了相关研究，为
ＬｅｕＤＨ的工业化应用奠定了基础。 ＬｅｕＤＨ 的大规
模应用需要添加 ＮＡＤＨ作为辅酶，而 ＮＡＤＨ 价格昂
贵，不适合工业上大量使用。 因此，构建高效的辅
酶再生系统是解决 ＬｅｕＤＨ规模化应用难题的关键。
ＮＡＤ＋依赖型的甲酸脱氢酶（ ｆｏｒｍａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，
ＦＤＨ，ＥＣ １􀆰 ２􀆰 １􀆰 ２）属于 Ｄ ２ 羟基酸脱氢酶类，可
以在将甲酸氧化为 ＣＯ２的同时将 ＮＡＤ
＋ 还原为
ＮＡＤＨ，因此广泛应用于辅酶 ＮＡＤＨ的再生中［１４ １５］。
ＦＤＨ耦联的辅酶再生体系具有诸多优势，如反应不
可逆且生成的副产物 ＣＯ２易从反应体系中逃逸，甲
酸或甲酸盐价格低廉且对酶无抑制作用，因此甲
酸 ／ ＦＤＨ辅酶再生体系是目前最成功的辅酶再生系
统［１６］，且已应用到手性化合物的工业化生产，如
Ｄｅｇｕｓｓａ公司采用 ＬｅｕＤＨ催化三甲基丙酮酸不对称
还原并与 ＦＤＨ 催化的 ＮＡＤ＋ ＮＡＤＨ 再生体系耦
联，实现了 Ｌ 叔亮氨酸的工业生产［８］。
对于双酶耦联的生物催化反应体系，构建双酶
共表达的基因工程菌不仅可以降低酶制备的成本，
还可以提高生产效率，因此近年来相关研究报道也
越 来 越 多［９，１７－１９］。 本 实 验 室 成 员 前 期 从
Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ 基因组中扩增获得了编码
ＬｅｕＤＨ的基因 ｌｅｕｄｈ，并将其与来自 Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ
的编码 ＦＤＨ的基因 ｆｄｈ共表达，构建了基因工程菌
Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＢＬ２１ （ＬｅｕＤＨ ＦＤＨ）。 本文中，笔者在摇
瓶中考察影响该重组菌生长和酶蛋白表达的因素，
主要研究碳、氮源种类及其浓度、初始 ｐＨ、诱导时
机、诱导剂浓度、诱导温度和诱导时间等因素对重
组 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ 菌体生长和产酶的影响，优化发酵诱导条
件，以期为进一步发酵放大提供理论依据。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 菌种
共表达 ＬｅｕＤＨ 和 ＦＤＨ 的基因工程菌 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ
ＢＬ２１ （ＬｅｕＤＨ ＦＤＨ）由笔者所在实验室构建并
保藏。
１􀆰 ２　 培养基
ＬＢ培养基（ ｇ ／ Ｌ）：蛋白胨 １０、酵母提取物 ５，
ＮａＣｌ １０；ｐＨ ７􀆰 ０。
发酵培养基（ｇ ／ Ｌ）：甘油 １０、酵母膏 １０、Ｎａ２ＨＰＯ４
５􀆰 ０８、ＫＨ２ＰＯ４ ３、Ｋ２ＳＯ４ ２、柠檬酸三钠 ０􀆰 ５、ＭｇＣｌ２·
６Ｈ２Ｏ ０􀆰 ４、ＣａＣｌ２ ０􀆰 ０１１；ｐＨ ７􀆰 ０。 其中ＭｇＣｌ２·６Ｈ２Ｏ 和
ＣａＣｌ２单独灭菌，接种时加入至所需浓度。
当考察碳、氮源种类对发酵的影响时，将甘油
和酵母膏替换为相应的营养组分即可。 以上培养
基灭菌均在 １２１ ℃灭菌 ２０ ｍｉｎ，接种时添加过滤除
菌的氨苄青霉素（Ａｍｐ）和卡那霉素（Ｋａｎａ）至终质
量浓度 ５０ ｍｇ ／ Ｌ。
１􀆰 ３　 培养方法
种子培养：将甘油管保存的菌种按 ０􀆰 １％接种
量接种至含 Ｋａｎａ 和 Ａｍｐ 的 ＬＢ 培养基中，３７ ℃、
２００ ｒ ／ ｍｉｎ摇床培养 ２０ ｈ。
发酵培养及诱导：将种子液按 １％接种量接种
至含 Ｋａｎａ和 Ａｍｐ 的发酵培养基，３７ ℃、２００ ｒ ／ ｍｉｎ
培养至 ＯＤ６００达到 ０􀆰 ６，加入诱导剂 ＩＰＴＧ 至终浓度
０􀆰 ２ ｍｍｏｌ ／ Ｌ，降低培养温度至 ２５ ℃，２００ ｒ ／ ｍｉｎ继续
培养 １６ ｈ。 发酵结束后，发酵液于 ４ ℃、１２ ０００
ｒ ／ ｍｉｎ离心 ５ ｍｉｎ，收集菌体，生理盐水（８􀆰 ５％）洗涤
２次，－２０ ℃保存，备用。
种子培养和发酵培养在 ２５０ ｍＬ摇瓶中进行，装
液量为 ５０ ｍＬ。 ＨＹＬ Ａ 型全温摇瓶柜（太仓市强
乐实验设备有限公司），偏心距 ３０ ｍｍ。
１􀆰 ４　 分析方法
菌体密度测定：菌体密度以 ＯＤ６００表示，将发酵
液稀释一定倍数后用紫外分光光度计于 ６００ ｎｍ 处
测定吸光值。
菌体破碎液的制备：发酵所得菌体用 ０􀆰 １
ｍｏｌ ／ Ｌ、ｐＨ ８􀆰 ５磷酸盐缓冲液悬浮，置于超声破碎仪
中破碎。 超声工作条件：２００ Ｗ，工作 ５ ｓ，间歇 ５ ｓ，
９９个循环。 破碎液于 ４ ℃、１２ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ 离心 １０
ｍｉｎ，取上清液用于酶活测定。
ＬｅｕＤＨ酶活测定：ＮＡＤＨ在 ３４０ ｎｍ处有最大吸
光值，ＬｅｕＤＨ 活力通过检测反应过程中 ＮＡＤＨ 在
４２ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
＼ ＼ＤＺ１９ ＼Ｄ ＼孙桂云 ＼生物加工 ２０１５ ＼第 ４期 ＼第 ４期．ＰＳ　 ４校样　 排版：孙桂云　 修改日期：２０１５ ／ ０７ ／ ０８
３４０ ｎｍ处吸光值的变化计算。 于 １􀆰 ０ ｍＬ 磷酸盐缓
冲液（１００ ｍｍｏｌ ／ Ｌ，ｐＨ ８􀆰 ５）中加入 ２ ｍｍｏｌ ／ Ｌ 三甲
基丙 酮 酸、 ０􀆰 １ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ＮＡＤＨ 和 １００ ｍｍｏｌ ／ Ｌ
ＮＨ４Ｃｌ，３０ ℃保温 ３ ｍｉｎ 后加入 １０ μＬ酶液，迅速摇
匀后记录 ２ ｍｉｎ内吸光值的变化。 酶活单位（Ｕ）的
定义为在上述反应条件下每分钟催化 １ μｍｏｌ
ＮＡＤＨ氧化所需的酶量，其计算见式（１）：
酶活（Ｕ） ＝ ΔＯＤ
× Ｖ × １０６
６ ２２０ × ｌ
（１）
式中：ΔＯＤ为每分钟吸光值的变化，Ｖ为反应体积（Ｌ），
６ ２２０为 ＮＡＤＨ的摩尔消光系数（Ｌ ／ （ｍｏｌ·ｃｍ）），ｌ为光
程距离（ｃｍ）。
ＦＤＨ酶活测定：测定原理同 ＬｅｕＤＨ 酶活测定。
于 １􀆰 ０ ｍＬ 磷酸盐缓冲液（１００ ｍｍｏｌ ／ Ｌ，ｐＨ ８􀆰 ５）中
加入 １􀆰 ６７ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ＮＡＤ＋和 １６７ ｍｍｏｌ ／ Ｌ 甲酸铵，
３０ ℃保温 ３ ｍｉｎ后加入 １０ μＬ 酶液，迅速摇匀后记
录 ２ ｍｉｎ内吸光值的变化。 酶活单位（Ｕ）的定义为
在上述反应条件下每分钟催化 １ μｍｏｌ ＮＡＤ＋还原所
需的酶量，计算公式同上。
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 碳源对重组 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ生长和产酶的影响
２􀆰 １􀆰 １　 碳源种类对重组 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ生长和产酶的影响
当采用野生菌发酵产 ＬｅｕＤＨ 时，葡萄糖为最常
用的碳源，如 Ｓｃｈüｔｔｅ 等［２０］研究了在 １０ Ｌ 发酵罐中
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ产 ＬｅｕＤＨ的发酵工艺，当添加 ２％葡萄
糖为碳源时， ＬｅｕＤＨ 比酶活可达 １ ４００ Ｕ ／ Ｌ。 但
Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ对不同碳源的利用能力不同，进而会影响重组
菌的生长和产酶能力。 Ｚｈａｎｇ 等［２１］研究了碳源种类
对重组 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ表达葡聚糖蔗糖酶的影响，结果发现当
采用甘油为碳源时，葡聚糖蔗糖酶酶活力最高。 笔者
通过改变发酵培养基中碳源的种类（均为 ５ ｇ ／ Ｌ），研
究不同碳源对重组 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ生长及表达 ＬｅｕＤＨ和 ＦＤＨ
的影响，结果见表 １。 由表 １可知：蔗糖作为碳源时不
利于 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ的生长和酶蛋白的表达；采用葡萄糖、甘
露糖和甘油为碳源时可以促进菌体生长，其中以甘油
为碳源时生长状况最好，ＬｅｕＤＨ 和 ＦＤＨ 活力最高。
因此，确定甘油为最适碳源。
２􀆰 １􀆰 ２　 甘油质量浓度对重组 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ生长和产酶的影响
确定甘油为最适碳源后，进一步考察甘油浓度
对菌体生长和产酶的影响，结果如图 １ 所示。 由图
１ 可知随着甘油浓度的升高，菌体密度先升高再降
低。 甘油质量浓度为 １０ ｇ ／ Ｌ时菌体生长量最高；酶
活力随甘油浓度的变化趋势与菌体密度相似。 因
此确定 １０ ｇ ／ Ｌ的甘油为最适的碳源添加量。
表 １　 碳源种类对菌体生长和产酶的影响
Ｔａｂｌｅ １　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃａｒｂｏｎ ｓｏｕｒｃｅ ｏｎ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ
ｅｎｚｙｍｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
碳源 ＯＤ６００
比酶活 ／ （Ｕ·Ｌ－１）
ＬｅｕＤＨ ＦＤＨ
葡萄糖 ５􀆰 ７ ４５０􀆰 ２ ８３６􀆰 １
麦芽糖 ５􀆰 ０ ２５７􀆰 ２ ７７１􀆰 １
甘露糖 ５􀆰 ５ ５７８􀆰 ８ ６４３􀆰 １
甘油 ６􀆰 ２ ７７１􀆰 ７ ８３６􀆰 １
果糖 ４􀆰 ８ ５７８􀆰 ８ ５１４􀆰 ５
蔗糖 ２􀆰 ８ １９２􀆰 ９ ４５０􀆰 ２
图 １　 甘油质量浓度对菌体生长和产酶的影响
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ ｃｅｌｌ
ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｅｎｚｙｍｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
２􀆰 ２　 氮源对重组 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ生长和产酶的影响
２􀆰 ２􀆰 １　 氮源种类对重组 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ生长和产酶的影响
氮源是微生物合成细胞结构和含氮代谢产物的
原料，因此对菌体生长和酶蛋白的合成具有明显的影
响。 Ｈｕｍｍｅｌ等［２２］考察不同氮源对 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ
生长及产 ＬｅｕＤＨ 的影响，结果发现有机氮源效果明
显好于无机氮源，如采用酵母膏为氮源时，菌体 ＯＤ６００
可达 ５１，ＬｅｕＤＨ比酶活达 ４１０ Ｕ ／ ｇ。 笔者考察不同氮
源（均为 １０ ｇ ／ Ｌ）对重组 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ生长和产酶的影响，结
果如表 ２ 所示。 由表 ２ 可知：无机氮源不利于重组
Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ生长，而有机氮源可明显促进菌体生长和蛋白
表达，这一结果与 Ｈｕｍｍｅｌ 等［２２］的研究结果一致，这
可能是因为有机氮源中含有其他营养组分和生长促
进剂［２１］。 由表 ２ 中数据可知，当采用酵母膏为氮源
时，菌体密度和酶活力均明显高于采用其他氮源时，
因此确定酵母膏为最适氮源。
５２　 第 ４期 刘维明等：重组大肠杆菌共表达亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶发酵条件优化
＼ ＼ＤＺ１９ ＼Ｄ ＼孙桂云 ＼生物加工 ２０１５ ＼第 ４期 ＼第 ４期．ＰＳ　 ４校样　 排版：孙桂云　 修改日期：２０１５ ／ ０７ ／ ０８
表 ２　 氮源种类对菌体生长和产酶的影响
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｓｏｕｒｃｅ ｏｎ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ
ａｎｄ ｅｎｚｙｍｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
氮源 ＯＤ６００
比酶活 ／ （Ｕ·Ｌ－１）
ＬｅｕＤＨ ＦＤＨ
（ＮＨ４） ２ＳＯ４ ２􀆰 ８ ６４３􀆰 １ ５７８􀆰 ８
ＮＨ４Ｃｌ ２􀆰 ２ １９２􀆰 ９ ４５０􀆰 ２
尿素 ０􀆰 ７ ３２􀆰 ２ ５１４􀆰 ５
蛋白胨 ５􀆰 ３ ７７１􀆰 ７ ８３６􀆰 １
酵母膏 ６􀆰 ４ １ ０２８􀆰 ９ ９６４􀆰 ７
玉米浆 ３􀆰 ８ ４５０􀆰 ３ ７７１􀆰 ７
２􀆰 ２􀆰 ２　 酵母膏质量浓度对重组 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ 生长和产酶
的影响
进一步考察酵母膏用量对重组 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ生长和产
酶的影响，结果见图 ２。 由图 ２ 可知：随着酵母膏浓
度的提高，菌体密度逐渐升高，当酵母膏质量浓度
达到 １０ ｇ ／ Ｌ 后，菌体生长量基本稳定。 酶活方面，
酵母膏质量浓度为 １０ ｇ ／ Ｌ 时，ＦＤＨ 酶活力最高，而
ＬｅｕＤＨ酶活在酵母膏浓度为 １５ ｇ ／ Ｌ 时达到最高。
综合考虑菌体生长和产酶以及成本等因素，确定最
佳的酵母膏质量浓度为 １０ ｇ ／ Ｌ。
图 ２　 酵母膏质量浓度对菌体生长和产酶的影响
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ
ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｅｎｚｙｍｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
２􀆰 ３　 初始 ｐＨ对重组 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ生长和产酶的影响
培养基的 ｐＨ对微生物的生长代谢和酶蛋白的
表达都有很大的影响，因此考察不同培养基初始
ｐＨ，对测定发酵后重组菌的菌体密度和酶活力的影
响，结果见图 ３。 由图 ３可知：随着 ｐＨ的上升，生物
量和酶活力均呈上升趋势，当 ｐＨ达到 ８􀆰 ０ 时，生物
量和酶活力均最高，说明培养基初始 ｐＨ 为 ８􀆰 ０ 时
最适合于重组菌的生长和酶表达。 一般大肠杆菌
在中性条件下生长情况最好，但因摇瓶发酵不能自
动控制发酵液 ｐＨ，随着发酵的进行，酸性代谢产物
的积累会导致发酵液 ｐＨ逐渐下降，因此初始 ｐＨ略
呈碱性时有利于重组菌的生长和产酶。
图 ３　 培养基初始 ｐＨ对菌体生长和产酶的影响
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｍｅｄｉｕｍ ｉｎｉｔｉａｌ ｐＨ ｏｎ ｃｅｌｌ
ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｅｎｚｙｍｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
２􀆰 ４　 最佳诱导时机的确定
２􀆰 ４􀆰 １　 菌株生长曲线的测定
为确定诱导剂加入的最佳时机，首先测定不同
时间下的菌液 ＯＤ６００，并绘制菌株生长曲线，结果见
图 ４。 由图 ４可知：在 １％接种量下，重组菌在经过 ２
ｈ的延滞期后即进入对数生长期，８ ｈ 后生长速率开
始下降，１０ ｈ后进入稳定期。
图 ４　 重组大肠杆菌的生长曲线
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ｃｕｒｖｅ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ
ｃｏｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ＬｅｕＤＨ ａｎｄ ＦＤＨ
２􀆰 ４􀆰 ２　 诱导时机对重组 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ生长和产酶的影响
考察诱导时机对菌体生长和产酶的影响，分别
在接种后不同时间取菌液测定 ＯＤ６００，并加入 ＩＰＴＧ
开始诱导，诱导时间均为 １６ ｈ，结果见图 ５。 由图 ５
可知：延迟期（ＯＤ６００，０～０􀆰 ２５）加入诱导剂不利于菌
体生长，发酵结束后菌体密度较低。 这主要是因为
ＩＰＴＧ对菌体生长有抑制作用，过早诱导不利于菌体
的生长［２３］，虽然此时 ＬｅｕＤＨ酶活较高，但 ＦＤＨ酶活
很低；在对数前期（ＯＤ６００，０􀆰 ４ ～ ０􀆰 ８）进行诱导则有
利于菌体的生长，其中当 ＯＤ６００达到 ０􀆰 ６时加入诱导
剂最利于菌体生长，发酵结束后菌体密度最高，且
此时 ＬｅｕＤＨ 和 ＦＤＨ 酶活相当；而在对数中期
６２ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
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（ＯＤ６００，１􀆰 ０～ １􀆰 ５）进行诱导虽有利于 ＦＤＨ 酶活提
高，但菌体密度和 ＬｅｕＤＨ 酶活则有一定程度地下
降。 因此确定 ＯＤ６００达到 ０􀆰 ６时为最佳的诱导时期，
此时诱导最有利于菌体生长，同时 ＬｅｕＤＨ 和 ＦＤＨ
酶活相当。
图 ５　 诱导时机对菌体生长和产酶的影响
Ｆｉｇ􀆰 ５　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｄｄｉｎｇ ｔｉｍｅ ｏｆ ＩＰＴＧ ｏｎ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ
ａｎｄ ｅｎｚｙｍｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
图 ６　 诱导温度对菌体生长和产酶的影响
Ｆｉｇ􀆰 ６　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ ｃｅｌｌ
ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｅｎｚｙｍｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
２􀆰 ５　 诱导温度对重组 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ生长和产酶的影响
温度对菌体生长、质粒稳定性和产物蛋白合成
等都有重要影响。 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ最适生长温度为 ３７ ℃，但
过高的诱导温度可能会导致蛋白质合成速率过快，
进一步导致蛋白因无法正确折叠而形成无活性的
包涵体［２４］，因此在进行重组菌诱导表达时常常控制
诱导温度在 ３５ ℃以下，以提高可溶性蛋白的表达。
林日辉等［２５］考察了诱导温度对重组菌表达 ＦＤＨ 的
影响，结果发现 ３０ ℃ 时， ＦＤＨ 比酶活最高 （ １７０
Ｕ ／ Ｌ），酶活随温度升高呈下降趋势。 接种后将重组
Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ在 ３７ ℃培养至 ＯＤ６００为 ０􀆰 ６，加入 ＩＰＴＧ 并控
制至特定温度开始诱导，考察诱导温度对重组
Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ生长和产酶的影响，结果见图 ６。 由图 ６ 可
知：ＦＤＨ 酶活对高温敏感，当诱导温度高于 ３０ ℃
时，ＦＤＨ酶活急剧下降。 虽然 ３５ ℃诱导有利于菌
体生长，但此时 ＬｅｕＤＨ 和 ＦＤＨ 酶活均较低。 综合
实验结果，确定 ２５ ℃为最佳的诱导温度。
２􀆰 ６　 ＩＰＴＧ浓度对重组 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ生长和产酶的影响
考察了 ＩＰＴＧ浓度对重组 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ生长和产酶的影
响，结果见图 ７。 由图 ７可知：对照组实验表明，不加
ＩＰＴＧ进行诱导时，ＬｅｕＤＨ 和 ＦＤＨ 基本不表达（数据
未列出）。 由图 ７可知，当加入 ０􀆰 ０５ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ＩＰＴＧ进
行诱导时，ＦＤＨ酶活最高，此后 ＦＤＨ酶活随 ＩＰＴＧ浓
度的升高而持续下降，说明高浓度 ＩＰＴＧ不利于 ＦＤＨ
的表达。 菌体密度和 ＬｅｕＤＨ 酶活则随 ＩＰＴＧ 浓度升
高呈现先升高再下降的趋势，这是因为高密度的
ＩＰＴＧ对重组菌的生长具有抑制作用，同时也抑制了
目的蛋白的诱导合成。 综合菌体生长和酶活力情况，
确定最适的 ＩＰＴＧ浓度为 ０􀆰 ２ ｍｍｏｌ ／ Ｌ。
图 ７　 ＩＰＴＧ浓度对菌体生长和产酶的影响
Ｆｉｇ􀆰 ７　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＩＰＴＧ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ
ａｎｄ ｅｎｚｙｍｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
图 ８　 诱导时间对菌体生长和产酶的影响
Ｆｉｇ􀆰 ８　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｏｎ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ
ａｎｄ ｅｎｚｙｍｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
２􀆰 ７　 诱导时间对重组 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ生长和产酶的影响
加入 ＩＰＴＧ继续诱导，考察诱导时间对菌体密
度和 ＬｅｕＤＨ 及 ＦＤＨ 酶活的影响。 由图 ８ 可知，随
着诱导时间的延长，菌体密度和酶活均逐渐升高，
诱导 １４ ｈ后，ＬｅｕＤＨ酶活基本达到稳定。 诱导２０ ｈ
时，菌体密度和 ＦＤＨ 酶活力达到最高，其后增长不
７２　 第 ４期 刘维明等：重组大肠杆菌共表达亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶发酵条件优化
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明显。 最终确定诱导时间为 ２０ ｈ，此时菌体密度
（ＯＤ６００ ） 可达 ８􀆰 ６， ＬｅｕＤＨ 和 ＦＤＨ 比酶活可达
１ ５４３􀆰 ３ Ｕ ／ Ｌ和２ ５７２􀆰 ４ Ｕ ／ Ｌ。
３　 结论
以共表达 ＬｅｕＤＨ 和 ＦＤＨ 的基因工程菌 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ
ＢＬ２１ （ＬｅｕＤＨ ＦＤＨ）为研究对象，研究了摇瓶中
影响菌体生长和酶蛋白表达的因素，优化了发酵条
件。 实验结果表明，较佳的碳氮源及其质量浓度分
别为甘油（１０ ｇ ／ Ｌ）和酵母膏（１０ ｇ ／ Ｌ），最适的培养
基初始 ｐＨ 为 ８􀆰 ０。 在此条件下培养至菌体密度
（ＯＤ６００）为 ０􀆰 ６ 时，加入终浓度为 ０􀆰 ２ ｍｍｏｌ ／ Ｌ 的
ＩＰＴＧ，２５ ℃继续诱导 ２０ ｈ，菌体密度（ＯＤ６００）可达
８􀆰 ６， ＬｅｕＤＨ 和 ＦＤＨ 比酶活可达 １ ５４３􀆰 ３ Ｕ ／ Ｌ 和
２ ５７２􀆰 ４ Ｕ ／ Ｌ，是优化前的 ２􀆰 ０和 ３􀆰 １倍。
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ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ： ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｗ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｉｏｎｉｃ ｌｉｑｕｉｄｓ ｆｏｒ
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（责任编辑　 管　 珺）
８２ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
＼ ＼ＤＺ１９ ＼Ｄ ＼孙桂云 ＼生物加工 ２０１５ ＼第 ４期 ＼第 ４期．ＰＳ　 ４校样　 排版：孙桂云　 修改日期：２０１５ ／ ０７ ／ ０８