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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 7 期
寄生曲霉脂肪酶的全基因合成、
原核表达及其结构分析
连英丽1 蓝东明1 杨博1 王永华2
(1华南理工大学生物科学与工程学院，广州 510006;2华南理工大学轻工与食品学院，广州 510641)
摘 要: 根据寄生曲霉脂肪酶基因序列(GenBank 登录号:AF404488)及大肠杆菌密码子的偏爱性，应用重叠延伸 PCR
技术，人工合成了寄生曲霉脂肪酶基因 lip AP。将基因克隆到 pFL-B13cl载体上获得重组质粒 pFL-B13cl /Lip AP，并在大肠杆
菌 BL21(DE3)中进行优化表达。融合蛋白 Sumo-LipAP在 0． 1 mmol /L IPTG、37℃条件下诱导 6 h表达量最高。SDS-PAGE分
析显示融合蛋白 His-Sumo-LipAP以包涵体形式表达，大小约为 53 kD。复性后透析处理，大部分融合蛋白转化为正确构象且
具有催化活性，经一步疏水层析其纯度可达 98%。生物信息学工具预测和分析发现，LipAP 空间结构保守，具有催化三联体
(Ser173-Asp226-His288)、活性部位盖子(S111YSIRNWVTDAT122)及保守五肽(GHSLG)3 个功能域。
关键词: 寄生曲霉脂肪酶基因 密码子优化 全基因合成 原核表达 生物信息学
Total Gene Synthesis，Prokaryotic Expression and Structure
Analysis of Lipase from Aspergillus parasiticus
Lian Yingli1 Lan Dongming1 Yang Bo1 Wang Yonghua2
(1School of Bioscience ＆ Bioengineering，South China University of Technology，Guangzhou 510006;
2College of Light Industry and Food Science，Guangzhou 510641)
Abstract: We have synthesized the lipase gene from Aspergillus parasiticus (GenBank:AF404488)by overlap extension PCR
based on the codon preference of Escherichia coli． The gene was cloned into the expression vector pFL-B13cl plasmid to generate vector
pFL-B13cl /Lip AP． The fusion protein Sumo-LipAP was expressed in the BL21 (DE3)and the induced conditions for expression of Su-
mo-LipAP were optimized． The high yield of SUMO-LipAP was achieved when the BL21(DE3)containing the vector pFL-B13cl /Lip
AP was induced with 0. 1 mmol /L IPTG at 37℃ for 6 hours． SDS-PAGE analysis results showed that the fusion protein His-sumo-Lip
AP was overexpressed as inclusion body with MW of about 53 kD． Most fusion proteins were transformed into correct conformation after
dialysis treatment followed by renaturation with resulting catalytic activity． The purity of His-Sumo LipAP reached 98% using one-step
Hydrophobic Interaction Chromatography purification method． Bioinformatic prediction and analysis found that LipAP possesses con-
served spatial structure with three functional domains including catalytic triad (Ser173-Asp226-His288) ，active site lid (S111 YSIRNWVT-
DAT122)and conserved pentapeptide (GHSLG)．
Key words: Aspergillus parasiticus lipase gene Codon optimization Total gene synthesis Prokaryotic expression Bioinfor-
matics
收稿日期:2011-02-21
基金项目:广州市重点科技攻关项目(2009A1-E021)
作者简介:连英丽，女，硕士，研究方向:生物化学与分子生物学;E-mail:yllian33@ 163． com
通讯作者:杨博，副教授，博士生导师;研究方向:生化工程;E-mail:yangbo@ scut． edu． cn
三酰甘油酯酰基水解酶(Triacylglycerol acyl-
hydrolase，EC 3. 1. 1. 3)俗称脂肪酶(Lipase) ，是一种
广泛存在于动植物和微生物中的水解酶，在动植物
和微生物的代谢中起着重要的作用。脂肪酶可在油
水界面上催化三酰甘油酯等酯类的水解、醇解、转酯
化、酯化、及酯类的逆向合成反应等［1］。因此，脂肪
2011 年第 7 期 连英丽等:寄生曲霉脂肪酶的全基因合成、原核表达及其结构分析
酶在油脂化学、食品加工、精细化工、环境治理、手性
化合物拆分及生物能源等诸多工业领域具有广泛应
用前景，是一种重要的工业用酶［2］。然而，具有高
效催化能力的脂肪酶较少，故有必要筛选新的、具有
较高应用价值的脂肪酶。近年来，多种来源于曲霉
的脂肪酶已被开发应用于工业生产及食品发酵等领
域。然而，对寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)脂肪
酶的研究并不多见，目前仅仅克隆了其基因序
列［3 － 5］，并没有对其酶学特性作进一步研究。
外源蛋白的高效表达与信号肽、目的基因和宿
主菌密码子偏爱性等密切相关，其中，对外源基因密
码子进行优化改造是提高外源蛋白表达量的重要途
径之一［6 － 8］。目前，通过采用宿主偏爱的密码子，已
成功对多个物种的脂肪酶基因进行改造并提高其
产量［9 － 11］。
本研究根据 NCBI 中登录的序列(GenBank 登
录号:AF404488) ，参照大肠杆菌密码子偏爱性对
寄生曲霉脂肪酶基因 Lip AP 进行改造，人工合成
后构建 Lipase AP 表达载体 pFL-B13cl /Lip AP，并
在大肠杆菌 BL21(DE3)中进行诱导表达优化，为
LipAP的酶学特性研究提供了一定的基础。另外，
为了更全面地了解寄生曲霉 Lipase 序列所蕴涵的
生物学信息，本研究对 LipAP 氨基酸序列的二级、
三级结构等进行预测分析，为后续研究工作奠定
理论基础。
1 材料与方法
1. 1 材料
DH5α、BL21 菌株及 BSK 质粒由本实验室保
存，pFL-B13cl质粒购自复能公司。
PrimeStar HS DNA 聚合酶、限制性内切酶、T4
DNA连接酶、低熔点琼脂糖、DNA Marker 和蛋白质
Marker等均购自 TaKaRa 公司。氨苄青霉素、尿素、
谷胱甘肽、巯基乙醇、异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷
(IPTG)、Tris-HCl、NaCl及 EDTA-Na2等试剂均为国药
公司分析纯试剂，p-NPB(对硝基苯丁酸酯)购于美国
Sigma公司，Phenyl Sepharose疏水柱购于 GE公司。
1. 2 方法
1. 2. 1 Lip AP基因的密码子改造及人工合成 根
据寄生曲霉脂肪酶基因 Lip AP序列(GenBank 登录
号:AF404488) ，除去 5端 60 bp信号肽编码序列，通
过密码子优化网站 http:/ / gcua． schoedl． de /改造 Lip
AP基因序列，并在 Lip AP 上下游分别加 Kpn I 和
EcoR I酶切位点，人工设计 9 对重叠引物(表 1) ，参
照 Cherry等［12］的方法，利用稍作改进的两步法分别
合成 Lip AP的上下游片段，最后通过重叠延伸 PCR
连接两片段得到密码子已优化的 Lip AP 基因全长
序列［13］，并克隆到 BSK 载体上，重组质粒命名为
pBSK-Lip AP，转化 E． coli DH5α，筛选阳性克隆子进
行测序验证。两步法 PCR 反应程序: (1)Gene As-
sembly Step:95℃ 4 min，95℃ 30 s，45℃ 30 s，72℃
40 s，15 个循环，72℃延伸 5 min;(2)Gene Amplifica-
tion Step:取 Gene Assembly Step 产物 3 μL 为模板，
95℃ 4 min，95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，20 个
循环，72℃延伸 5 min。重叠延伸 PCR 反应条件参
照 Heckman与 Pease的方法［13］。
1. 2. 2 BSK-Lip AP表达载体的构建 根据克隆载体
pBSK-Lip-AP 序列，设计上游引物 5-CGGGATC-
CTACCCAACGGCAATTGATGT-3，并以 T7T为下游引
物，从 pBSK-Lip AP 中扩增 Lip AP 基因。PCR 反应
程序:95℃ 5 min，95℃ 30 s，58. 5℃ 30 s，72℃ 1 min，
30个循环;72℃延伸 10 min。质粒的抽提、XhoⅠ与
KpnⅠ双酶切、连接等常规分子克隆操作参照《分子克
隆实验指南》，重组质粒命名为 pFL-B13cl /Lip AP，转
化 DH5α细胞，Xho I、Kpn I双酶切及菌落 PCR鉴定，
选取阳性克隆测序确证;重组质粒转化 BL21(DE3)
表达宿主。
1. 2. 3 工程菌的培养及诱导条件优化 挑取重组
菌单菌落至含 100 mg /L 氨苄青霉素的液体 LB 中，
37℃、200 r /min，待菌体生长到 OD600为 1. 0 左右。
以 5 %接种量将种子菌扩大培养，37℃、200 r /min
培养 3 h，对比 IPTG浓度为 0. 1、0. 3、0. 5、0. 7 和 1. 0
mmol /L及温度为 20℃、28℃和 37℃的诱导情况，确
定最佳的诱导表达条件。
1. 2. 4 包涵体的制备及变复性 超声破碎法破碎
细胞，离心沉淀得到脂肪酶包涵体。用洗涤缓冲液
(20 mmol /L Tris-HCl，2 mmol /L EDTA，2 mol /L 尿
素，0. 1 % Triton X-100，pH8. 0)洗涤包涵体除去包
涵体中的膜蛋白及其他杂蛋白。最后用不含 Triton
X-100 的缓冲液洗涤包涵体 2 次，除去包涵体中的
Triton X-100。
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表 1 用于人工合成 Lip AP基因的重叠引物
引物 序列 (5→3)
J1 GG GGTACC TACCCAACGGCAATTGATGTTAGAGACATCCCTACTACCCAGCTCGAAGACTTC
J2 GTAGTTATTGGGGCAGTAGGTGGCAGCAGCATATTGCACCCAGAACTTGAAGTCTTCGAGCTG
J3 GCCCCAATAACTACGTTGCCAAAGACGGCGAAAAGCTGAATTGCTCTGTGGGCAACTGCCCTG
J4 GTATCATCGGAGAAGCTGAGCTTGACAGTAGAACCGGCAGCCTCGACATCAGGGCAGTTGCC
J5 GCTTCTCCGATGATACCATCACCGACACTGCCGGCTTCGTGGCCGTAGACAACACCAACAAGGC
J6 GTGACCCAGTTACGGATAGAGTAGGAGCCACGGAAAGCGACGACGATGGCCTTGTTGGTGTTG
J7 CGTAACTGGGTCACCGACGCAACCTTCCCCCAAACCGACCCAGGACTGTGCGACGGCTGCAAGG
J8 GATACGGTCACGGACGACCTTCCAGGCGGTCCAGAAGCCCAGTTCGGCCTTGCAGCCGTCG
J9 GTCCGTGACCGTATCATCAAGACCCTGGATGAGCTGAAGCCCGAACACAGCGACTACAAGATCG
J10 CAGCTGCGAGCGAGGCGATGGCGGCGCCGAGACTGTGGCCCACGACAACGATCTTGTAGTCGC
J11 CTCGCTCGCAGCTGCTGACCTGCGTACGAAGAATTACGACGCTATCCTGTACGCCTACGCCGC
J12 CCTGGTTGGTGATGAACTCGGCCAGAGGCTTGTTGGCCACACGCGGAGCGGCGTAGGCGTAC
J13 CATCACCAACCAGGGCAACAACTACCGTTTCACTCACAATGACGACCCCGTGCCCAAGCTGCCGC
J14 CGGTGATATAGTATTCAGGGCTGATGTGCACGTAGCCCATAGTCAAGAGCGGCAGCTTGGGC
J15 GAATACTATATCACCGCTCCGGACAACACTACCGTCACCGACAACCAAGTCACCGTTCTCGATGG
J16 GTCAGGCAGTCCGCCGCTCGTGCCGGTGTTTCCCTTGAAGTTCACGTATCCATCGAGAACGG
J17 GCGGACTGCCTGACCTCCTTGCTTTCCACTCGCATGTCTGGTACTTTATCCACGCCGATG
J18 CCG GAATTC TTAACGCAATGGCAATCCAGGACCCTTGCAGGCATCGGCGTGGATAAAG
J1、J18 引物方框内碱基分别为 Kpn I及 EcoR I酶切位点;J8、J9 引物斜体粗写碱基为重叠部分
用 6 mol /L 尿素缓冲液(20 mmol /L Tris-HCl，
100 mmol /L NaCl，2 mmol /L EDTA，2 mmol /L DTT，6
mol /L尿素，pH8. 0)溶解脂肪酶包涵体，室温变性 2
h，11 000 r /min 4℃离心 20 min，上清即为变性液。
将变性液用复性缓冲液(20 mmol /L Tris-HCl，100
mmol /L NaCl，1 mmol /L EDTA，1 mmol /L 还原型谷
胱甘肽，0. 1 mmol /L 氧化型谷胱甘肽，pH8. 0)稀释
60 倍至尿素终浓度为 0. 1 mmol /L，4℃放置 12 h，离
心得复性液。
1. 2. 5 蛋白纯化 将复性液换盐，Phenyl Sepharose
疏水柱层析纯化:上样缓冲液(20 mmol /L Tris-HCl，
2 mol /L NaCl，pH8. 0)平衡柱子，上样，分别用含 2、
1、0. 5、0. 3、0. 1 和 0 mol /L NaCl 的 20 mmol /L Tris-
HCl 缓冲液洗脱，收集洗脱液并进行 SDS-PAGE
分析。
1. 2. 6 酶活性测定 脂肪酶活性的测定以对硝基
苯丁酸酯(p-NPB)为底物，反应体系:0. 05 mol /L
Tris-HCl(pH8. 5)缓冲液 70 μL，酶液 20 μL，30℃预
热 5 min，加入 10 mmol /L p-NPB 10 μL，反应 5 min
后加乙醇终止反应。405 nm 下测定吸光值，以 1
min内催化产生 1 μmol 对硝基苯酚所需的酶量定
为 1 个酶活力单位(U)。
1. 2. 7 Lipase AP蛋白序列的生物信息学分析 利
用 NCBI蛋白质保守结构域搜寻工具 Conserved Do-
main Search Service(CD Search) (http:/ /www． ncbi．
nlm． nih． gov /Structure /cdd /wrpsb． cgi) ，对 Lipase AP
的保守结构域进行预测。
应用 3D-JIGSAW 蛋白质同源建模服务器(ht-
tp:/ /bmm． cancerresearchuk． org / ～ 3djigsaw /)对 Li-
pase AP 进行三维结构预测，并利用 RasMol 软件
(2. 7. 2. 1. 1 版本)对结果进行可视化处理。
2 结果
2. 1 Lip AP基因的人工合成
经密码子优化的寄生曲霉脂肪酶基因 Lip AP
全长序列(不含信号肽编码序列)共有 31 个碱基突
变，Lip AP的人工合成流程，见图 1。
第一步合成 Lip AP 的上下游重叠片段:将设
计的相互重叠的引物分为 2 组(J1-8 和 J9-18，各引
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2011 年第 7 期 连英丽等:寄生曲霉脂肪酶的全基因合成、原核表达及其结构分析
物间具有 13 至 17 bp 重叠不等) ，分别合成 Lip AP
的上下游片段，其 PCR 产物分别命名为 Lip AP1 及
Lip AP2，两片段间相互重叠 15 bp(图 1) ，理论大小
分别为 401 bp和 492 bp，琼脂糖凝胶电泳检测结果
与预期相符(图 2-a)。
第二步 Lip AP全基因的合成:以 J1 和 J18 为上
下游引物，运用二步重叠延伸 PCR 法连接 Lip AP1
和 Lip AP2，PCR产物大小为 878 bp，与理论大小相
符(图 2-b)。
合成的全长基因分别以 Kpn I 及 EcoR I 酶切，
并将其连接到相同限制性酶切的 BSK 载体上，对阳
性克隆子的插入片段进行序列分析。以克隆载体
pBSK-Lip AP为模板扩增 Lip AP基因片段，Xho I和
Kpn I酶切 Lip AP片段及 pFL-B13cl，最后经亚克隆
获得表达载体 pFL-B13cl /Lip AP，测序结果表明，所
获得的插入片段序列与预期设计的相一致。
Lip AP1 上游及 Lip AP2 下游方框分别为限制性酶切位点 Kpn I及 EcoR I，Lip AP1 下游及 Lip AP2 上游方框分别为 Lip AP上下游
片段相互重叠部分，人工合成的 Lip AP基因全序列不含信号肽编码序列
图 1 寄生曲霉脂肪酶基因 Lip AP的人工合成流畅图
1． J1-8 引物合成 Lip AP上游片段;2． J9-18 引物合成 Lip
AP下游片段;M． 100 bp Marker;3． Lip AP全长片段
图 2 密码子优化 Lip AP的人工合成
2. 2 工程菌的表达优化
经 SDS-PAGE 分析，重组菌成功表达重组蛋白
His-sumo-LipAP(图 3) ，大小约为 53 kD，其中 His-
sumo标签约为 20 kD，LipAP 为 33. 5 kD。IPTG 诱
导表达的目的融合蛋白为不溶性包涵体。
如图 3 所示，0. 1 mmol /L IPTG就足够获得很好
的表达量。IPTG浓度过低不足以充分诱导重组蛋
1．蛋白质 Marker;2．未加 IPTG 诱导;3 － 7． 分别是 IPTG
终浓度为 0. 1、0. 3、0. 5、0. 7、1. 0 mmol /L诱导表达
图 3 不同 IPTG浓度诱导重组菌表达
产物的 SDS-PAGE分析图
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 7 期
白表达，浓度过高造成浪费且对菌体产生毒性，不利
于菌体生长，影响外源蛋白的表达。
试验表明低温诱导不能改善蛋白可溶性，重组
菌表达的 His-sumo-LipAP 融合蛋白仍为包涵体。
在表达量一定的情况下，低温诱导所需时间长，高温
可缩短诱导时间。从图 4 可看出，37℃诱导 6 h 重
组菌的表达量可达最高。
1． Marker;2．未诱导;3 － 5. 20℃诱导 6 h总菌、上清和沉
淀;4 － 8. 28℃诱导 6 h 总菌、上清、沉淀;9 － 11. 37℃诱
导 6 h总菌、上清和沉淀
图 4 不同温度诱导 6 h重组菌产物的 SDS-PAGE分析图
2. 3 融合蛋白纯化
His-sumo-LipAP融合蛋白有(His)6标签，可用
金属亲和层析进行纯化。试验表明，金属亲和层析
只能对融合蛋白进行初步纯化，无法除去大部分杂
蛋白。由于融合蛋白 His-sumo-LipAP 在强离子浓
度(2 mol /L NaCl)下仍比较稳定，因此可选择疏水
柱层析对目标蛋白进行纯化。试验表明，利用 Phenyl
Sepharose疏水柱层析一步纯化即可得到纯度达 98
%的目标蛋白。SDS-PAGE凝胶电泳(图 5)显示纯化
后的脂肪酶为单一条带，对底物 p-NPB 的酶活性为
121 U/mg。故在包涵体复性之后选择疏水层析进行
一步纯化(图 6) ，简化了步骤，也提高了收率。
2. 4 LipAP蛋白质结构分析
NCBI蛋白质保守结构域搜寻工具 CD Search 分
析发现，LipAP 具有 3 个典型的脂肪酶保守结构域
(图 7) :(1)催化三联体(catalytic triad)Ser173-Asp226-
His288;(2)活性部位盖子(active site flag / lip)S111 YS-
IRNWVTDAT122;(3)水解酶保守五肽序列(nucleo-
philic elbow)G171HSLG175。利用 3D-JIGSAW对 Lipase
AP进行同源建模，结果符合 α /β水解酶的结构特点
(图 8) :β-折叠位于脂肪酶分子的中央，α-螺旋包围
在 β-折叠的外面，形成近似球形的蛋白质分子［14］。
绝大多数脂肪酶都由 Ser、Asp(或 Glu)和 His
1． marker;2．复性液;3．复性液换盐;4．疏水柱纯化
图 5 SDS-PAGE凝胶电泳结果 图 6 His-sumo-LipAP的疏水层析
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2011 年第 7 期 连英丽等:寄生曲霉脂肪酶的全基因合成、原核表达及其结构分析
构成催化活性中心三联体［15］，其催化中心拥有相似或
相同的特征性结构域 GXSXG［16］。活性中心的氨基酸
残基并不直接暴露到溶剂当中，而是埋入一个油水界
面(water / lipid interface)，被“盖子”所屏蔽，当“盖子”
打开，催化三联体暴露，底物及溶剂得以接近活性中
心，此过程称为界面活化(interfacial activation)［17］。
图 7 LipAP的蛋白保守结构域
催化三联体 Ser173 -Asp226 -His288以球体标记，右上角箭头所指部分为四氨基酸残基 Gly171、His172、Leu174和 Gly175，与催化三联体中
的 Ser173共同组成保守五肽 G171HS173 LG175，左下角箭头所指球体部分为活性中心盖子 S111YSIRNWVTDAT122
图 8 LipAP的同源建模
3 讨论
大肠杆菌原核表达系统遗传背景清楚，培养条
件简单，培养周期短，适合很多原核基因以及一些真
核基因的表达。目前，已有多个物种的脂肪酶基因
成功在大肠杆菌中表达［18，19］。然而，外源蛋白的表
达水平与启动子序列、表达载体、信号肽、密码子物
种偏爱性以及发酵条件等息息相关。其中，密码子
的使用频率差异是影响外源蛋白表达效率的主要因
素之一，因此，优化外源基因密码子是提高外源蛋白
表达量的重要途径之一［6 － 8］。本研究根据寄生曲霉
脂肪酶基因 Lip AP 序列设计了 9 对重叠引物分别
合成 Lip AP 基因上下游片段，利用重叠 PCR 连接
合成密码子经改造的 Lip AP基因全长序列，测序结
果表明人工合成的基因序列正确。
由于在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质
折叠的辅助因子或环境不适，无法形成正确的次级
键，或者重组蛋白表达量过高，合成太快，以至没有足
够的时间进行折叠，二硫键不能正确配对等原因，脂
肪酶基因在大肠杆菌内表达时往往容易形成包涵
体［20，21］。研究表明，小分子泛素修饰蛋白(small ubiq-
uitin-related modifier，Sumo)能显著增加重组蛋白表
达量，提高重组蛋白可溶性，促进蛋白质正确折
叠［22］。目前，利用 Sumo 融合标签构成的表达系统
已成功表达了一系列在传统情况下难以表达或可溶
性不好的重组蛋白［23，24］。然而，有一些蛋白在融合
了 Sumo 标签的条件下表达仍不可溶，本研究证实
His-sumo-LipAP即为不可溶包涵体。为了获得有活
性的可溶性蛋白，需要对其进行变复性处理，目前已
有几个物种的脂肪酶包涵体通过变复性处理获得了
具有活性的可溶性融合蛋白［25 － 27］。本研究使用较
低浓度变性剂溶解包涵体并以 GSH /GSSG 缓冲体
系复性，透析处理后便可获得具有活性的可溶性融
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 7 期
合蛋白 His-sumo-LipAP，表明变复性处理包涵体以
提高融合蛋白溶解度及活性的方法可行。
本研究对 LipAP 在大肠杆菌 BL21(DE3)内进
行重组表达的主要因素进行了优化，确定了诱导表
达的条件。最后，利用生物信息学工具分析发现，
LipAP在空间结构上较为保守，具有脂肪酶的保守
功能结构。
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(责任编辑 狄艳红)
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