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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第9期
桦褐孔菌（Inonotus obliquus（Fr）Pilat）主要分
布于北纬 40 -50°高寒地区，寄生于白桦树的树干
上，经过多年的缓慢生长后会在树干的表面形成黑
色的菌核［1］。桦褐孔菌菌核含有多种次级代谢产物，
主要包括多酚类化合物［2-4］，黑色素类［5］及三萜类［6］
化合物。其中多酚类化合物是一类分子量小、抗氧
化活性十分显著的次级代谢产物［2，7］，对氧化胁迫
诱导的癌症、高血压和糖尿病、老年痴呆症都有潜
在的预防和治疗作用［8］。
收稿日期 ：2014-04-23
基金项目 ：江苏师范大学自然科学基金项目（13XLB02）
作者简介 ：魏志文，男，硕士，研究方向 ：应用微生物 ；E-mail: zhiwen_wei@126.com
激发子对桦褐孔菌多酚合成的诱导及其生化机制初探
魏志文1  孙勇1  王菲2
（1. 江苏师范大学 江苏省药用植物生物技术重点实验室，徐州 221116 ；2. 江苏师范大学生命科学学院，徐州 221116）
摘 要 ： 旨在研究真菌激发子对桦褐孔菌多酚合成的影响，采用液体摇瓶培养方式，将真菌激发子加入到桦褐孔菌液体培
养物中，检测桦褐孔菌次级代谢产物的积累，以及真菌激发子对桦褐孔菌一氧化氮合酶（NOS）活性的影响。结果表明，适量添
加真菌激发子能够提高桦褐孔菌的代谢速率，提高多酚类化合物的合成，胞内和胞外多酚最高可达 102.15 mg/L 和 311.91 mg/L，并
能显著提高桦褐孔菌 NOS 的活性，其活性最高可达 151.93 U/mg prot，发酵液一氧化氮（NO）含量最高可达 256.28 μmol/L。这表明，
真菌激发子能够有效激活桦褐孔菌的次级代谢产物合成途径。
关键词 ： 真菌激发子 酚类化合物 桦褐孔菌 次级代谢产物 深层发酵
The Production of Phenolic Compounds of Inonotus obliquus by Fungal
Elicitor Introducing and Its Study of Biochemical Mechanism
Wei Zhiwen1 Sun Yong1 Wang Fei2
（1. Key Laboratory for Biotechnology on Medicinal Plants of Jiangsu Province，Jiangsu Normal University，Xuzhou 221116 ；
2. School of Life Science，Jiangsu Normal University，Xuzhou 221116）
Abstract: In order to study the effects of fungal elicitor on secondary metabolites of Inonotus obliquus, using shaking flask method, the
fungal elicitor was added to the liquid cultures of Inonotus obliquus, detected the accumulation of secondary metabolites, and the effects of fungal
elicitor on Inonotus obliquus nitric oxide synthase（NOS）activity, discussed the influence of elicitors to Inonotus obliquus liquid fermentation
process and the accumulation of secondary metabolites. The results showed that the addition of fungal elicitor could improve the metabolic rate of
Inonotus obliquus and the accumulation of polyphenols. The intracellular and extracellular polyphenols were up to 102.15 mg/L and 311.91 mg/L,
and could also significantly improve the activity of NOS, NOS activity was up to 151.93 U/mg prot, nitric oxide content in the fermentation liquid
was up to 256.28 μmol/L. This showed, fungal elicitor could effectively active the biosynthesis pathway of secondary metabolites of Inonotus
obliquus.
Key words: Fungal elicitor Phenolic compounds Inonotus obliquus Secondary metabolites Submerged culture
因为野生桦褐孔菌生长极为缓慢，所以其资源
非常稀少。因此人工培养桦褐孔菌成为国内外许多
学者研究的目标。但人工培养的桦褐孔菌在总酚含
量和抗氧化活性等方面都较野生桦褐孔菌低。所以，
提高人工培养的桦褐孔菌多酚含量具有重要的应用
价值。
一氧化氮（NO）是近年来发现对植物细胞次生
代谢产物合成具有调控作用的一种新型信号分子，
且有研究报道真菌激发子能引起植物细胞的防御反
2014年第9期 137魏志文等：激发子对桦褐孔菌多酚合成的诱导及其生化机制初探
应，并促进植物次级代谢产物的积累［9-11］，因此本
试验研究真菌激发子对桦褐孔菌发酵过程的影响和
多酚合成的作用，并初步探讨真菌激发子对桦褐孔
菌合成次级代谢产物的诱导信号及其机理。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种与培养基 桦褐孔菌（Inonotus obliquus）
为本实验室保存。固体种子培养基为 PDA 培养基 ；
液体培养基：葡萄糖 20 g、蛋白胨 3.5 g、酵母膏 1 g、
KH2PO4 1 g、MgSO4×7H2O 0.5 g、CaCl2 0.1 g，pH 自然。
黑曲霉（Aspergillus niger）为本实验室保存，其
液体培养基为马铃薯葡萄糖培养基。
1.1.2 药 品 和 试 剂 Folin-Ciocalteu 试 剂（ 自 制 ），
NO 含量和 NOS 活性测定试剂盒（南京建成生物工
程研究所）。
1.1.3 试验仪器 Flexi-Dry MP 冷冻干燥机（U.S.-
Pat.），722 光栅分光光度计（上海精密科学仪器有限
责任公司），FLUKO 匀浆器（上海弗鲁克流体机械
制造有限公司），超声破碎机（JY92-2D，Scientz），
HD-930 型组合式全温摇床（太仓市博莱特实验仪
器厂）。
1.2 方法
1.2.1 细胞壁激发子的制备 将实验室保藏的一株
黑曲霉活化接种于马铃薯液体培养基中，26℃，140
r/min 摇床培养 5 d。过滤除去发酵液，菌丝用去离
子水洗涤 3 次，而后在室温下、去离子水中用超声
破碎将菌丝体破碎 10 min、间隔为 20 s。菌丝体碎
片用 0.45 μm 滤网过滤，将直径小于 0.45 μm 的细胞
壁碎片冷冻干燥、称重并灭菌，作为激发子。
1.2.2 细 胞 壁 激 发 子 对 桦 褐 孔 菌 发 酵 过 程 的 影
响 于装液量为 200 mL 的 500 mL 三角瓶中接种桦
褐孔菌菌丝球，接种量 5%，26℃，140 r/min 培养 2
d 后，在无菌条件下分别加入终浓度为 30、50、70
和 90 mg/L 的真菌激发子，每组 3 瓶，对照组加入 5%
的培养基，每个样品立即取样 15 mL，而后每隔 2 d
取样一次，共取样 7 次。将样品中菌丝与发酵液分离，
分别测定各个相关指标。
1.2.3 菌丝体重量测定 采用滤纸片干重法。
1.2.4 胞内和胞外酚类化合物的测定 将样品离
心，菌丝体称重后浸入乙醇∶丙酮 =1∶1 的溶液中，
匀浆后冰水浴超声破碎提取，离心取上清，重复 3
次，合并提取液。挥干溶剂后用水定容，以 Folin-
Ciocalteu 法［12-14］检测多酚含量，根据多酚标准曲
线计算出胞内多酚的含量。胞外多酚测量方法同上，
样品为发酵液。
1.2.5 发酵液还原糖含量的测定 采用 DNS 法［15］。
1.2.6 氨基氮含量测定方法 参照刘晓庚等［16］的
光度滴定法。
1.2.7 蛋白质含量的测定方法 考马斯亮蓝法测定
蛋白质含量［17］。
1.2.8 激发子诱导后 NO 含量和 NOS 活性变化的测
定 接种 6 瓶桦褐孔菌液体培养物，装液量同 1.2.2，
接种量 5%，26℃，140 r/min 培养 4 h，分为两组，
一组为诱导组，一组为对照组，诱导组加入 50 μg/L
激发子，对照组加入相同量的液体培养基，加入激
发子后立即取样，设为 0 时，以后每 4 h 取样一次，
共取 7 次，测定 NO 含量和 NOS 活性，检测激发子
对胞内 NOS 活性和 NO 含量的影响，检测方法依据
试剂盒说明书。
NOS 活性为 1 min 每毫克蛋白产生 1 nmol NO 的
能力，为一个酶活单位（U）。
2 结果
2.1 真菌激发子对桦褐孔菌生物量和发酵过程还
原糖含量的影响
由图 1 可知，桦褐孔菌的诱导组和对照组其
生长趋势基本一致，在培养 6 d 后生物量增加逐渐
趋缓进入平稳期，在第 8 天生物量达到最高值，对
5
4
3
2
1
0
0 2 4ษޫᰦ䰤d㧼эփg/L 6 8 10 12CTR30 μg/L E50 μg/L E70 μg/L E90 μg/L E
CTR 为对照组，30 μg/L 为激发子在发酵液中的终浓度，下同
图 1 生物量变化曲线
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第9期138
照 组 为 4.43 g/L，30 mg/L 激 发 子 组 为 4.76 g/L，50
mg/L 激发子组为 4.95 g/L，70 mg/L 激发子组为 4.61
g/L，90 mg/L 激发子组为 4.55 g/L，各激发子诱导组
的生物量均高于对照组，这说明激发子在一定程度
上促进了桦褐孔菌的代谢过程，增加了桦褐孔菌的
生物量。图 2 显示，桦褐孔菌发酵过程中发酵液的
还原糖在开始的 2 d 迅速减少，这是由于桦褐孔菌
正处于对数生长期，菌丝体的快速生长消耗了发酵
液中的还原糖，而后菌体的生长进入稳定期，发酵
液中的还原糖消耗速率减小。同时，与对照组相比，
真菌激发子对桦褐孔菌发酵液中还原糖的消耗有一
定的促进作用，特别是在加入激发子后的 4 d 中，
这一现象比较明显，说明激发子促进了桦褐孔菌对
发酵液中还原糖的代谢。
变化十分相似（图 2），这说明在菌体的对数生长期，
菌体对碳源和氮源的消耗量非常大，从而导致氨基
氮和还原糖的含量迅速降低，随着菌体生长进入稳
定期，由于受到发酵液中的营养物质和培养体系的
限制，导致菌体的增殖速度下降，而氨基氮的消耗
速度也相应的逐渐减缓。其中激发子诱导组的氨基
氮含量下降速度较对照组更为显著，说明激发子提
高了桦褐孔菌的代谢速率。
䘈৏㌆mg/L
0 2 4 ษޫᰦ䰤d6 8 10 127006005004003002001000 CTR30 μg/L E50 μg/L E70 μg/L E90 μg/L E
图 2 还原糖的变化曲线
2.2 真菌激发子对发酵液pH值和发酵液氨基氮含
量的影响
由于摇瓶中溶解氧的含量相对较少，可能不能
满足桦褐孔菌生长过程中对溶解氧的需求，所以在
培养前期，随着还原糖的消耗，培养体系中积累的
有机酸逐渐增加，从而导致发酵液 pH 逐渐变小，
培养 8 d 后，激发子诱导组的 pH 均达到最低值，接
近 pH3.2，随后 pH 有所上升。而对照组在第 10 天
达到最低值 pH3.36，而后小幅上升。试验中出现这
种 pH 的变化，可能是由于还原糖消耗殆尽以及生
成了部分生物碱，导致发酵液的 pH 有一个小幅的
反弹，这需要进一步的试验加以验证（图 3）。图 4
显示，桦褐孔菌培养物中加入激发子后 2 d，发酵液
中的氨基氮含量迅速下降，这与发酵液中还原糖的
0 2 4ษޫᰦ䰤d6 8 10 125.55.04.54.0pH 3.53.0 CTR30 μg/L E50 μg/L E70 μg/L E90 μg/L E
图 3 pH 变化曲线
图 4 氨基氮变化曲线
2.3 真菌激发子对桦褐孔菌胞内和胞外多酚含量
的影响
图 5 显示，桦褐孔菌培养液加入激发子后 10 d
内，发酵液中胞内多酚含量迅速增加。4 个浓度的
激发子诱导组中，桦褐孔菌多酚的含量均高于对照
组，特别是采用 50 μg/L 的激发子诱导组的胞外多
酚含量增加显著，在接种后第 10 天，胞内多酚的含
量达到最大值为 102.15 mg/L，而同期对照组多酚含
量为 65.05 mg/L，这说明真菌激发子确实可以诱导
桦褐孔菌增加多酚类物质的合成。但到了发酵后期，
0 2 4 ษޫᰦ䰤d6 8 10 12250200150100≘ส≞mg/L 500 CTR30 μg/L E50 μg/L E70 μg/L E90 μg/L E
2014年第9期 139魏志文等：激发子对桦褐孔菌多酚合成的诱导及其生化机制初探
营养物质消耗殆尽，导致酚类化合物的合成减少。
图 6 显示，诱导组加入激发子后，多酚类化合物的
含量迅速上升，在培养到 8 d 时酚类含量达到最大值，
50 μg/L 的激发子诱导组的胞外多酚为 311.91 mg/L，
70 μg/L 的激发子诱导组的胞外多酚含量达到 235.31
mg/L，30 μg/L 的激发子诱导组的胞外多酚含量为
223.30 mg/L，90 μg/L 的激发子诱导组的胞外多酚含
量为 213.32 mg/L，而对照组在第 8 天的多酚含量为
171.35 mg/L。诱导组和对照组的胞外多酚的含量均
高于同组的胞内多酚含量，这说明桦褐孔菌的多酚
类物质在合成过程中不断地向胞外溶出。但菌体进
入衰亡期后，大量菌体自溶，致使发酵体系中自由
基大量增加，可能是发酵液中酚类化合物含量显著
下降的原因。
激发子诱导后，诱导组的桦褐孔菌 NOS 活性迅速升
高，培养到第 12 h 时，NOS 活性达到最高值 151.93
U/mg prot，而后呈缓慢下降趋势 ；而对照组在 20 h
的培养阶段中，NOS 活性没有显著的变化，说明在
发酵体系中加入真菌激发子后，可以在较短时间内
迅速激活桦褐孔菌的 NOS 活性，并可以保持一定时
间的高酶活性。图 8 显示，激发子组发酵液中 NO
的含量伴随着 NOS 活性的增加而迅速升高，NO 的
最高含量可达 256.28 μmol/L，这与真菌激发子诱导
的 NOS 活性变化趋势一致，而对照组中 NO 的含量
在取样周期内基本维持稳定，其含量没有超过 80
μmol/L。NOS 活性的提高导致 NO 含量的显著上升，
说明 NO 可能是真菌激发子诱导桦褐孔菌合成多酚
类次级代谢产物的一种信号物质。
图 5 胞内多酚变化曲线
图 6 胞外多酚变化曲线
图 7 NOS 活性变化曲线
图 8 NO 含量变化曲线
0 2 4 ษޫᰦ䰤d6 8 10 12100806040200㜎޵ཊ䞊ਜ਼䟿mg/L CTR30 μg/L E50 μg/L E70 μg/L E90 μg/L E
0 2 4 ษޫᰦ䰤d6 8 10 12350300250200150100㜎ཆཊ䞊ਜ਼䟿mg/L 50 CTR30 μg/L E50 μg/L E70 μg/L E90 μg/L E
2.4 真菌激发子对桦褐孔菌胞内NOS活性和发酵
液NO含量的影响
图 7 显示，在加入激发子之前，诱导组和对照
组桦褐孔菌 NOS 活性基本相当，但加入 50 μg/L 的
0 5 10ษޫᰦ䰤d 15 20160140120100NOSU/mgprot 8060 CTR50 μg/L E
0 5 10ษޫᰦ䰤d 15 20250200150100NOਜ਼䟿μmol/L 50 CTR50 μg/L E
3 讨论
在高等植物大豆的细胞中，当遭到真菌大豆茎
溃疡病菌的侵害时，NO 会介导抗菌黄酮类化合物的
生物合成［18］，相似的现象也出现在那些添加了黑曲
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第9期140
霉细胞壁碎片的贯叶连翘细胞悬浮培养液中［19］。
因此试验利用真菌激发子加入到桦褐孔菌的液
体培养物中，通过测定发酵液中桦褐孔菌的生物量、
pH、还原糖、氨基氮、胞内多酚含量和胞外多酚含量，
研究真菌激发子对桦褐孔菌代谢过程的影响。试验
结果显示，在真菌激发子诱导的发酵体系中，随着
发酵时间的延长，其生化指标较对照组变化更加明
显。这说明真菌激发子促进了桦褐孔菌的代谢过程，
并诱发了次级代谢产物多酚的生物合成。但是作为
植物信号分子的 NO［9］与桦褐孔菌多酚的生物合成
是否存在联系，需要通过相关试验验证。我们通过
试验发现正常生长情况下桦褐孔菌发酵液中可以检
测到 NO 的存在和 NOS 的活性，这说明在植物体内
存在的 NOS 在桦褐孔菌中也存在，当向发酵液中添
加了激发子后 NOS 活性出现大幅增加，增加到对照
组 NOS 活性的 3 倍，说明黑曲霉细胞壁激发子可以
提高桦褐孔菌 NOS 活性，从而促进 NO 的迸发。通
过胞外多酚与 NO 含量变化对比发现，真菌激发子、
NO 和多酚的合成存在相关性，从以上的试验结果可
以初步推断真菌激发子诱发了 NO 的迸发，从而导
致总酚化合物的积累。但真菌激发子与桦褐孔菌多
酚化合物的合成过程中的信号机制则需要进一步的
试验研究。
4 结论
利用真菌激发子对桦褐孔菌液体发酵过程进
行调控，发现真菌激发子可以有效促进桦褐孔菌的
代谢速率，增加生物量，促进其次级代谢产物——
多酚类化合物的生物合成，并能显著提高桦褐孔菌
NOS 活性，从而促进 NO 含量大幅增加，表明 NO
与桦褐孔菌次级代谢产物的合成存在一定的相关性。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）