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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第2期
收稿日期 ：2012-08-08
基金项目 ：广西自然科学基金项目（2011GXNSFD018018），亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室开放课题（SB0907）
作者简介 ：辛桂瑜，女，硕士，研究方向 ：动物干细胞与生物技术 ；E-mail ：xgy_4321@163.com
通讯作者 ：郑喜邦，男，博士，教授，硕士生导师，研究方向 ：临床兽医 ；E-mail ：zhxibang2005@126.com
山羊 Klf4 基因克隆、原核表达和 His-Klf4
融合蛋白纯化
辛桂瑜1  王丽霞1  叶新慧1  申魁魁1  符欣蕙1  李恭贺1  张明1，2   
卢晟盛1，2  卢克焕1，2  郑喜邦1
（1. 广西大学动物科技学院，南宁 530004 ；2. 亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室，南宁 530004）
摘 要 ： 旨在克隆山羊 Klf4 基因，构建重组质粒 pET30a-Klf4，通过原核表达技术获得纯化的 His-Klf4 融合蛋白。从山羊的
生殖脊中提取总 RNA，用 RT-PCR 的方法扩增 Klf4 基因编码区序列，通过 TA 克隆构建 pMD18-T-Klf4 重组质粒。酶切鉴定与测序
分析后将 Klf4 的 cDNA 亚克隆至 pET-30a 载体，构建重组质粒 pET30a-Klf4。酶切鉴定后将其导入大肠杆菌 BL21 中，用 IPTG 诱
导表达，SDS-PAGE 和 Western blotting 检测确认，镍离子金属螯合亲和层析法纯化 His-Klf4 融合蛋白。结果表明 ：（1）从山羊生殖
脊中克隆了 Klf4 基因，其开放阅读框由 1 434 个核苷酸组成，编码 478 个氨基酸，而且该序列与绵羊的同源性最高，达到 98.5％ ；
（2）经过 SignalP 4.0 在线分析，Klf4 的编码蛋白不存在信号肽 ；（3）经 SDS-PAGE 和 Western blotting 分析表明，重组质粒 pET30a-
Klf4 在大肠杆菌中得以表达 ；在变性条件下纯化，获得了 His-Klf4 融合蛋白。
关键词 ： Klf4 分子克隆 原核表达 蛋白纯化 山羊
Cloning and Prokaryotic Expression of Capra hircus Klf4，and
Purification of His-Klf4 Fusion Protein
Xin Guiyu1 Wang Lixia1 Ye Xinhui1 Shen Kuikui1 Fu Xinhui1 Li Gonghe1 Zhang Ming1，2
Lu Shengsheng1，2 Lu Kehuan1，2 Zheng Xibang1
（1. College of Animal Science and Technology，Guangxi University，Nanning 530004 ；2. State Key Laboratory for Conservation and
Utilization of Subtropical Agro-bioresources，Nanning 530004）
Abstract:  The paper was to clone Klf4 gene of Capra hircus, and construct recombinant plasmid pET30a-klf4, and finally to prepare the
purified His-klf4 fusion protein by means of prokaryotic expression techniques . Total RNA extracted from the genital ridge of fetal Capra hircus,
Klf4 cDNA was amplified by RT-PCR and the plasmid pMD18-T-Klf4 was constructed by TA cloning. After restriction endonuclease digestion
and sequencing analysis, Klf4 cDNA was subcloned to pET-30a vector to obtain a recombinant plasmid pET30a-Klf4. Transformed into E. coli
BL21, the recombinant plasmid pET30a-Klf4 was induced to express by IPTG, which was verified by SDS-PAGE and Western blotting analysis.
Finally, the His-Klf4 fusion protein was purified via metal Nickel-chelating affinity chromatography. The results showed that ：（1）the Klf4 gene
was successfully cloned from promodial genital ridges of fetal Capra hircus ；the open reading frame（ORF）of Capra hircus Klf4 is composed
of 1434 nucleutide acids, coding 478 amino acids ；comparison of sequence similarity of Capra hircus Klf4 homologue with other vertebrate Klf4
homologues indicated that Capra hircus shared the highest homology（98.5%）with Ovis aries.（2）Signal peptide prediction by SignalP 4.0
online showed that there was no signal peptide in the coding proteins of Capra hircus Klf4.（3）SDS-PAGE and Western blotting assay showed
that the recombinant plasmid was expressed in E.coli BL21, and His-Klf4 fusion protein was purified under denature condition.
Key words:  Klf4 Molecular cloning Prokaryotic expression Protein purification Capra hircus
2013年第2期 81辛桂瑜等 ：山羊 Klf4 基因克隆、原核表达和 His-Klf4 融合蛋白纯化
Klf4（Krüpple like factor 4，Krüpple 样 因 子 4）
是一类含 3 个锌指结构的双向转录因子。长期以来，
由于 Klf4 在细胞增殖、分化、生长特别是与肿瘤的
发生、发展有密切关系而备受关注。Klf4 可以促进
胚胎干细胞的自我更新［1］；Sikora 与 Ghosh［2，3］的
研究还表明，Klf4 具有促进表皮的增殖分化以及抑
制膀胱癌等恶性肿瘤发生等多种功能。Klf4 在许多
类型的肿瘤中特异性过表达或者缺失，例如，在结
肠癌、小肠癌、膀胱癌、前列腺癌和食道癌等肿瘤
中 Klf4 低表达［4-8］，胃癌中 Klf4 有杂合性缺失的表
现［9］，而在原发性乳腺导管癌以及口腔鳞癌中 Klf4
高表达［10，11］。近年来对干细胞的相关研究表明，
Klf4 等因子参与体细胞重编程，并发挥重要作用［12］。
Takahashi 等［13］ 将 Klf4、 Sox2、Oct4、c-Myc 四 个
转录因子导入小鼠成纤维细胞中，获得了 iPS 细胞
（induced pluripotent stem cells），这一突破为患者自
身遗传特性的 ES 细胞获取提供了新的途径，也为临
床治疗提供了新的研究方向。此后，Takahashi 等［14］
用同样的方法获得了人类 iPS 细胞 。 Hanna 等［15］
利用人类镰状细胞性贫血的小鼠动物模型，对其导
入 Klf4、Sox2、Oct4 及 c-Myc 基因，将小鼠皮肤成
纤维细胞重编程为自体 iPS 细胞，并对 iPS 细胞进
行诱导分化，从而得到造血功能正常的前体细胞，
进而起到了治疗作用。迄今为止，已相继获得了猕
猴、猪、大鼠和绵羊等物种的 iPS 细胞［16-19］，但是
尚未见有关山羊体细胞重编程的报道。王春生等［20］、
杨越飞等［21］对小鼠和绵羊 Klf4 基因分别进行了原
核及真核表达的研究，但山羊 Klf4 基因的研究未见
报道。
本研究旨在克隆山羊 Klf4 基因，并构建其原核
表达载体，在大肠杆菌中诱导表达，纯化 His-Klf4
融合蛋白，从而为其多克隆抗体制备奠定基础，也
为进一步研究山羊多能干细胞创造良好条件。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌 种 与 质 粒 大 肠 杆 菌 BL21（DE3） 和
DH5α，质粒 pET-30a 由本实验室保存。
1.1.2 主要试剂 TRIzol LS® Regent RNA 提取试剂盒
购自 Invitrogen 公司（美国）；反转录试剂盒、T4 DNA
连接酶、限制性内切酶 EcoR I 和 Hind Ⅲ、pMD18-T
载体、IPTG，胶回收试剂盒均购自宝生物工程有限
公司（大连）；蛋白预染 Marker 购自 Fermentas 公司
（立陶宛）；DNA Marker 2000 购自百维信生物科技有
限公司（厦门）；EB 替代染料（GeneFinder 核酸染料），
购自康为公司（北京）；质粒小量提取试剂盒，购
自 Omega Bio-Tek 公司（美国）；鼠源 His 标签抗体、
山羊抗鼠 IgG 购自 TIANGEN 公司（北京）。
1.2 方法
1.2.1 目的片段的克隆与测序 根据 GenBank 中
牛 Klf4 mRNA 序 列（NM.001105385.1） 设 计 一 对
引物，在引物 5 端分别引入 EcoR I 和 Hind Ⅲ酶切
位点。引物由 Invitrogen 公司合成，预计扩增片段
为 1 434 bp。从山羊生殖脊提取总 RNA，再反转录
为 cDNA，以 cDNA 为模板，进行 PCR 扩增。25 μL
PCR 反应体系为 ：2×GC Buffer I 12.5 μL，dNTP mix
2.5 μL，上下游引物各 0.5 μL，Ex Taq DNA 聚合酶
0.15 μL， 模 板 cDNA 0.75 μL， 加 双 蒸 水 7.25 μL。
反 应 条 件 为 ：94 ℃ 预 变 性 3 min ；94 ℃ 变 性 30 s，
61.6℃退火 90 s，72℃延伸 1 min，共 30 个循环 ；
72 ℃ 延 伸 10 min。PCR 产 物 经 1% 琼 脂 糖 凝 胶 电
泳、切胶后，用胶回收试剂盒纯化。目的片段与
pMD18-T 载体 16℃连接过夜，转化 DH5α 感受态细
菌，涂板。挑斑、增菌、小提质粒，分别用 EcoR I
和 Hind Ⅲ进行双酶切鉴定，阳性质粒送宝生物工程
有限公司测序。
1.2.2 信号肽预测 用 DNAStar 软件比较山羊与绵
羊、牛、中国水牛、野猪 Klf4 核苷酸序列同源性 ；
借助 SignalP4.0 在线软件（http ：//www.cbs.dtu.dk/se-
rvices/SignalP/）预测 Klf4 编码蛋白是否存在信号肽。
1.2.3 山羊 Klf4 原核表达载体构建和鉴定 选择测
序正确的 pMD18-T-Klf4 阳性质粒，用 EcoR I 和 Hind
Ⅲ分别将 pMD18-T-Klf4 与表达载体 pET-30a 进行双
酶切，胶回收 Klf4 目的片段和线性化的 pET-30a 载
体，用 T4 DNA 连接酶 16℃连接过夜。连接产物转
化 DH5α 感受态细菌，挑斑、增菌、小提质粒和双
酶切鉴定。阳性质粒送宝生物工程有限公司测序。
1.2.4 重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达 经鉴定
与测序，将阅读框正确的重组质粒 pET30a-Klf4 转化
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第2期82
至大肠杆菌 BL21 感受态细胞，涂板、挑斑并加入
含氨苄青霉素（终浓度 100 μg/mL）的 LB 培养基中，
37℃摇床振荡培养过夜，取重组菌按 1∶100 体积比
转接入含氨苄青霉素的 5 mL LB 培养基中，220 r/min，
37℃ 振荡培养至 OD600nm=0.4-0.6 时，加入终浓度
为 1 mol/L 的 IPTG，37℃诱导表达 4 h。收集 2 mL
菌液以 12 000 r/min 离心 4 min，沉淀用 80 μL PBS
（pH7. 4）悬浮，加入 5×SDS-Loading Buffer 20 μL，
混匀后置冰上 10 min，煮沸 10 min，12 000 r/min 离
心 5 min，取 10 μL 上清进行 SDS-PAGE 电泳，考马
斯亮蓝染色确定目的蛋白是否表达。
1.2.5 融合蛋白 Western blotting 检测 取上述蛋白
样品进行 SDS-PAGE 电泳。以湿转法将目的蛋白
转到 NC（硝酸纤维素）膜上，用 TBST 配制的 5%
脱脂奶粉室温封闭 2-3 h。加入鼠源 His 标签抗体
（1∶2 000）4℃孵育过夜后用 TBST 漂洗 3 次，每次
10 min。加入山羊抗鼠 IgG（1∶2 000），室温孵育 1-
1.5 h，用 TBST 漂洗 3 次，每次 10 min。洗膜后用
化学发光剂 A、B 各 250 μL 滴至保鲜膜上混匀，将
NC 膜的蛋白面朝下，覆盖在显色剂上作用 5 min，
吸取多余的显色剂，NC 膜蛋白面朝上，包裹后固定
在暗盒内，压 X 光胶片，曝光。经显影、定影，用
预染蛋白 Marker 判定目的蛋白的相对分子质量。
1.2.6 融合蛋白的纯化 将诱导表达成功的重组菌
液按 1∶100 比例转接 5 mL LB 液体培养基中，37℃
振 摇 培 养 过 夜。 活 化 的 菌 液 按 1∶200 比 例 转 接
500 mL 含氨苄青霉素的 LB 培养基中，37℃培养至
OD600nm 值达到 0.4-0.6 时，加入 IPTG，37℃继续诱
导 4 h。以 5 000 r/min 4℃离心 8 min，收集菌体沉淀
并称重。随后的蛋白纯化按照 Ni-NTA argrose 使用
说明进行。每 1 g 湿重沉淀加 5 mL 的 Buffer B 制成
悬浮液 ；置于室温下 180 r/min 摇床振摇 1 h 后超声
波破碎 10 min，以 12 000 r/min 4℃离心 20 min，取
其上清，用 0.45 μm 滤器过滤后缓慢加入含 Ni-NTA
argrose 的纯化柱中，室温下慢速摇动混匀 2 h，静
置后过柱 ；用 2 倍柱床体积 Buffer C 洗涤 3 次，用
2 倍柱床体积 Buffer E 洗脱 His-Klf4 融合蛋白。分别
收集少量裂解液上清、沉淀、过柱液、Buffer C 和
Buffer E 洗脱液进行 SDS-PAGE 分析。纯化的蛋白冷
冻干燥保存于 -80℃冰箱待用。
2 结果
2.1 PCR电泳检测
提取的山羊生殖脊总 RNA 经反转录，以 cDNA
为模板，PCR 扩增后，产物用 1% 琼脂糖凝胶电泳
进行检测。在紫外灯下观察，可发现在约 1 500 bp
处有一特异性条带（图 1），与预期结果相符。
2000
1500
bp bp
M 1
1000
750
250
500
100
M ：DNA Marker DL2000 ；1 ：RT-PCR 产物
图 1 山羊 Klf4 RT-PCR 产物凝胶图
2.2 重组质粒pMD18-T-Klf4的酶切鉴定与测序
将重组质粒 pMD18-T-Klf4 用 EcoR I 和 Hind Ⅲ
进行双酶切以及 1% 琼脂糖凝胶电泳，得到约 1 500
bp 目的条带（图 2），与预期结果相符。测序结果表
明 Klf4 基因的阅读框由 1 434 个核苷酸组成，共编
码 478 个氨基酸（图 3）。用 DNAStar 软件将该基因
核苷酸序列分别与绵羊、牛、中国水牛、野猪 Klf4
进行核苷酸序列同源性比较，结果（表 1）分别为
98.5%、98.2%、98.0% 和 94.2%。 经 过 SignalP 4.0
在线分析，山羊 Klf4 编码蛋白不存在信号肽（图 4），
全长序列可用于原核表达。
M ：DNA Marker DL2000 ；1 ：EcoR I 和 Hind Ⅲ 双酶切后的 pMD18-T-Klf4
图 2 山羊 pMD18-T-Klf4 双酶切鉴定
2000
1500
bp bp
M 1
1000
750
250
500
2013年第2期 83辛桂瑜等 ：山羊 Klf4 基因克隆、原核表达和 His-Klf4 融合蛋白纯化
2.3 重组质粒pET30a- Klf4的酶切鉴定
将 原 核 表 达 质 粒 pET30a-Klf4 进 行 EcoR I 和
Hind Ⅲ双酶切以及 1% 琼脂糖凝胶电泳鉴定，得到
目的片段约为 1 500 bp（图 5），与预期结果相符。
结果表明 pET30a-Klf4 重组质粒构建成功。
ATGGCTGTCAGCGACGCGCTGCTCCCGTCCTTCTCCACGTTCGCGTCCGGCCCGGCGGGAAGGGAGAAGACACTGCGTCCA
GCAGGTGCCCCGAATAACCGCTGGCGGGAGGAGCTCTCCCACATGAAGCGACTTCCCCCGGTGCTTCCCGGCCGCCCCTAC
GACCTGGCGGCGGCGACCGTGGCCACCGACCTGGAGAGTGGAGGAGTCGGCGCGGCTTGCGGCAGCAGCAACCCGGCTCT
TCTGCCCCGGAGGGAGACGGAGGAGTTCAATGATCTCCTGGACCTGGACTTTATCCTCTCCAACTCGCTGTCCCATCAGGAG
TCCGTGGCCGCCACGGTGTCCTCCACGGCATCAGCCTCATCCTCGTCCTCCCCGTCGAGCAGCGGTCCAGCCAGTGCGCCCT
CCACCTGCAGCTTCAGCTATCCAATCCGGGCCGGGGGCGACCCGGGCGTGGCGGCGCCGGGCGGCGCGGGCGGCGGCCTC
CTGTATGGCCGGGAGTCTGCACCCCCTCCGACAGCTCCCTTCAACCTGGCGGACATCAACGATGTGAGCCCCTCCGGCGGCT
TCGTGGCCGAGCTCCTGCGGCCCGAATTGGACCCAGTGTACATTCCGCCGCAGCAGCCGCAGCCGCCAGGTGGCGGGCTGA
TGGGCAAGTTCGTGTTGAAGGCGTCGCTGAGTGCCCCTGGCAACGAGTACGGCAGCCCGTCGGTCATCAGTGTTAGCAAAG
GCAGCCCAGACGGCAGCCACCCGGTGGTGGTGGCGCCCTACAGCGGCGGGCCGCCACGCATGTGCCCGAAGATCAAGCAG
GAGGCTGTCTCCTCGTGCACCGTCGGTCGGCCCCTAGAGGCCCACTTGGGCACTGGACCTCCTCTCAGCAATGGCCACCGG
CCACCTGCGCACGACTTTCCCTTGGGGCGGCAGCTCCCCAGCAGGACTACCCCGACCCTGGGTGCCGAGGAACTGCTGAGC
AGCCGGGACTGTCGTCCTGCCCTGCCGCTCCCCCCGGGCTTCCATCCCCACCCCGGGCCCAACTACCCTCCCTTCCTGCCCG
ACCAGATGCAGCCGCAGGTCCCACCGCTGCATTACCAAGAGCTCATGCCACCCGGTTCTTGCATGCCGGAGGAGCCCAAAC
CAAAGAGGGGAAGGCGGTCGTGGCCCCGGAAAAGGACGGCCACTCACACTTGTGACTATGCAGGCTGCGGCAAAACATAC
ACGAAGAGTTTTCATCTCAAGGCACACCTGCGCACCCACACTGGTGAGAAACCTTACCACTGTGACTGGGATGGCTGTGGG
TGGAAGTTTGCCCGCTCAGATGAACTGACCAGGCACTATCGCAAACACACTGGGCACCGCCCCTTCCAGTGCCAGAAATGC
GACCGGGCATTCTCGAGGTCGGACCACCTCGCCTTACACATGAAGAGGCACTTTTAA
ATG ：起始密码子 ；TAA ：终止密码子
图 3 山羊 Klf4 基因的测序结果
表 1 山羊 Klf4 基因核苷酸序列与其他物种的 Klf4
序列同源性比较（%）
0
0.0
0.2
C-score
Y-score
S-score
0.4
0.6
0.8
1.0
10 20 30 40 50 60 70
Position
Sc
or
e
MAVSDALLPSFSTFASGPAGREKTLRPAGAPNNRWREELSHMKRLPPVLPGRPYDLAAATVATDLESGGV
图 4 山羊 Klf4 基因信号肽分析
19329
7743
6223
4254
3747
2690
1882
1489
925
421
2000
bp
M1 M221 bp
1000
750
250
500
100
图 5 重组质粒 pET30a-Klf4 酶切鉴定
M1 ：DNA Marker DL2000 ；2，3 ：EcoR I 和 Hind Ⅲ 双酶切后的
pET30a-Klf4 ；M2 ：DNA λ -EcoT 14 digest marker
2.4 pET30a-Klf4在大肠杆菌中的诱导表达与His-
Klf4融合蛋纯化
SDS-PAG 电泳表明，重组质粒 pET30a-Klf4 在
1 2 3 4 5
1 98.5 98.2 98.0 94.2
2 1.5 98.2 98.0 98.1
3 1.9 1.8 99.8 98.8
4 2.1 2.0 0.2 64.6
5 6.1 6.1 5.4 5.7
1 ：（Capra hircus）Klf4. seq ；2 ：（Ovis aries）Klf4. seq ；3 ：（Bos taurus）Klf4.
seq ；4 ：（Bubalus bubal）Klf4. seq ；5 ：（Sus scrofa）Klf4. seq
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第2期84
大肠杆菌 BL21 中得到表达，表达的 His-Klf4 融合蛋
白分子量约为 52 kD（图 6），与理论值相符。免疫
印迹检测结果（图 7）也与 SDS-PAGE 电泳结果相一
致，在分子量约 52 kD 处有特异性条带，说明目的
蛋白确实为 His-Klf4 融合蛋白，融合基因阅读框正
确。在变性条件下，用镍离子金属螯合亲和层析法
纯化 His-Klf4 融合蛋白，经 SDS-PAGE 分析（图 8），
纯化产物呈单一条带，与上述预期结果一致，证明
95
kD
M 1 2 3 4
72
55
43
34
26
17
M ：预染蛋白 Marker ；1 ：未诱导的重组 BL21 ；2-4 ：用 1 mmol/L
IPTG 37℃诱导后的表达产物
图 6 pET30a-Klf4 表达产物 SDS-PAGE 分析
95
kD
M 1 2
72
55
43
34
26
M ：预染蛋白 Marker ；1，2 ：用 1 mmol/L IPTG 37℃诱导后的表达产物
图 7 融合蛋白 His-Klf4 的 Western blotting 检测
95
kD
M 1 2 3 4 5 6 7
72
55
43
34
26
获得了 His-Klf4 融合蛋白。
3 讨论
获得纯化的 Klf4 转录因子蛋白，必须要建立最
佳的原核表达体系，而表达载体的选择又是关键的
因素之一。在本研究中，我们之前选用 pRSET-A 作
为表达载体，但最终获得的重组蛋白表达量不高，
改用 pET-30a 后，获得了表达效率较高的重组蛋白。
这是因为 pET-30a 具有功能强大的 T7 启动子，而
T7 RNA 聚合酶具有较高的选择性与活性，大多数
的细胞资源在诱导充分时都可被用于目的基因的表
达，因此可以获得高效表达的重组蛋白［22，23］。另外，
pET-30a 载体含有的 6×His Tag 可作为纯化的标志，
M ：预染蛋白 Marker ；1 ：裂解液上清 ；2 ：过柱液 ；3，4 ：buffer C 洗涤 ；
5 ：buffer D 洗涤 ；6，7 ：buffer E 洗脱 His-Klf4 融合蛋白
图 8 His-Klf4 纯化产物 SDS-PAGE 分析
His 融合蛋白经过 Ni-NTA argrose 层析柱可以进一步
纯化。
本研究构建的重组质粒 pET30a-Klf4 在宿主菌
BL21 中经 IPTG 诱导获得高效表达。本研究表明，1
mmol/L IPTG 37℃诱导 4 h，表达效果较好。经可溶
性分析，目的蛋白以包涵体的形式存在，用 8 mol/L
尿素在变性条件下进行纯化，结果比较满意。但在
进行 His-Klf4 融合蛋白的纯化过程中，目的蛋白与
镍离子亲和层析柱结合不稳定。针对此种情况，改
变了多种条件，最终发现在裂解液中加入 10% 甘油
并把 pH 调至 7.4 后蛋白能与镍离子亲和层析柱较好
地结合，这是由于菌液进行超声裂解之后 pH 有所
下降，当 pH 在 4.5-5.3 时组氨酸残基质子化，蛋白
无法与镍离子进行结合。在目的蛋白的洗脱过程中，
目的蛋白洗脱量过低，洗脱液中含有大量杂蛋白。
在裂解液中加入吐温、Triton 等表面活性剂，减少了
杂蛋白与层析柱的非特异性结合，并且根据目的蛋
白等电点（pH8.0）改变杂蛋白洗脱液 pH 值，最终
用 pH 值 5.0 的洗脱液洗脱目的蛋白，获得了较好的
纯化效果。
总之，本研究克隆了山羊 Klf4 基因，成功构
建原核表达载体，通过诱导表达和纯化获得了山羊
His-Klf4 的融合蛋白，为山羊多能干细胞的研究奠
定了基础。
2013年第2期 85辛桂瑜等 ：山羊 Klf4 基因克隆、原核表达和 His-Klf4 融合蛋白纯化
4 结论
利用 RT-PCR 方法从山羊原始生殖嵴中成功克
隆了 Klf4 基因，构建了原核表达质粒 pET30a-Klf4，
通过原核表达技术成功获得了纯化的山羊 His-Klf4
融合蛋白。
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）