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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(8):114-118
樟子松（Pinus sylvestris L.var.mongolica）是欧洲
赤松（P. sylvestris L.）的一个地理变种，为松科松
属高大常绿乔木，具有抗寒、抗旱、耐贫瘠、适应
性强和较速生等优良特性，是我国“三北”重要的
造林主要树种之一［1， 2］。近年来，在樟子松外生菌
根真菌的筛选和鉴定中发现褐环乳牛肝菌（Suillus
收稿日期 ：2014-11-26
基金项目 ：内蒙古自治区自然科学基金项目（2012MS0509）
作者简介 ：王一超，男，硕士，研究方向 ：微生物 ；E-mail ：490999366@qq.com
通讯作者 ：姚庆智，男，博士，研究方向 ：微生物 ；E-mail ：yaoqingzhi@163.com
樟子松外生菌根中 NADP-依赖型异柠檬酸脱氢酶的
酶学性质研究
王一超 姚庆智 朱和平 陈丽霞 郭欣 杨倩倩 闫伟
（内蒙古农业大学生命科学学院，呼和浩特 010018）
摘 要 ： 对褐环乳牛肝菌 - 樟子松菌根组织、樟子松根组织及褐环乳牛肝菌纯培养菌丝的异柠檬酸脱氢酶（isocitrate
dehydrogenase，IDH）进行纯化和酶学性质鉴定。通过硫酸铵分级沉淀及葡聚糖凝胶层析纯化后的 IDH 进行 SDS-PAGE 电泳检测，
并进行 3 种来源酶的酶学性质鉴定。菌根组织、根组织及真菌纯培养菌丝 NADP-IDH 对 NADP+ 的 Km 值分别为 10.7 μmol/L、11.4
μmol/L 和 22.1 μmol/L；对异柠檬酸的 Km 值分别为 71.7 μmol/L、79.3 μmol/L 和 87.8 μmol/L。最适 pH 分别为 8.2、8.0 和 7.5，略偏碱性。
菌根 IDH和根 IDH的最适反应温度为 45℃，真菌 IDH的最适反应温度为 42℃。3种 IDH的活性依赖于不同的二价金属阳离子的存在，
Mn2+、Mg2+ 存在时酶活性最强，Ca2+、Co2+、Cu2+ 和 Zn2+ 对酶的活性有较强抑制作用。菌根真菌与樟子松形成外生菌根之后异柠檬
酸脱氢酶的蛋白含量及酶活力都得到了提高。
关键词 ： 樟子松 ；共生菌根 ；异柠檬酸脱氢酶 ；酶学性质
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.017
Enzymatic Characterization of NADP-dependent Isocitrate
Dehydrogenization in Pinus sylvestris var. mongolica Ectomycorrhiza
Wang Yichao Yao Qingzhi Zhu Heping Chen Lixia Guo Xin Yang Qianqian Yan Wei
（Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot 010018）
Abstract ： The purpose of the work is to purify the isocitrate dehydrogenase（IDH）in mycorrhizal tissue of Suillus luteus-Pinus
sylvestris var. mongolica, root tissue of P. sylvestris var. mongolica and cultured fungal mycelia of S. luteus, and identify their enzymatic
characterizations. The IDHs of 3 sources were purified by ammonium sulfate precipitation and glucan gel chromatography and tested by SDS-
PAGE electrophoresis, and enzymatic characterizations were studied. The Km for NADP
+ of mycorrhiza, root and cultured fungal mycelia were
10.7 μmol/L, 11.4 μmol/L and 22.1 μmol/L, respectively ；the Km for isocitrate were 71.7 μmol/L, 79.3 μmol/L and 87.8 μmol/L, respectively. The
optimal pH of mycorrhiza, root and cultured fungal mycelia were 8.2, 8.0 and 7.5 respectively ；they were all slightly in alkaline. The optimal
temperatures of the IDHs were 45℃ for mycorrhiza and root, and 42℃ for the fungus. The activities of 3 IDHs relied on the binding of divalent
metal ions, the maximum activities of IDHs were observed when assayed with Mn2+ or Mg2+ as metal cofactor ；however, Ca2+, Co2+, Cu2+ and Zn2+
dramatically inhibited the activity of IDHs. Conclusively, protein content and enzyme activity of mycorrhizal IDH have been increased.
Key words ： Pinus sylvestris var. mongolica ；mycorrhiza ；isocitrate dehydrogenase ；enzymatic characterization
2015,31(8) 115王一超等 ：樟子松外生菌根中 NADP-依赖型异柠檬酸脱氢酶的酶学性质研究
luteus（L.Fr）Gary，简称 ：SP.）与樟子松根系快速
形成菌根，对樟子松幼苗的早期生长有明显的促进
作用，是樟子松菌根化育苗首选的菌根真菌［3］。
外生菌根的形成及其功能改变真菌和植物的基
因表达，从而产生新的蛋白质模式和高度协调的代
谢相互作用。外生菌根改变 C 和 N 同化酶的生物合
成和分布，这些变化的性质取决于植物和真菌的共
生。这些变化影响 N-同化途径的酶（如 NADP-谷氨
酸脱氢酶）糖酵解和磷酸戊糖途径，导致菌根的氨
基酸和碳水化合物含量大幅改变。因此，了解真菌
和宿主植物的生化途径和菌根功能的规律有助于了
解外生菌根真菌共生对宿主植物代谢调节的影响。
异柠檬脱氢酶（isocitrate dehydrogenases，IDHs）
在三羧酸（TCA）循环中催化异柠檬酸氧化脱羧生
成 α-酮戊二酸可为植物对氨的同化提供碳骨架，而
NADPH 可以维系细胞内的氧化还原平衡，帮助植物
抵御氧化胁迫。目前 IDH 是国际上公认的研究蛋白
质结构与功能关系、酶的催化与调节机制、蛋白质
分子进化机制的最好模型之一［4］。根据辅酶特异性，
IDH 分为 NAD-依赖型 IDH 和 NADP-依赖型 IDH［5］。
目前为止，研究发现在生物体内 NADP-依赖型异柠
檬酸脱氢酶（NADP-IDH）有两种方式存在，其中一
种位于线粒体基质中，另一种位于细胞浆中，包括
叶绿体和过氧化物酶体［5，6］。根据亚基组成，异柠
檬酸脱氢酶可以分为两种，第一种是单体异柠檬酸
脱氢酶，这种类型的酶占极少数，分子量在 80-100
kD 之间 ；第二种是同源二聚体异柠檬酸脱氢酶，这
种类型的酶占大多数，亚基分子量在 40-50 kD 之
间［7］。大多数真核生物异柠檬酸脱氢酶属于第二种
类型，即同源二聚体［8］。目前国外关于 IDH 在裸子
植物中的表达机制鲜有报道。国内关于樟子松外生
菌根的研究大量集中于如何提高苗木质量，菌根真
菌多样性、菌根共生体的接种效应、组培苗菌根化
等研究方向，而对樟子松与外生菌根真菌共生代谢
机制还没有相关报道。本研究分别从樟子松 - 褐环
乳牛肝菌共生菌根组织、根组织及真菌纯培养菌丝
中提取纯化 IDH，并进行酶学性质研究，为深入了
解樟子松 IDH 催化机制及共生真菌对樟子松 IDH 催
化机制，功能和代谢的影响提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
供试樟子松根组织、外生菌根及褐环乳牛肝菌
均为本实验室人工无菌培养和保存。通用蛋白裂解
抽提试剂盒、BCA 法蛋白定量试剂盒、透析袋（截
留分子量 6 000-8 000）均购自上海捷瑞生物工程有
限公司，葡聚糖凝胶 Sephadex G-75 购自 Pharmacia
公司，其它试剂均为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 粗酶液的提取及纯化 将样品液氮充分研磨
后按通用蛋白裂解抽提试剂进行操作提取粗酶液，
将上述粗酶液预冷至 4℃，缓慢加入固体硫酸铵粉
末至饱和度为 25%，4℃静置 1 h 后，4 ℃ 14 000 r/min
离心 15 min，取上清液加入固体硫酸铵粉末至饱和
度为 30%，重复上述操作，每隔 5% 饱和度盐析一
次，直到终浓度至 70% 饱和度为止。所有沉淀均用
20 mmol/L PBS（pH7.4）缓冲液溶解，装入透析袋，
在 4℃，20 mmol/L PBS（pH7.4）缓冲液中透析。分
级沉淀得到的蛋白液再用葡聚糖凝胶 Sephadex G-75
再次进行纯化。SDS-PAGE 鉴定纯化后的纯度。
1.2.2 酶活性测定 蛋白浓度的测定使用上海捷瑞
生物工程有限公司生产的 BCA 法蛋白定量试剂盒，
以牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA）为标
准蛋白，参照试剂盒操作手册按 Bradford 法［9］操作。
采用分光光度法测定酶活性，IDH 的酶活测定体系
为 20 mmol/L Tris-HCl、5 mmol/L MgCl2、5 mmol/L
DL-isocitric acid trisodium 或 0.5 mmol/L DL-isocitric
acid trisodium、0.5 mmol/L NADP+。在 25℃下，使用
紫外分光光度计检测反应过程中 340 nm 处光吸收值
的变化。1 个酶活力单位（U）是指在特定条件（25℃，
其它为最适条件）下，在 1 min 内能转化 1 μmoL 底
物的酶量。
1.2.3 酶动力学参数测定 保持反应液体系中其它
组分的终浓度不变，分别取不同浓度的 NADP+ 或底
物异柠檬酸的终浓度，用紫外分光光度计，25℃下
检测 A340 的变化，根据 Lineweaver-Burk 双倒数法计
算各酶对 NADP+ 的 Km 值并计算催化常数 Kcat。
1.2.4 最适反应 pH 测定 在标准的反应体系中以
Mn2+ 为激活剂，NADP+ 为辅酶，在 20 mmol/L（pH
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.8116
6.0-10.0）的 Tris-HCl 缓冲液中，25℃下测定各酶活
性 ；每个 pH 设置 3 个平行，统计结果并依据公式
计算出酶活性，把酶活力最高点设为 100%，以 pH
值为横坐标，以相对酶活力为纵坐标作图，求出最
适 pH。
1.2.5 酶最适温度的测定及热稳定性测定 在标准
的反应体系中以 Mn2+ 为激活剂，NADP+ 为辅酶，在
25-55℃之间，以 5℃为间隔，测定 IDH 酶活力。以
温度为横坐标，以相对酶活力为纵坐标绘图，求出
酶的最适反应温度。将 IDH 在 25-60℃之间，每隔 5℃
水浴 20 min 后立即放在冰上冷却，测定酶残余活力，
以温度为横坐标，以相对残余酶活力为纵坐标绘图，
确定不同温度对酶活力的影响。
1.2.6 金 属 离 子 依 赖 性 的 测 定 25℃条件 下， 无
Mn2+ 为激活剂，维持标准的反应溶液体系中其他成
分不变，在体系中分别加入终浓度为 5 mmol/L 的
MgCl2、MnCl2、CoCl2、CaCl2、ZnSO4、CuCl2、NaCl
和 KCl 测定 IDH 活力，实验独立重复 3 次，统计结
果并依据公式计算 3 种来源的异柠檬酸脱氢酶的酶
活性。在已含有终浓度为 5 mmol/L MnCl2 的标准反
应溶液体系中再分别加入上述离子，确定各金属离
子单独存在或同时存在时对 IDH 活力的影响。
2 结果
2.1 SDS-PAGE电泳检测
经多步纯化后，SDS-PAGE 电泳（图 1）显示
蛋白均为单一条带。菌根组织和真菌纯培养菌丝中
的异柠檬酸脱氢酶亚基相对分子质量约 46 kD 左右，
根组织中大小约 45 kD 左右。菌根和根组织 IDH
纯化结果对应的硫酸铵分级沉淀梯度范围是 40%-
45%，真菌纯培养菌丝 IDH 对应的沉淀梯度为 35%-
40%。
2.2 酶动力学性质测定
由表 1 可知，当以 Mn2+ 为激活剂时，菌根组
织、 根 组 织 和 真 菌 中 IDH 对 NADP+ 的 Km 分 别 为
10.7 μmol/L、11.4 μmol/L 和 22.1 μmol/L。菌根组织
中 IDH 对 NADP+ 的亲和力分别高于根组织和真菌
中 IDH 对 NADP+ 的亲和力，由 Kcat/Km 比值得出菌
根组织中 IDH 对 NADP+ 催化速率高于根和真菌中的
IDH。
表 1 异柠檬酸脱氢酶对 NADP+ 的酶动力学参数
样品组织 Km/（μmol·L
-1） Kcat/s
-1 Kcat/Km/（M
-1·s-1）
菌根 10.7 18.6 1.73×106
根 11.4 7.2 6.32×105
真菌菌丝 22.1 8.4 3.8×105
由表 2 可知，当以 Mn2+ 为激活剂时，菌根组
织中 IDH 对异柠檬酸的亲和力分别高于根组织和真
菌中 IDH 对 NADP+ 的亲和力，菌根组织中 IDH 对
NADP+ 催化速率高于根和真菌中的 IDH。菌根组织
中的 IDH 对 NADP+ 的亲和力高于对异柠檬酸的亲
和力。
表 2 异柠檬酸脱氢酶对异柠檬酸的酶动力学参数
样品组织 Km/（μmol·L
-1） Kcat/s
-1 Kcat/Km/（M
-1·s-1）
菌根 71.7 55.4 7.73×105
根 79.3 44.2 5.57×105
真菌菌丝 87.8 37.5 4.27×105
2.3 NADP+-IDH的最适pH
在 pH6.0-10.0 的缓冲液中测定酶的活力，结
果见图 2，菌根组织、根组织及真菌纯培养菌丝
NADP+-IDH 的最适 pH 分别为 8.2、8.0 和 7.5。菌根
组织 IDH、根组织 IDH 和真菌纯培养菌丝 IDH 的最
适 pH 都略偏碱性。
2.4 NADP+-IDH的最适温度
采用标准测定体系，在 25-55℃条件下分别测
定酶活力，结果见图 3。菌根组织和根组织 IDH 的
最适反应温度为 45℃，真菌纯培养菌丝 IDH 的最适
97.4
kD
M 1 2 3
66.2
43
31
20.1
14.4
M ：Marker ；1 ：真菌纯培养菌丝 NADP-IDH ；2 ：根组织 NADP-IDH ；
3 ：菌根组织 NADP-IDH
图 1 异柠檬酸脱氢酶的 SDS-PAGE 电泳图
2015,31(8) 117王一超等 ：樟子松外生菌根中 NADP-依赖型异柠檬酸脱氢酶的酶学性质研究
反应温度为 42℃。菌根组织 IDH 在 35-50℃之间保
持 80% 以上的活力，当温度大于 50℃时，菌根组织
IDH 活力下降缓慢，而根组织和真菌 IDH 活力下降
较快。
2.6 金属离子对NADP+-IDH活性的影响
金属离子对异柠檬酸脱氢酶活性影响的结果见
表 3。3 种 IDH 均在 Mn2+ 存在时酶活性最强，其次
为 Mg2+。Ca2+、Co2+、Cu2+ 和 Zn2+ 都 能 使 IDH 活 性
损失 80%-90%，其中 Ca2+ 使真菌纯培养菌丝 IDH
完全失活。K+ 和 Na+ 也是 IDH 的强抑制剂。当反应
液中已经有 Mn2+ 存在的情况下再加入 K+ 或 Na+ 时，
NADP+-IDH 的酶活能够完全恢复，Mn2+ 还可以部分
恢复 Co2+ 和 Ca2+ 对菌根组织、根组织和真菌纯培养
菌丝 IDH 的抑制作用，但不能恢复 Cu2+、Zn2+ 对菌
根组织、根组织和真菌纯培养菌丝 IDH 活性的影响。
表 3 不同金属离子对异柠檬酸脱氢酶活性的影响
金属离子
相对活性（%）±SD
菌根 根 真菌菌丝
None 0 0 0
K+ 17±0.7 10±1.8 2±0.3
Na+ 8±0.45 3±0.1 12±0.4
Mn2+ 100±2.8 100±0.35 77±1.7
Mg2+ 95±3.8 94±2.9 100±2.4
Ca2+ 7.12±0.2 5.25±0.44 0
Co2+ 15±0.6 13±0.1 28±0.8
Cu2+ 20±0.06 28±3.5 5±0.2
Zn2+ 14±0.94 18±0.36 3±0.3
Mn2++K+ 112±2.4 105±3.5 84±1.2
Mn2++Na+ 101±0.22 84±0.1 77±0.23
Mn2++Mg2+ 80±0.07 77±2.9 79±0.33
Mn2++Ca2+ 28±0.5 19±1.36 7±1.41
Mn2++Co2+ 47±3.2 25±0.3 36±0.75
Mn2++Cu2+ 22±4.5 31±0.1 7±2.1
Mn2++Zn2+ 15±0.8 18±0.04 5±1.1
0
20
40
60
80
100
120
5.5 6 6.5 7 7.5 8 8.5 9 9.5 10 10.5
pH
ሩ䞦⍫% 㧼ṩṩⵏ㧼㧼э
图 2 pH 对异柠檬酸脱氢酶活力的影响
㧼ṩṩⵏ㧼㧼э
0
20
40
60
80
100
120
140
20 25 30 35 40 45 50 55 60ᓖćሩ䞦⍫%
图 3 温度对 3 种异柠檬酸脱氢酶活力的影响
2.5 NADP+-IDH的热稳定性
将 3 种 IDH 在 25-60℃之间处理 20 min，分别
测定酶的残余活力，结果见图 4。菌根组织、根组
织及真菌纯培养菌丝 NADP+-IDH 在 25-35℃之间活
力较为稳定，并在 35℃时具有最大残余活力，随后
酶活力显著下降。在 55℃时菌根 IDH 和根 IDH 酶
活丧失了约 80%，而真菌纯培养菌丝 IDH 酶活下降
了约 90%。在 40℃真菌纯培养菌丝 IDH 的酶活下
降了约 50%，根组织 IDH 的活力下降了 40%，而菌
根组织 IDH 只下降了 10%。在 25-40℃之间，菌根
组织 IDH 的活力要比根组织 IDH 和真菌纯培养菌丝
IDH 的活力保持的较为稳定。
-20
0
20
40
60
80
100
120
140
20 25 30 35 40 45 50 55 60 65ᓖćሩ䞦⍫%
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图 4 温度对异柠檬酸脱氢酶稳定性的影响
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.8118
3 讨论
异柠檬酸脱氢酶是起源古老的一大类酶家族，
从原核生物的真细菌（Eubacteria）、古菌（Archaea）
到真核生物的真菌、动物及植物都有分布。它是研
究蛋白质结构与功能关系、酶的催化与调节机制、
蛋白质分子进化机制的良好模型之一［10］。
在本研究中，SDS-PAGE 电泳结果与对应序列
碱基理论值大小相符，表明 3 种酶均为异柠檬酸脱
氢酶。3 种来源的异柠檬酸脱氢酶的最适 pH 分别为
8.2、8.0 和 7.5，表明樟子松在形成外生菌根后耐碱
性有所提高。最适温度分别为 45℃、45℃和 42℃。
IDH 在无离子存在下没有活性，金属离子依赖性表
明 3 种来源的 IDH 是典型的二价金属阳离子依赖型
异柠檬酸脱氢酶，Mn2+ 是异柠檬酸脱氢酶的最强激
活剂，其次为 Mg2+，因此 IDH 实际催化的底物是
异柠檬酸与 Mn2+ 或 Mg2+ 形成复合物。酶动力学参
数结果为 NADP-IDH 对 NADP+ 的 Km 值分别为 10.7
μmol/L、11.4 μmol/L 和 22.1 μmol/L，对底物异柠檬
酸 的 Km 值 分 别 为 71.7 μmol/L、79.3 μmol/L 和 87.8
μmol/L，表明菌根 IDH 对底物的亲和力都要高于根
组织 IDH 和真菌纯培养菌丝 IDH。由以上结果分析
表明，外生菌根的形成促进了异柠檬酸脱氢酶的活
性和稳定，这为在樟子松菌根系统中研究异柠檬酸
脱氢酶基因功能、表达调控机制以及异柠檬酸脱氢
酶与樟子松能量代谢之间的关系提供了有力的条件。
本实验只对樟子松外生菌根中异柠檬酸脱氢酶做了
一个初步的探讨，该酶的结构、功能、体内合成、
运转、储存情况及表达等方面还有待于进一步研究。
4 结论
樟子松与褐环乳牛肝菌形成共生菌根之后，其
菌根组织内异柠檬酸脱氢酶的蛋白含量、酶活力都
得到了提高，这可能是由于樟子松形成外生菌根之
后使其体内的异柠檬酸脱氢酶活性增强。
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）