全 文 ：·研究报告· 2011年第12期
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
收稿日期 : 2011-05-19
基金项目 : 中国博士后科学基金项目（20100471396），江苏省农业科学院博士后基金项目（005036510909），国家转基因专项（2008ZX2008005-001）
作者简介 : 束红梅，女，助理研究员，博士，研究方向 : 作物基因技术及作物生理 ; E-mail: shuhm1982@163.com
通讯作者 : 倪万潮，男，研究员，研究方向 : 作物基因技术 ; E-mail: niwanchao2002@yahoo.com.cn
转油菜素内酯合成基因 DET2 烟草对 NaCl 胁迫的反应
束红梅 郭书巧 倪万潮
（江苏省农业科学院经济作物研究所，南京 210014）
摘 要: 通过农杆菌介导法，将含有油菜素内酯合成基因 DET2 的植物表达载体 pCAMBIA2301-DET2 转入烟草，获得转基
因烟草植株。用 T1 代转基因阳性株进行耐 NaCl 试验，结果显示，NaCl 胁迫下转基因烟草、非转基因对照烟草的出苗率、幼苗鲜重、
株高及根长均随 NaCl 浓度增加而下降。但在相同 NaCl 浓度下，转基因植株鲜重、株高及根长均明显高于非转基因对照烟草，并
且转基因植株的丙二醛（MDA）含量低于非转基因植株，诱导蛋白基因 P5CS 表达高峰出现时间晚于非转基因植株。说明 DET2
的表达提高了烟草的耐 NaCl 能力。
关键词: DET2 基因 烟草 转化 NaCl 胁迫
Characterization of Transgenic Tobacco Overexpressing DET2
Gene Under NaCl Stress
Shu Hongmei Guo Shuqiao Ni Wanchao
（Institute of Industrial Crops，Jiangsu Academy of Agricultural Sciences，Nanjing 210014）
Abstract: In order to study the relationship of DET2 gene overexpression in tobacco and plant tolerance to NaCl stress，DET2 gene
was cloned and the plant expression vector pCAMBIA2301-DET2 was constructed，and then it was transformed into tobacco by Agrobactrium
tumefaciems method. The kananycin-resistant plants were detected by PCR，the results showed that DET2 gene was integrated into the tobacco
genome. Compared to the non-transgenic tobacco plants of the same stage challenged with NaCl in MS media，the transgenic plants showed
significant increased in plant height and fresh weight. In addition，transgenic tobacco plants had lower MDA accumulation，and when NaCl
concentration was less than 0.5% the expression level of P5CS gene was lower，but the NaCl concentration was higher than 1.0% the expression
level of P5CS gene was higher. The results indicated that transgenic tobacco overexpressing DET2 gene was more tolerant to NaCl stress.
Key words: DET2 gene Tobacco Transformation NaCl stress
土壤盐渍化已成为现代农业面临的主要问题之
一，土壤中盐分过多严重影响植物的生长发育 [1,2]。
因此，提高植物耐盐碱的能力已成为目前急需解决
的重要课题。
油菜素内酯是一类发现较晚的植物激素，其在
植物生长发育及耐逆性方面起着重要作用 [3-6]。作
物体内油菜素内酯水平受到合成代谢途径多个基因
的调控，其中 DET2 是油菜素内酯生物合成酶基因，
其催化菜油甾醇转化为菜油甾烷醇，是油菜素内酯
合成过程中催化较早反应的酶 [7]。研究表明，DET2
的突变将导致植物出现黄化、矮化等特征 [3]，而且
突变体中含有菜油甾烷醇的量仅为野生型植株的
10% 左右，其下游的各种 BRs 含量（6- 氧菜油甾烷醇、
茶甾酮等）均不到野生型植株的 10%[4，8-10]。而外施
油菜素内酯能恢复 DET2 基因突变所导致的突变体
表型。因此认为，DET2 是调控油菜素内酯生物合成
的关键基因。但是关于改变植物体内 DET2 基因的
表达与植物耐盐性关系的研究较少。因此，本研究
利用农杆菌介导法将 DET2 基因转入烟草，并对其
耐 NaCl 能力和抗性生理进行分析，为利用 DET2 基
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011年第12期114
因改良植物新品种提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料
将棉花油菜素内酯合成基因 DET2 插入植物
表达载体 pCAMBIA2301。利用农杆菌介导法，将
DET2 导入到烟草基因组。以非转基因株系 CK 为对
照，选择 5 个对卡那霉素抗性呈 3 1 分离、PCR 检
测为阳性的 T1 代转基因株系为研究对象。
1.2 方法
1.2.1 PCR 分析 用 CTAB 法提取烟草 DNA。根据
DET2 基因序列（GenBank 登录号 ：DQ116446）设计
引 物，P1 ：5-AAGACAAGAAAAAT GGCCTCC-3 和
P2 ：5-CGAATCAATCATATGTGGGT-3，用于 PCR 反
应 ：94℃预变性 5 min ；94℃变性 30 s，56℃复性
45 s，72℃延伸 1 min，共 35 个循环 ；再 72℃延伸
10 min。
1.2.2 转基因烟草耐 NaCl 胁迫分析 将转基因烟
草株系播种到含 100 mg/L 卡那霉素的 NaCl 为 0%、
0.5%、1.0%、1.5% 的 MS 培养基上，非转基因烟草
播种到不含卡那霉素的 MS 培养基上，在（26±1）℃，
16 h 光照 /8 h 黑暗条件下生长，观察转基因烟草的
出苗情况。1 个月后转基因烟草种苗表现出抗感分
离，将 NaCl 为 0% 的 MS 培养基上的转基因苗中的
抗卡那霉素植株和对照植株转移到 NaCl 浓度分别为
0%、0.5%、1.0% 和 1.5% 的 MS 培养基上，每个株
系 4 株重复。移栽 1 个月后测量植株的株高和鲜重，
并将根、茎、叶分开液氮速冻保存。
1.2.3 RT-PCR 分析 用 Trizol 提取烟草叶片、根系、
茎中的总 RNA。根据 DET2 基因的 cDNA 序列设计
RT-PCR 引 物，P3 ：5-TCAGCCTTTACTTCCTCC-3
和 P4 ：5-TCAGCCCTAACATTCACC-3; 根据诱导蛋
白基因 P5CS cDNA 序列设计 RT-PCR 引物，P5CS-F:
5 -T G T A G G A G T T G G T C G T C A -3 和 P 5 C S - R :
5-AGCGAAGCCACTGGT TAT-3。以 actin 基因（Gen-
Bank 登录号：EU938079）为内部参照基因（469 bp），
引 物 为 F: 5- CCTCTTAAC CCGAAGGCTAA-3，R:
5-GAAGGTTGGAAAAGGACTTC-3。
1.2.4 MDA 含量的测定 用硫代巴比妥酸比色法 [11]
测定丙二醛含量。
2 结果
2.1 转基因烟草的PCR检测
对 15 个卡那霉素抗性株系的 T0 代植株及非
转基因植株进行目的基因的 PCR 检测，结果（图
1）表明在 15 株苗中有 11 株均扩增出与目的片段大
小一致的产物，而对照的非转基因植株则无类似的
PCR 产物出现。说明外源油菜素内酯合成基因 DET2
已整合到烟草基因组中。从检测为阳性的转基因植
株中选择 5 个株系进行下一步分析。
图 1 转基因植株的 PCR 检测
2.2 NaCl胁迫下转基因烟草的出苗
将转基因株系的种子播种在含卡那霉素且 NaCl
浓度分别为 0、0.5%、1.0%、1.5% 的 MS 培养基中，
观察烟草的出苗情况（表 1）。发现随 NaCl 浓度的
增加，烟草出苗时间延长，对照植株的出苗时间在
不同 NaCl 浓度下均晚于转基因植株（该结果为 5 个
转基因 T1 株系的平均值）。在 NaCl 浓度为 0.5% 时，
转基因植株出苗时间晚了 1 d，而非转基因植株的出
苗时间则晚了 8 d，且出苗率下降明显 ；在 NaCl 浓
表 1 不同 NaCl 浓度下转基因植株的出苗和生长指标
* 为转基因抗性植株在不同 NaCl 浓度下的出苗率，即由总出苗率除以 75%; 同列不同小写字母表示在 0.05 水平差异显著
盐浓度（%）
CK 35S:DET2
出苗天数（d） 出苗率（%） 株高（cm） 根长（cm） 总鲜重（g） 出苗天数（d） 出苗率 *（%） 株高（cm） 根长（cm） 总鲜重（g）
0 7 91.11 a 11.33 a 7.17 a 1.62 a 7 92.59 a 11.15 a 7.12 a 1.69 a
0.5 15 17.22 b 5.55 b 3.16 b 0.74 b 8 71.85 b 9.86 b 5.67 b 1.27 b
1.0 —— —— 1.28 c 0.53 c 0.29 c 15 14.81 c 2.04 c 5.93 b 0.58 c
1.5 —— —— 1.12 c 0.48 c 0.19 c —— —— 1.09 d 0.56 c 0.21 d
2011年第12期 115束红梅等 ：转油菜素内酯合成基因 DET2 烟草对 NaCl 胁迫的反应
度为 1.0% 时，非转基因植株不出苗，而转基因植株
仍能出苗，但出苗率仅为 14.81% ；在 NaCl 浓度为
1.5% 时转基因植株与非转基因植株均不能出苗。
2.3 NaCl胁迫下转基因烟草的生长指标
转基因株系 T1-1—T1-5 在含卡那霉素的 MS 培
养基选择培养 1 个月后，与在普通 MS 培养基中生
长的非转基因幼苗一起转移到 NaCl 浓度分别为 0、
0.5%、1.0% 及 1.5% 的培 养 基 中。 生 长 1 个月后，
测量植株的鲜重、株高、根长（表 1）。比较转基因
烟草和非转基因烟草的鲜重和株高发现，转基因烟
草和非转基因烟草的生长均受到 NaCl 胁迫抑制，但
在相同 NaCl 浓度下转基因烟草的生长明显好于非转
基因烟草。在 NaCl 浓度为 0.5% 时转基因烟草株高、
根 长、 鲜 重 分 别 下 降 11.6%、20.4% 及 24.9%， 而
非转基因植株株高、根长、鲜重的下降幅度均超过
50% ；当 NaCl 浓度为 1.0% 时转基因烟草株高、鲜
重仅为正常处理的 18.3% 和 34.4%，但根系长度仍
为正常处理的 83.3%，而非转基因植株基本未生长 ；
当 NaCl 浓度为 1.5 % 时转基因烟草生长停滞。
2.4 NaCl胁迫下转基因烟草DET2基因的表达
对转基因植株中 DET2 基因表达分析（图 2）
发现，在不同 NaCl 胁迫下转基因植株根、茎、叶中
DET2 基因均表达，但是随着 NaCl 浓度的变化，表
达量存在差异，且在不同器官中表达量受 NaCl 影响
不同。在叶片中，DET2 的表达量随 NaCl 浓度的加
大而下降，但根、茎中 DET2 表达量受 NaCl 影响较小。
图 2 不同 NaCl 浓度下转基因植株 DET2 基因的表达
图 3 不同 NaCl 浓度下转基因植株的 MDA 含量
2.5 NaCl胁迫下转基因烟草的MDA含量和诱导蛋
白基因P5CS的表达
2.5.1 MDA 含量 从图 3 看出，随 NaCl 浓度增加，
转基因植株和非转基因对照植株的叶、茎、根 MDA
含量均升高，非转基因植株在 NaCl 浓度为 0.5% 时
迅速上升，但转基因植株在 NaCl 浓度为 1.0% 时迅
速上升。在同一 NaCl 浓度下，转基因植株的 MDA
含量低于非转基因植株。
2.5.2 诱导蛋白基因 P5CS 的表达 P5CS 是高等植
物体内控制脯氨酸积累速度的关键酶。从图 4 可以
看出，转基因植株叶片、茎、根中的 P5CS 表达量
均随 NaCl 浓度的增加而增加，但是非转基因植株
叶片、茎、根中的 P5CS 表达量在 NaCl 浓度为 0.5%
时迅速上升，但随 NaCl 浓度升高而下降。
3 讨论
DET2 基因是油菜素内酯合成途径中的重要基
因，而油菜素内酯在调控植物耐逆性方面具有重
图 4 不同 NaCl 浓度下转基因植株诱导蛋白
基因 P5CS 的表达
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011年第12期116
要作用，因此本研究通过改变植物体内油菜素内酯
DET2 基因的表达来研究其在作物耐盐性方面的功
能。盐胁迫下，植物受离子毒害的影响，植物细胞
中产生大量的 O2-、·O2、·OH、H2O2 等有毒自由基，
自由基代谢失衡，膜脂过氧化程度加重，蛋白质降
解，DNA 链破坏，导致植物生长发育受阻 [12, 13]。因
此，细胞膜脂过氧化被认为是衡量植物受盐胁迫程
度的重要指标。本试验结果表明，转 DET2 基因株
系在 NaCl 胁迫下的 MDA 含量明显低于非转基因植
株，而且非转基因植株在 NaCl 浓度为 0.5% 时 MDA
含量明显上升，但转基因植株的 MDA 含量在 NaCl
浓度为 0.5% 时上升幅度较小。说明转基因株系受盐
胁迫影响程度轻于对照植株。
逆境条件下植物通过很多细胞基质来消除和减
缓逆境胁迫，可溶性脯氨酸的积累就是这种现象，
P5CS 是植物体内脯氨酸的合成关键酶 [14,15]。试验结
果表明，转基因植株 P5CS 表达量随 NaCl 浓度的增
加而增加，但非转基因植株 P5CS 表达量呈先升高
再降低趋势。究其原因可能是非转基因对照植株受
NaCl 胁迫影响明显，当 NaCl 浓度在 0.5% 时，其脯
氨酸累积量迅速增加，受其反馈作用，P5CS 表达量
下降 ；而转基因植株耐盐能力强于对照，其 P5CS
基因的表达量在 NaCl 浓度为 0.5%-1.5% 间呈上升
趋势。
4 结论
转基因烟草株系和非转基因烟草植株的出苗、
株高、鲜重等生长指标均受盐胁迫影响，但是在同
样的盐浓度下，转基因株系受胁迫程度轻于非转基
因植株，非转基因植株在 NaCl 浓度为 1.0% 时，不
能出苗且生长停滞，转基因株系在 NaCl 浓度为 1.5%
时，不能出苗并停止生长。说明 DET2 基因的表达
提高了烟草对 NaCl 胁迫的耐受性。DET2 基因的过
量表达能改善盐胁迫下烟草的膜脂过氧化以及脯氨
酸合成基因 P5CS 的表达进而达到减轻植株受盐胁
迫程度的目的。而且，该基因的过量表达对烟草的
生长状况没有明显的不良影响。
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（责任编辑 李楠）