全 文 :·技术与方法·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第4期
RNA 介导的基因沉默是真核生物调控基因表
达和防御外源核酸入侵的重要机制。细胞中的双链
RNA(dsRNA)或具有较长发夹结构的 RNA 被双链
RNA 特异性的 RNA 酶 Dicer 剪切成 21-24 nt 的小干
扰 RNA 片段(Small interfering RNA,siRNA),这些
小 RNA 结合到以 AGO 蛋白为核心的 RNA 沉默复合
体(RNA inducing silence complex,RISC)上,通过
碱基的互补来实现对靶基因 mRNA 的剪切、抑制蛋
白质的翻译或产生 DNA 水平的修饰[1]。基于这一基
本原理,多种植物基因沉默技术相继建立起来,包
括基于“共抑制”原理的基因沉默技术、反义 RNA
收稿日期 :2013-11-08
基金项目 :国家自然科学基金项目(31070265)
作者简介 :张献贺,男,硕士研究生,研究方向 :植物生物工程 ;E-mail :xhzhang8888@sina.cn
通讯作者 :李晶,女,博士,教授,研究方向 :植物生物工程 ;E-mail :lijing@neau.edu.cn
人工 miRNA 沉默基因的研究
张献贺 孔稳稳 李勇 李晶
(东北农业大学生命利学学院 农业生物功能基因重点实验室,哈尔滨 150030)
摘 要 : 人工 miRNA(amiRNA)是一种高效的基因沉默技术,其原理是以植物内源 miRNA 的前体为基本骨架,将其茎环
结构中的 miRNA/miRNA* 序列替换为 amiRNA/amiRNA* 序列,使产生的 amiRNA 作用于目标靶基因,以实现对靶基因表达的抑制。
以拟南芥中转录因子基因 MYB28 为例,介绍了 amiRNA 的设计基本原理和构建方法。在 MYB28 基因序列的 3 端、5 端和中间部
分分别设计了 amiRNA,以拟南芥内源的 miRNA 319a 前体为骨架,以靶向于 MYB28 的 amiRNA 序列替代原有的 miRNA 319a 序列,
在拟南芥中过量表达,获得的转基因植株中 MYB28 表达水平平均降低了 86%。根据试验结果对人工 miRNA 沉默基因技术的特点
及应用前景进行了讨论。
关键词 : 人工 miRNA RNA 干扰 拟南芥 基因沉默
Study of Gene Silencing by Artificial miRNA
Zhang Xianhe Kong Wenwen Li Yong Li Jing
(Key Laboratory of Agriculatural Biological Functional Genes,College of Life Science,Northeast Agricultural University,Harbin 150030)
Abstract: Artificial miRNA(amiRNA)is an effective gene silencing technology. The basic principle of amiRNA is based on its
biogenesis mechanism. Using endogenous miRNA precursor as a basic framework, miRNA/miRNA* is then replaced by amiRNA/amiRNA*. The
produced amiRNA is expected to silence the target gene. In this paper, the basic principle and method of amiRNA construction was introduced.
AmiRNAs were designed to the target gene MYB28 as an example. Three amiRNAs respectively target to the 3 terminal region, 5 region and
middle region of MYB28 coding sequence were designed. Precursor of miRNA 319a in Arabidopsis thaliana was taken as a framework and
miRNA319a sequence was replaced by amiRNAs targeting to MYB28 gene. The expression level of MYB28 in transgenic plants decreased 86%.
Based on our experiments, the unique characteristics of amiRNA and its further applications were discussed.
Key words: Artificial miRNA RNAi Arabidopsis thaliana Gene silencing
技术、发夹 RNA 干扰(hpRNAi)技术及病毒介导
的基因沉默(VIGS)技术等[2],这几种基因沉默技
术的共同点是通过引入的外源序列使细胞内产生双
链 RNA,从而引发 RNA 介导的基因沉默(图 1)。
尽管这些方法都能实现对目的基因表达的抑制,但
它们存在一个很大的弊端,即容易引起“脱靶效应”,
因为上述方法形成的双链 RNA 经过加工后会产生连
续的多个小 RNA,这些小 RNA 有很大几率会作用
于和靶序列具有同源性的非目标序列,造成非预期
的“脱靶”现象[3]。
miRNA 是一类长度为 18-25 nt 的内源性非编码
2014年第4期 51张献贺等 :人工 miRNA 沉默基因的研究
单链小 RNA,与 siRNA 相比,其最本质的特点是
来源于一段具有茎环结构的前体 RNA,经过 DCL1
等一系列酶的剪切与加工[4-6]最终形成一个成熟的
miRNA,与沉默复合体 RISC 结合,通过碱基互补配
对来实现对靶基因 mRNA 的剪切或抑制其翻译[7-10]。
随着 miRNA 调控基因表达的研究日益深入,利
用 人 工 miRNA(Artificial miRNA,amiRNA) 沉 默
基因的技术逐步地建立起来[11-14],其原理是以植
物内源 miRNA 具有茎环结构的前体为基本骨架,
将其茎环结构中的 miRNA 序列替换为可与目标靶
基 因 mRNA 部 分 互 补 的 amiRNA 序 列, 使 产 生 的
amiRNA 作用于靶基因,以实现对靶基因表达的抑
制。由于克服了以往的 RNA 干扰技术易脱靶的弱点,
amiRNA 不仅可以高效地沉默基因,同时具有很高
的特异性。
为了验证 amiRNA 基因沉默技术的有效性并对
amiRNA 的设计进行优化,本研究以拟南芥中编码
转录因子的 MYB28 基因为目的基因,在基因编码序
列的 3 端、5 端和中间部分分别设计了 amiRNA,
以拟南芥内源的 miRNA 319a 前体为骨架,以设计
的 amiRNA 序列替代原有的 miRNA 319a 序列作为
amiRNA 的前体,转入拟南芥,成功抑制了 MYB28
基因的表达。根据试验结果对 amiRNA 的设计、表
达载体的构建及应用等进行了讨论。
1 材料与方法
1.1 材料
拟南芥(Arabidopsis thaliana)生态型为 Colum-
bia(Col-0),种子萌发后置于培养室中培养,培养
条件为温度 20℃,相对湿度 70%,光照强度 100
μmol/m2/s,光周期 16/8 h/d。大肠杆菌(Escherichia
coli)菌株为 Top10,农杆菌(Agrobacterium tumefa-
ciens)菌株为 LBA4404,植物表达载体为 pCAMBI-
A230035Su,以上实验材料均由本实验室保存。
1.2 方法
1.2.1 amiRNA 的设计 为了使 amiRNA 技术得到广
泛应用,Schwab 等[11]开发了基于网页的 amiRNA 在
线设计系统 WMD(Web microRNA designer,http ://
wmd3.weigelworld.org)。WMD 系统参照植物物体内
自然 miRNA 的主要特点[15],确定了 amiRNA 设计
的一系列原则,根据已公布的转录本和 EST 数据库,
可为不同物种的已知 mRNA、未做注释的转录本及
外源基因设计 amiRNA。通过 WMD3 系统,我们针
对 MYB28 的编码序列进行了 amiRNA 的设计。在
WMD3 系统“Designer”窗口的“Target genes”框中
输入 MYB28 的序列编号 :AT5G61420.1,选择拟南
芥的基因组数据库,设计出一系列候选的 amiRNA
序列,从中选取得分较高的、分别靶向于 MYB28 编
码序列 3 端、5 端和中间部分的 amiRNA,分别命
名为 amiRNA1,amiRNA2 和 amiRNA3(序列和分析
见 2.1)进行后续试验。
amiRNA 前体序列采用拟南芥 miRNA319a 前体
为基本骨架,miRNA319a 前体序列从 mirbase 数据库
(http ://www.mirbase.org)[16] 获 得, 将 miRNA319a/
miRNA319a* 分 别 替 换 为 amiRNA1/amiRNA1*,
amiRNA2/amiRNA2* 和 amiRNA3/amiRNA3*, 得 到
的 3 个 amiRNA 前体序列,长度均为 370 bp,由南
ޡᣁࡦ ৽ѹRNA 㤾⧟RNA ⯵∂䈡ሬⲴสഐ⊹唈 ӪᐕmiRNA
RNA PlolyII
DCL1
RDRP
RISC RISC RISCRISCRISC
RDRP
图 1 RNAi 及 amiRNA 的基本原理
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第4期52
京金斯瑞生物科技有限公司合成获得。
1.2.2 amiRNA 前 体 的 克 隆 及 植 物 表 达 载 体 的 构
建 将植物表达载体 pCAMBIA2300 参照 Nour-Eldin
等[17]的方法进行改造,使其成为具有万能接头的
植物表达载体 pCAMBIA230035Su,在 amiRNA 前体
的两侧设计一对引物 5-ggcttaaUGCAGCCCCAAACA-
CACG-3 和 5-ggtttaaUTGTCACTTAGTGGATCAAGC
ATG-3 分 别 以 人 工 合 成 的 3 个 amiRNA 前 体 DNA
为 模 板, 将 PCR 扩 增 获 得 的 amiRNA1、amiRNA2
和 amiRNA3 前体分别连入 pCAMBIA230035Su,获
得由组成型启动子 35S 驱动的过量表达 amiRNA 的
植物表达载体,35S∷amiRNA1,35S∷amiRNA2 和
35S∷amiRNA3(图 2)。
的混合土中,一段时间后取拟南芥 T1 代抗性植株
叶片,用 DNA 提取试剂盒(北京全式金生物技术
有 限 公 司 ) 提 取 基 因 组 DNA。 根 据 3 个 amiRNA
的 序 列 设 计 特 异 的 上 游 检 测 引 物, 根 据 载 体 上
的 序 列 设 计 下 游 引 物( 序 列 见 表 1 的 amiRNA1,
amiRNA2,amiRNA3),进行 PCR 检测,确定抗性
苗 中 amiRNA1,amiRNA2 和 amiRNA3 是 否 整 合 入
基因组中。
1.2.5 转基因植株中 amiRNA 表达水平的检测 用
RNA 提 取 试 剂 盒(Easy Pure Plant RNA Kit) 分 别
提取野生型和 PCR 检测为阳性的转基因植株叶片
总 RNA,采用 BioTeke supermo Ⅲ反转录试剂盒以
OligodT 为引物进行逆转录合成 cDNA,以此为模
板 扩 增 内 参 基 因 ACTIN2, 将 所 有 样 品 的 RNA 调
节至相同浓度,用于后续 RT-PCR 分析。由于成熟
miRNA 的长度仅为 20 nt 左右,无法用常规 RT-PCR
进行检测,amiRNA 表达水平的检测参照 Varkonyi-
Gasic 等[19]的 Stemloop RT-PCR 法,根据 amiRNA1,
amiRNA2 和 amiRNA3 的 序 列 分 别 设 计 了 茎 环 引
物 Stemloop RT-1,Stemloop RT-2 和 Stemloop RT-3
(序列见表 1)对总 RNA 进行逆转录,然后用引物
amiRNA1RT,amiRNA2RT 和 amiRNA3RT( 序 列 见
表 1)对成熟 amiRNA 的表达量进行 RT-PCR 分析。
1.2.6 转基因植株中 amiRNA 对靶基因 MYB28 的影
LB
Tnos CAMV35S CAMV35S amiRNA Tnos
RB
NPTII
图 2 35S :amiRNA 植物表达载体构建示意图
1.2.3 外 源 基 因 转 化 拟 南 芥 及 转 基 因 植 株 的 筛
选 利用农杆菌介导的花序浸染法[18]将构建好的 3
个植物表达载体分别转入 Col-0 生态型拟南芥中,T0
代种子播种在含有 50 mg/L 卡那霉素的 1/2MS 培养
基上,筛选抗性植株。
1.2.4 转基因植株的分子检测 将卡那霉素筛选获
得的抗性植株在四叶期时移栽到由蛭石与黑土 1∶1
表 1 PCR 检测引物序列
引物名称 上游引物序列( 5-3) 下游引物序列 ( 5-3)
amiRNA1 TATATGTAGCGAACCAAGATTAGGAT CAGGCTTTACACTTTATGCTTCC
amiRNA2 GTAGCGAGCATAGCGAGTCATT CAGGCTTTACACTTTATGCTTCC
amiRNA3 CTACAATTTCACATTTCACAGGTCG CAGGCTTTACACTTTATGCTTCC
Stemloop RT-1 GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCGGACC
Stemloop RT-2 TATTCGCACTGGATACGACCGGGCATATTCGCACTGGATACGACCGGGCA
Stemloop RT-3 GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGTGGTA
amiRNA1RT TAAAATCGTAATCTTGGTCCG GTGCAGGGTCCGAGGT
amiRNA2RT TTAAATGTCTCGCTATGCCCG GTGCAGGGTCCGAGGT
amiRNA3RT TATGTGATATTGTAGTACCAC GTGCAGGGTCCGAGGT
ACTIN2 CCATCCTCCGTCTTGACCTT ACTTGCCCATCGGGTAATTC
MYB28 CTGTCTCGTCCTCCATCC CCTCTTCATTGCGAATCTGCTC
BCAT4 ATGTATGTTGCGAAGTGCAATC GTCTCAGGAATGGGAAATGAA
MAM1 GCCGTGAGTAGTATTAGGTTTGCT TTGCTGGTAGCCATGATTTGG
CYP79F1 AAGCGGATAATCTCATAGCTTACG CCAATCTTCAACAGCAGCCTTA
RTFQ-PCR GGTCGGTCATAGCGAGACATTT AGTGGCTTGTGAGTCACGGG
2014年第4期 53张献贺等 :人工 miRNA 沉默基因的研究
响 用 RNA 提取试剂盒分别提取野生型和 PCR 阳
性拟南芥叶片总 RNA,以 OligodT 为引物合成 cDNA
的第一条链,并以此为模板来进行半定量 PCR 检测
MYB28 的表达水平,引物设计在 amiRNA 剪切位点
的两侧(引物序列见表 1)。同时对 MYB28 调控的
下游基因脂肪族芥子油苷侧链延长酶基因 BCAT4,
MAM1 和中心结构合成酶基因 CYP79F1 的表达水平
也进行了分析。
为 了 定 量 分 析 MYB28 表 达 水 平 的 变 化, 对
MYB28 进行了实时荧光定量 PCR(Realtime fluoresc-
ence quantitative PCR,RTFQ-PCR)( 引 物 见 表 1),
以 ACTIN2 为内参基因。实时荧光定量 PCR 采用比
较 CT 法(∆∆CT),以野生型拟南芥作为参照因子,
通过 2-∆∆CT 方法计算,每个基因做 3 次生物学重复,
3 次技术重复,数据取 3 次重复的平均值[20]。
2 结果
2.1 amiRNA序列的确定
通 过 WMD3 系 统, 获 得 了 靶 向 于 MYB28 基
因 序 列 的 一 系 列 amiRNA 序 列,WMD3 系 统 根 据
amiRNA 设计的多项参数标准对所设计的序列进行
了评价,我们按照这些 amiRNA 的优劣顺序选择
了 3 个分别靶向于 MYB28 序列 3 端、5 端和中间
区域的 amiRNA,以确定 amiRNA 的效率是否与结
合 位 点 有 关, 分 别 命 名 为 amiRNA1,amiRNA2 和
amiRNA3,三者与 MYB28 基因的结合及剪切位点如
图 3,3 个 amiRNA 的序列见图 4。
amiRNA2 amiRNA3 amiRNA1
1243 180510726490
图 3 三个不同的 amiRNA 与靶基因的结合部位及剪切位点
所选的 3 个 amiRNA 符合如下条件 :在 2-12 位
只有一个错配,10-11 位是剪切位点没有错配,13
位后的区域没有连续错配,在 3 端引入了一个错配。
3 个 amiRNA 前体均以 miR319a 前体为基本骨架,包
含茎环结构两端一定长度的侧翼序列,将 miR319a
分别替换为 amiRNA1,amiRNA2 和 amiRNA3,前体
的总长度为 370 bp,由南京金斯瑞生物科技有限公
司合成完整的 amiRNA 前体序列。
miR319a
amiRNA1
amiRNA2
amiRNA3
图 4 miR319a 及 amiRNA 前体茎环结构的部分序列
2.2 amiRNA前体序列的克隆与载体构建
以 人 工 合 成 的 3 个 amiRNA 前 体 DNA 为 模
板,以 amiRNA 前体两侧序列为引物扩增出目标片
段,长度在 370 bp 左右(图 5)。将 PCR 扩增获得
的 amiRNA1、amiRNA2 和 amiRNA3 前 体 分 别 连 入
pCAMBIA230035Su,获得由组成型启动子 35S 驱动
的过量表达 amiRNA 的植物表达载体。将获得的植
物表达载体转入大肠杆菌中,挑取阳性菌落进行测
序,结果显示插入序列与设计的序列一致。
500
bp M 1 2 3 4
250
M :DNA Marker DL2000 ;1 :amiRNA1 ;2 :amiRNA2 ;
3 :amiRNA3 ;4 :阴性对照
图 5 amiRNA 前体的 PCR 扩增
2.3 转基因植株的分子检测
利用农杆菌介导的花序浸染法将构建好的植物
表达载体转化野生型拟南芥,随机选取 amiRNA1、
amiRNA2、amiRNA3 转 基 因 植 株 中 具 有 卡 那 霉 素
抗性的植株进行 PCR 检测,预期的扩增长度为 700
bp,以野生型拟南芥为阴性对照,图 6 是部分转
基因植株的 PCR 检测结果,9 株转基因植株中有 7
株检测出了预期的 700 bp 左右的特异条带,说明
amiRNA 前体已经成功地整合至拟南芥的基因组中。
750
bp M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
500
M:DNA Marker DL2000;1:野生型;2-4:35S∷amiRNA1 转基因抗性植株;5-7:
35S∷amiRNA2 转基因抗性植株 ;8-10 :35S∷amiRNA3 转基因抗性植株
图 6 部分转基因植株的 PCR 检测
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第4期54
2.4 转基因植株中amiRNA表达水平的检测
为了检测转基因植株中是否具有 amiRNA(成
熟体)的过量表达,本试验对野生型和 PCR 检测为
阳性的转基因拟南芥随机取样进行了半定量 RT-PCR
分析,结果表明,3 种 amiRNA 在野生型植株均没
有表达,而在转基因植株中转入的 amiRNA 均有明
显 的 表 达。 说 明 amiRNA1,amiRNA2 和 amiRNA3
的前体转入拟南芥后可被成功地加工形成成熟的
amiRNA。
因子 MYB28 基因的表达,获得了通过商业渠道无法
得到的 myb28 缺失突变体,有利地证明了 amiRNA
介导基因沉默的有效性。根据本试验结果,目的基
因虽不能被 amiRNA 完全敲除,但表达水平比野生
型降低了 86%,这种显著的抑制作用对研究基因功
能也是有益的。T-DNA 插入获得的突变体往往可以
导致基因功能的全部丧失,但对于纯合突变体致死
的基因则很难应用,利用 amiRNA 对这些基因进行
抑制则有可能解决这个问题。
与其他 RNAi 基因沉默技术相比,amiRNA 有
其独特之处。由于 amiRNA 前体会形成一个长度适
当的茎环结构,最终只生成一个 amiRNA,对靶基
因有很好的特异性,脱靶率大大降低。此外,由于
amiRNA 与靶基因的结合位点通常有几个碱基的错
配,因而可以对多个序列相似的基因(如一个家族
的基因成员)同时产生沉默效应[21]。因而,利用
amiRNA 沉默基因不仅具有精准性,同时还具有高
效性。
由于生物内源的 miRNA 通常会结合在靶基因的
Actin
WT 35S:amiRNA1 35S:amiRNA2 35S:amiRNA3
图 7 转基因植株中 amiRNA 表达水平的分析
2.5 amiRNA对靶基因沉默效应的检测
为 了 检 测 amiRNA 对 靶 基 因 的 沉 默 效 率, 对
35S∷amiRNA1,35S∷amiRNA2 和 35S∷amiRNA3
植株中 MYB28 的表达水平进行了半定量 RT-PCR 分
析,结果(图 8)显示转基因植株中 MYB28 的表
达量与野生型相比显著降低。然后通过实时荧光定
量 PCR 进一步对 MYB28 基因进行定量分析,如图
9 所示,作用于 MYB28 基因 3 端的 35S∷amiRNA1
中 MYB28 的相对表达量平均下降了 88%,作用于
中 间 区 域 的 35S∷amiRNA3 中 MYB28 的 相 对 表 达
量 平 均 下 降 了 86%, 作 用 于 MYB28 基 因 5 端 的
35S∷amiRNA2 中 MYB28 的 相 对 表 达 量 平 均 下 降
了 84%,说明 3 个 amiRNA 在转基因拟南芥中都可
以有效地沉默靶基因 MYB28,且靶向于不同位置的
amiRNA 沉默效率没有明显区别。此外,对 MYB28
调控的下游基因进行半定量 PCR 检测,结果表明(图
8),3 种不同的转基因植株中,MYB28 调控的下游
基因表达水平均显著降低,证明 amiRNA 有效地抑
制了靶基因 MYB28 的表达,导致其调控的下游基因
表达水平也明显降低。
3 讨论
基因功能缺失突变体是研究基因功能不可缺少
的材料。本研究以拟南芥 miRNA319a 前体为基本骨
架设计了 3 个 amiRNA,均成功地抑制了拟南芥转录
Actin
CYP79F1
CAT4
MAM1
MYB28
WT 35S:amiRNA1 35S:amiRNA2 35S:amiRNA3
图 8 amiRNA 对 MYB28 及其下游基因表达的影响
WT
0
0.2
0.4
M
Y
B
28
Ⲵ
ሩ㺘
䗮䟿
0.6
0.8
1.2
1.1
35S:amiRNA1 35S:amiRNA2 35S:amiRNA3
图 9 35S∷amiRNA1,35S∷amiRNA2 和 35S∷amiRNA 3
对 MYB28 沉默效应的比较
2014年第4期 55张献贺等 :人工 miRNA 沉默基因的研究
3 端,在目的基因序列已知的情况下,amiRNA 通
常被设计在 3 端。我们的研究表明,结合于 MYB28
基因 3 端、5 端和中间位置的 amiRNA 均可有效抑
制基因的表达,且三者没有显著差别,因而 amiRNA
可能不存在位置效应。由于 amiRNA 与靶基因的结
合区域只有 20 几个碱基,且没有明显的位置效应,
因此对于一些序列不完全清楚或只有 EST 的基因,
也可以设计 amiRNA 来实现基因的沉默。
以 拟 南 芥 miRNA 前 体 为 基 本 骨 架 设 计 的
amiRNA 不仅成功地应用于拟南芥的基因沉默,目
前也已经成功地应用于番茄和烟草的基因沉默[22-25],
尽管目前还无法证明在其他植物中的有效性,但至
少说明 miRNA 的前体具有一定的保守性,在其他植
物(尤其是缺乏试验验证 miRNA 的物种)中应用基
于拟南芥 miRNA 前体的 amiRNA 具有可行性。对于
那些自身具有经试验验证的 miRNA 的植物,以自身
的 miRNA 前体为基本骨架设计 amiRNA 则为更好的
选择。
鉴于 amiRNA 的精准性、高效性及应用的广泛
性,amiRNA 介导的基因沉默已经越来越广泛地应
用于基因功能的研究或对经济植物进行遗传改良。
目前,WMD 为 amiRNA 的设计与应用提供的平台也
日趋完善,不论模式植物还是遗传背景数据不十分
完善的非模式植物,均可借助 WMD 实现 amiRNA
的设计及后续克隆和遗传转化方案的优化,这使
amiRNA 基 因 沉 默 技 术 变 得 更 加 简 便 可 行, 随 着
miRNA 前体加工机制研究的进一步深入,amiRNA
沉默技术的应用将会得到进一步拓展,必将在生物
学研究中会发挥更大的作用。
4 结论
本研究以 MYB28 为靶基因,利用 amiRNA 沉默
技术在 MYB28 基因序列的 3 端、5 端和中间部分
分别设计了 1 个 amiRNA,导入拟南芥后利用 Real-
time PCR 方法分别分析了转基因植株和野生型植株
中 MYB28 的相对表达量。结果表明作用于 MYB28
基因 3 端的 amiRNA1 转基因植株中 MYB28 的相对
表达量平均降了 88%,作用于中间区域的 amiRNA3
转 基 因 植 株 中 MYB28 的 相 对 表 达 量 平 均 下 降 了
86%,作用于 MYB28 基因 5 端的 amiRNA2 转基因
植株中 MYB28 的相对表达量平均下降了 84%,说明
3 个 amiRNA 在转基因拟南芥中都可以有效地沉默
靶基因。
参 考 文 献
[1] Meister G, Tuschl T. Mechanisms of gene silencing by double-
stranded RNA[J]. Nature, 2004, 431(7006):343-349.
[2] Eamens A, Wang MB, Smith NA, et al. RNA silencing in plants :
yesterday, today, and tomorrow[J]. Plant Physiol, 2008, 147(2):
456-468.
[3] 张晓辉 , 邹哲 , 张余洋 , 等 . 从反义 RNA 到人工 miRNA 的植物
基因沉默技术革新[J]. 自然科学进展 , 2009, 19(10):1029-
1037.
[4] Vazquez F, Legrand S, Windels D. The biosynthetic pathways and
biological scopes of plant small RNAs[J]. Trends Plant Sci, 2010,
15(6):337-345.
[5] Voinnet O. Origin, biogenesis, and activity of plant microRNAs[J].
Cell, 2009, 136(4):669-687.
[6] Naqvi AR, Sarwat M, Hasan S, et al. Biogenesis, functions and fate of
plant microRNAs[J]. Cell Physiol, 2012, 227(9):3163-3168.
[7] Mallory AC, Bouché N. MicroRNA-directed regulation :to cleave or
not to cleave[J]. Trends Plant Sci, 2008, 13(7):359-367.
[8] Bartel DP. MicroRNAs :genomics, biogenesis, mechanism, and
function[J]. Cell, 2004, 116(2):281-297.
[9] Song JJ, Smith SK, Hannon GJ, et al. Crystal structure of Argonaute
and its implications for RISC slicer activity[J]. Science, 2004,
305(5689):1434-1437.
[10] Brodersen P, Sakvarelidze-Achard L, Bruun-Rasmussen M, et
al. Widespread translational inhibition by plant miRNAs and
siRNAs[J]. Science, 2008, 320(5880):1185-1190.
[11] Schwab R, Ossowski S, RiesterM, et al. Highly specific gene
silencing by artificial microRNAs in Arabidopsis[J]. Plant Cell,
2006, 18 :1121-1133.
[12] Ossowski S, Schwab R, Weigel D. Gene silencing in plants using
artificial microRNAs and other small RNAs[J]. The Plant
Journal, 2008, 53(4):674-690.
[13] Manavella PA, Rubio-Somoza I. Engineering elements for gene
silencing :the artificial microRNAs technology[J]. Methods Mol
Biol, 2011, 732 :121-130.
[14] Park W, Zhai J, Lee JY. Highly efficient gene silencing using
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第4期56
perfect complementary artificial miRNA targeting AP1 or
heteromeric artificial miRNA targeting AP1 and CAL genes[J].
Plant Cell Rep, 2009, 28(3):469-480.
[15] Leclercq M, Diallo AB, Blanchette M. Computational prediction
of the localization of microRNAs within their pre-miRNA[J].
Nucleic Acids Res, 2013, 41(15):7200-7211.
[16] Griffiths-Jones S. miRBase:the microRNA sequence database[J].
Methods Mol Biol, 2006, 342 :129-138.
[17] Nour-Eldin HH, Hansen BG, Nørholm MHH, et al. Advancing
uracil-excision based cloning towards an ideal technique for cloning
PCR fragments[J]. Nucleic Acids Research, 2006, 34(18):
122-129.
[18] Clough SJ, Bent AF. Floral dip :a simplified method for Agrobacte-
rium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana[J]. The
Plant Journal, 1998, 16(6):735-743.
[19] Varkonyi-Gasic E, Wu R, Wood M, et al. Protocol :a highly
sensitive RT-PCR method for detection and quantification of
microRNAs[J]. Plant Methods, 2007, 3(1):12.
[20] Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data
using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T))
Method[J]. Methods, 2001, 25(4):402-408.
[21] Choi K, Park C, Lee J, et al. Arabidopsis homologs of components of
the SWR1 complex regulate flowering and plant development[J].
Development, 2007, 134(10):1931-1941.
[22] Alvarez JP, Pekker I, Goldshmidt A, et al. Endogenous and
synthetic microRNAs stimulate simultaneous, efficient, and
localized regulation of multiple targets in diverse species[J]. The
Plant Cell Online, 2006, 18(5):1134-1151.
[23] Niu QW, Lin SS, Reyes JL, et al. Expression of artificial microRNAs
in transgenic Arabidopsis thaliana confers virus resistance[J].
Nature Biotechnology, 2006, 24(11):1420-1428.
[24] Parizotto EA, Dunoyer P, Rahm N, et al. In vivo investigation of the
transcription, processing, endonucleolytic activity, and functional
relevance of the spatial distribution of a plant miRNA[J]. Genes
& Development, 2004, 18(18):2237-2242.
[25] Qu J, Ye J, Fang R. Artificial microRNA-mediated virus resistance
in plants[J]. Journal of Virology, 2007, 81(12):6690-6699.
(责任编辑 狄艳红)