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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第7期
中 间 型 高 温 放 线 菌（Thermoactinomyces
intermedius）最早由 Kurup 于 1981 年发现，属于细
菌域（Eubacteria）-厚壁菌门（Firmicutes）-芽孢杆
菌 纲（Bacilli）-芽 孢 杆 菌 目（Bacillales）-高 温 放
线 菌 科（Thermoactinomycetaceae）-高 温 放 线 菌 属
（Thermoactinomyces），嗜高温，能产生丰富的菌丝和
内生孢子［1，2］，常见于自然界的高温环境中。目前
高温放线菌属中仅有 3 个有效种，即普通高温放线
菌（Thermoactinomyces vulgaris）、中间型高温放线菌
（Thermoactinomyces intermedius）［2］和 2013 年发表的
新种 Thermoactinomyces daqus［3］，该属中的中间型
高温放线菌具有生产耐热、光稳定的亮氨酸脱氢酶
和苯丙氨酸脱氢酶的能力，这两个酶可以作为某些
收稿日期 ：2014-01-03
基金项目 ：国家科技支撑计划课题（2012BAK17B11）
作者简介 ：张明娟，女，研究方向 ：酿酒微生物 ；E-mail ：zhangming.juan@163.com
通讯作者 ：程池，男，教授，研究方向 ：微生物学 ；E-mail ：cheng100027@163.com
中间型高温放线菌特异 PCR 快速鉴别方法的应用
张明娟1  姚粟1  李辉1  刘洋1  信春晖2  许玲2  程池1
（1. 中国食品发酵工业研究院 中国工业微生物菌种保藏管理中心，北京 100015 ；2. 山东扳倒井股份有限公司，高青 256300）
摘 要 ： 根据中间型高温放线菌的 gyrB 基因设计了中间型高温放线菌的特异性引物，建立了快速筛选中间型高温放线菌菌
种的特异 PCR 方法，并将其应用于芝麻香型白酒高温大曲中的中间型高温放线菌筛选。结果表明，所设计的特异性引物对中间型
高温放线菌具有较高的特异性，可以快速鉴别中间型高温放线菌菌种，并成功从芝麻香型白酒高温大曲中快速筛选获得中间型高
温放线菌，与传统的菌种鉴定方法相比，具有高效、灵敏、便捷及成本低廉等显著优点。
关键词 ： 特异 PCR 中间型高温放线菌 快速鉴别
Establishment and Application of a Specific PCR Assay for Rapid
Identifying Thermoactinomyces intermedius
Zhang Mingjuan1 Yao Su1 Li Hui1 Liu Yang1 Xin Chunhui2 Xu Ling2 Cheng Chi1
（1. Chinese Food Fermentation Industry Research Institute Chinese industrial culture collection center, Beijing 100015 ；
2. Shandong Bandaojing Limited by Share Ltd, Gaoqing 256300）
Abstract:  This study establishs a rapid specific PCR assay to screen Thermoactinomyces intermedius strains and screens Thermoactino-
myces intermedius strains from high-temperature daqu of sesame flavor liquor by the specific PCR assay. Experimental results show that the
designed specific primers are specific for Thermoactinomyces intermedius, it is suitable for screening rapidly Thermoactinomyces intermedius
strains. The specific PCR can save a lot of time and costs compared with the traditional identifying methods.
Key words:  Specific PCR Thermoactinomyces intermedius Rapid identifying
治癌药物合成的中间体，在制药工业上有重要的应
用［4， 5］。近年来，在芝麻香型白酒酿造微生物研究
中发现中间型高温放线菌菌种为高温大曲中的优势
菌种，其代谢产物对芝麻香型白酒特殊风味物质形
成具有不可忽视的作用［6-8］，但目前尚无中间型高
温放线菌与芝麻香型白酒风味物质形成的相关研究
报道。故中间型高温放线菌在芝麻香型白酒酿造中
作用还有待进一步研究。
因此，对高温大曲等高温环境中中间型高温放
线菌菌株的筛选鉴别具有重要实践意义。然而，中
间型高温放线菌与其近缘种之间在形态学特征、生
理生化特征及 16S rRNA 基因序列方面均十分接近，
应用常规技术鉴别繁琐费时，无法满足中间型高温
2014年第7期 61张明娟等 ：中间型高温放线菌特异 PCR 快速鉴别方法的应用
放线菌的筛选及其应用研究的要求，目前仍需建立
一套准确、快速的中间型高温放线菌菌种鉴别方法，
为其应用研究提供菌种资源。
gyrB 基因即促旋酶（gyrase）的 B 亚单位基因，
作为蛋白编码基因，其所固有的遗传密码子的兼并
性使得 DNA 序列可以发生较多的变异而不改变氨
基酸序列，这就使得 gyrB 基因序列在区分和鉴定细
菌近缘种方面，比非蛋白编码基因 16S rDNA 有更
高的分辨率［9］。因此，本研究利用中间型高温放线
菌 gyrB 序列，设计了中间型高温放线菌的种特异性
PCR 引物，建立了一套快速筛选中间型高温放线菌
的特异 PCR 方法，并将其应用于芝麻香型白酒高温
大曲中间型高温放线菌的筛选，以期可快速获得大
量中间型高温放线菌菌株，旨为后续研究奠定菌种
基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株 普通高温放线菌（Thermoactinomyces
vulgaris DSM 43016T），普通高温放线菌（Thermoact-
inomyces vulgaris ACCC 41061T）， 普 通 高 温 放 线 菌
（Thermoactinomyces vulgaris ZM60）， 甘 蔗 莱 西 氏 菌
（Laceyella sacchari DSM 43356T），恶臭莱西氏菌（La-
ceyella putidus DSM44608T），Thermoactinomyces daqus
CICC 10681T，中间型高温放线菌（Thermoactinomyces
intermedius DSM 43816T）， 地 衣 芽 孢 杆 菌（Bacillus
licheniformis CICC 10101T），Laceyella tengchongensis
CCTCC AA 208050T，Laceyella sediminis CCTCC AA
2011024T，芝麻香型白酒高温大曲中分离的 25 株高
温细菌。
1.1.2 试剂 Taq DNA 聚合酶、dNTP、DL 2000 Mar-
ker、100 bp Marker 购自天为时代生物有限公司 ；
GoldView 购自北京塞百盛基因技术有限公司 ；溶菌
酶购自 Sigma 公司、蛋白酶 K 购自 Merk 公司 ；细菌
基因组 DNA 提取试剂盒购自 Tiangen 公司。
1.1.3 培养基 ISP2 培养基 ：4 g/L 葡萄糖，4 g/L 酵
母提取物，10 g/L 麦芽提取物，固体培养基则添加
20 g/L 琼脂。NA 培养基：蛋白胨 5 g/L，牛肉膏 3 g/L，
氯化钠 5 g/L，固体培养基则添加 20 g/L 琼脂。胰蛋
白酶东酵母提取物 ：胰蛋白胨大豆肉汤 30 g/L，酵
母提取物 3 g/L，固体培养基则添加 20 g/L 琼脂。
1.2 方法
1.2.1 细菌培养 T. vulgaris DSM 43016T，T. vulgaris
ACCC 41061T，L. sacchari DSM 43356T，L. putidus
DSM44608T，L. tengchongensis CCTCC AA 208050T，L.
sediminis CCTCC AA 2011024T，T. daqus CICC 10681T
均用 ISP2 培养基 55℃培养 1 d ；T. intermedius DSM
43816T 用胰蛋白酶东酵母提取物培养基 55℃培养 1
d ；B. licheniformis CICC 10101T 用 NA 培养基 37℃培
养 1 d ；T. vulgaris ZM60 和 25 株芝麻香型白酒高温
大曲中分离的高温细菌用 NA 培养基 55℃培养 1 d。
1.2.2 细菌 DNA 提取 利用细菌基因组 DNA 提取
试剂盒提取供试菌株的 DNA，具体方法参见说明书。
1.2.3 特异 PCR 方法建立
1.2.3.1 引物设计 根据 GenBank 数据库中中间型
高温放线菌 gyrB 基因序列，设计了 1 对特异性引物，
将引物用 BLAST 软件于互联网上进行比对，每条引
物在本种内相同，种间具有差异，以此保证引物的
种内通用、种间特异。引物序列见表 1，引物由北
京诺赛基因组研究中心合成。
表 1 中间型高温放线菌特异引物序列
种名 引物序列 PCR 产物大小（bp）
中间型高 78F/618R 576
温放线菌 正向引物 78F
（5-TTGTCCACGTGGTTGTCG-3）
反向引物 618R
（5-TACGTCATCCCCGGTCAG-3）
1.2.3.2 PCR 反 应 体 系 和 反 应 程 序 确 定 以 T.
intermedius DSM 43816T 的基因组 DNA 为模板，利用
设计好的种特异性引物进行 PCR 扩增。经过多轮条
件优化后，建立适宜的 PCR 反应体系和反应程序。
PCR 反应体系 ：10×Taq reaction buffer 5.0 μL，
上 下 游 引 物（10 μmol/L） 各 1.0 μL，10 μmol/L 的
dNTP 4.0 μL，2.5 U 的 Taq 酶 0.6 μL，DNA 模板 1.0
μL，dd H2O 37.4 μL。
PCR 反应程序为 ：95℃预变性 5 min ；94℃变
性 30 s，52℃复性 30 s，72℃延伸 80 s，35 个循环 ；
72℃延伸 10 min。
1.2.3.3 引物特异性验证 以 T. vulgaris DSM 43016T，
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第7期62
T. vulgaris ACCC 41061T，T. vulgaris ZM60，L. sacch-
ari DSM 43356T，L. putidus DSM44608T，T. daqus CI-
CC 10681T，T. intermedius DSM 43816T，B. lichenifor-
mis CICC 10101T，L. tengchongensis CCTCC AA 2080-
50T，L. sediminis CCTCC AA 2011024T 的基因组 DNA
为模板，利用所设计的特异引物进行 PCR 扩增。
PCR 反应体系和程序见 1.2.3.2。
1.2.4 芝麻香型白酒高温大曲中中间型高温放线菌
筛选 以 25 株芝麻香型白酒高温大曲中分离的高
温细菌为模板，利用所设计的特异引物进行扩增。
PCR 反应体系和程序见 1.4.3.2。
2 结果
2.1 特异PCR方法建立
2.1.1 PCR 反 应 体 系 和 反 应 程 序 确 定 以 T.
intermedius DSM 43816T 的基因组 DNA 为模板，利用
设计好的种特异性引物及优化后的 PCR 反应体系和
反应程序进行 PCR 扩增，扩增结果应用 1% 琼脂糖
凝胶电泳检测。结果（图 1）显示，本研究所设计
的引物和优化的 PCR 反应体系、反应程序可以从 T.
intermedius DSM 43816T 的基因组 DNA 中扩增出 576
bp 的 DNA 片段。
高温放线菌快速鉴别。
1.2.3 芝麻香型白酒高温大曲中中间型高温放线菌
筛选 以 25 株芝麻香型白酒高温大曲中分离的高温
细菌为模板，利用所设计的特异引物进行扩增。扩
增结果（图 3）显示 ：有 HHH-8、HHH-10、HHH-
13、HHH-15、HHH-20、HHH-2、QQ2、QQ3、QQ4、
QQ5、QQ6，QQ7、QQ8、QQ9、ZQ18-4 和 H-7 共
16 株菌扩增出长约 576 bp 的 DNA 片段，与预期产
物大小一致，其余 9 株菌无条带，此次共获得 16 株
中间型高温放线菌菌株。本试验仅经过 DNA 提取、
PCR 扩增、凝胶电泳检测 3 个步骤，就可从高温细
菌中筛选获得中间型高温放线菌菌株，节约了大量
时间和成本。
3 讨论
目前微生物鉴别通常是将微生物的形态特征、
生理生化特征、化学特征以及分子生物学特征进行
有机整合，得出最终结论 ［10］，这一方法是目前细菌
分类鉴定最准确可靠的方法。但是其实验通常繁琐
耗时，对于菌株筛选大量并不适合，特异性 PCR 技
术却为解决这一难题提供了捷径，特异 PCR 技术是
目前快速准确鉴定菌种的方法之一，它是根据物种
rDNA 上可变区或编码基因的特有序列设计引物，进
行物种鉴定的方法［11］。该方法因其简便快捷，已经
广泛应用于菌株筛选鉴别、食品检测等各个研究领
域，如本研究组刘勇等根据枯草芽孢杆菌、地衣芽
孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌基因组中 β-甘露聚糖酶基
因设计了 3 对种特异引物，通过特异 PCR 方法能够
有效区分枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和解淀粉芽
2000
bp
M 1 2
750
500
100
M ：DNA marker DL2000 ；1 ：T.intermedius ；2 ：Blank
图 1 PCR 产物检测
2.1.2 引物特异性验证 以参考菌株的基因组 DNA
为模板，利用特异引物 78F/618R 进行 PCR 扩增，
PCR 反应体系和程序见 1.2.3.2。扩增结果（图 2）显
示，仅有 T. intermedius DSM 43816 扩增出长约 576
bp 的清晰单一条带，与预期产物大小一致，其余 9
株细菌及阴性对照无单一条带。
因此，本试验设计的特异性引物 78F/618R 分别
对物对中间型高温放线菌具有很好的种特异性，且
所采用的 PCR 反应体系和反应程序适合进行中间型
2000
bp
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
750
500
100
1 ：T. vulgaris DSM 43016T，；2 ：T. vulgaris ACCC 41061T ；3 ：T. vulgaris
ZM60，；4 ：L. sacchari DSM 43356T ；5 ：L. putidus DSM44608T ；6 ： T. daqus
CICC 10681T；7：T. intermedius DSM 43816T，；8：B. licheniformis CICC 10101T；9：
L. tengchongensis CCTCC AA 208050T ；10 ： L. sediminis CCTCC AA 2011024T，；
11 ：Blank，M ：DNA marker DL2000
图 2 PCR 产物检测
2014年第7期 63张明娟等 ：中间型高温放线菌特异 PCR 快速鉴别方法的应用
孢杆菌［12］。商蓓等［13］根据苹果黑星病菌与其他苹
果病原真菌核糖体基因转录间隔区序列间差异设计
了 1 对特异性引物，用于苹果黑星病菌的分子检测，
实现了苹果黑星病菌的快速检测。特异 PCR 方法在
这些领域的应用使其在微生物鉴别、病原微生物检
测方面可节约大量的时间和成本。本研究所建立的
中间型高温放线菌特异 PCR 方法快速鉴别方法可从
高温大曲中快速筛选出大量中间型高温放线菌菌种，
与传统筛选鉴定方法相比，更加高效、廉价，十分
有利于后期高温大曲中的中间型高温放线菌功能性
研究，以及该菌种与芝麻香型白酒风味形成关系的
研究。
4 结论
本研究根据中间型高温放线菌 gyrB 基因设计的
特异性引物具有较好的特异性，能快速高效实现中
间型高温放线菌与其它近缘种的区分，所建立的特
异 PCR 方法适合快速筛选出中间型高温放线菌菌种，
与传统的筛选鉴定方法相比，具有高效、灵敏、便
捷及成本低廉等显著优点。
参 考 文 献
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（责任编辑 狄艳红）
2000
bp
750
500
100
2000
bp
750
500
100
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1314 15 16 1718 19 2021 22 23 24 25M
1 ：Y1.1 ；2 ：Y1.2 ；3 ：ZQ18-24 ；4 ：HHH-8 ；5 ：HHH-10 ；6 ：HHH-13 ；7 ：HHH-15 ；8 ：HHH-20 ；9 ：HHH-21 ；10 ：QQ1 ；
11 ：QQ2 ；12 ：QQ3 ；13 ：QQ4 ；14 ：QQ5 ；15 ：QQ6 ；16 ：QQ7 ；17 ：QQ8 ；18 ：QQ9 ；19 ：Q12 ；20 ：H-17 ；21 ：HH-14 ；
22 ：ZQ18-10 ；23 ：ZQ18-16 ；24 ：ZQ18-4 ；25 ：H-7 ；M ：DNA marker
图 3 25 株高温细菌特异 PCR 产物检测