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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第4期
莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）属于绿
藻门（Chlorophyceae）的鞭毛纲（Isokontae），团藻
目（Volvocales）， 衣 藻 属（Chlamydomonas）。 它 作
为模式生物被广泛用于鞭毛结构和鞭毛组装，趋光
性和生理节律［1］，配子发生和交配、光合作用原理
和叶绿体发育等分子生物学过程的研究［2，3］。莱茵
衣藻有“光合酵母”之称，其生长速率快，生长周
期短，遗传背景清楚，是理想的研究材料［4］。近年
广泛开展的微藻基因工程［4，5］、微藻生物产氢［6］、
微藻制备生物柴油［7］等多方面的研究，都是以莱茵
衣藻为基础材料进行遗传转化、外源基因表达、氢
酶活性、脂肪酸合成代谢的研究，以上研究除了要
有成熟的遗传转化系统，还要对莱茵衣藻功能基因
收稿日期 ：2012-10-12
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31000162，31070323）
作者简介 ：王潮岗，男，博士，助理研究员，研究方向 ：微藻基因工程 ；E-mail ：charlesw@szu.edu.cn
通讯作者 ：胡章立，男，教授，博士生导师，研究方向 ：水生生物学 ；E-mail ：huzl@szu.edu.cn
莱茵衣藻基因组文库的构建
王潮岗1  陈爱娜1  胡章立1  于珊珊2
（1. 深圳大学生命科学学院 深圳市海洋生物资源与生态环境重点实验室，深圳 518060 ；
2. 深圳大学师范学院附属中学，深圳 518054）
摘 要 ： 以莱茵衣藻 CC-849 为材料，提取基因组 DNA，利用 BamH Ⅰ和 Bgl Ⅱ对基因组 DNA 进行酶解，获得了可用于构
建基因组文库的 6-12 kb 的基因组片段，并浓缩至 200 ng/μL。该片段与 λDNA 载体连接，经噬菌体蛋白包装、侵染大肠杆菌 XL1-
blue 后，获得了莱茵衣藻基因组文库。该文库的滴度为 2.12×105 pfu/mL，共有转化子 4.26×104 个，插入片段的平均长度约为 9
kb，扩增后基因组文库滴度为 9.5×106 pfu/mL。
关键词 ： 莱茵衣藻 基因组文库 噬菌体 ZAP 表达载体
Construction of a Genomic DNA Library of Chlamydomonas reinhardtii
Wang Chaogang1 Chen Aina1 Hu Zhangli1 Yu Shanshan2
（1. Shenzhen Key Laboratory of Marine Biological Resources and Ecological Environment，College of Life Sciences，Shenzhen University，
Shenzhen 518060 ；2. The High School Attached to Shenzhen University Normal College，Shenzhen 518054）
Abstract:  The genomic DNA isolated from Chlamydomonas reinhardtii CC-849 was digested with BamH I and Bgl II. The 6-12 kb
genomic DNA fragments were recovered from agarose gel and concentrated to 200 ng/μL. Then they were inserted into λDNA ZAP expression
vector, packed by packaging extracts of λ phage and transformed into Escherichia coli XL1-Blue. Finally, the genomic DNA library was obtained
with an average insert size of 9 kb. Results showed that the titer of genomic library was 2.12×105 pfu/mL and contained 4.26×104 clones. After
amplified, the titer of genomic library was up to 9.5×106 pfu/mL.
Key words:  Chlamydomonas reinhardtii Genomic DNA library λDNA ZAP expression vector
进行序列分析、分离启动子序列并对其功能进行研
究。因此，构建莱茵衣藻基因组文库，并由文库中
获得目的基因的序列显得非常重要。
基因组文库是含生物全部遗传信息的重组 DNA
分子克隆的总和，由含有基因信息的随机片段所组
成，完整的基因组文库使任何基因的筛选和获得成
为可能［8］。基因组文库要尽可能包含完整的基因组
DNA 信息，它的容量与构建文库所用到的克隆载体
有很大的关系，一般包括质粒、噬菌体、黏粒，更
大容量的克隆载体则要选择人工染色体，插入片段
可长达 100-350 kb［9，10］。基因组核酸比较复杂，需
要通过合适的手段对其进行降解，主要是生物和物
理的方法，通过部分酶切法可以获得长度合适的基
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第4期86
因组片段［11］，较长的片段将尽可能保存基因信息，
尤其是上游调控序列，这对研究基因调控、发掘高
效启动子具有重要意义。在杜氏盐藻的研究中，通
过限制性内切酶 Sau3A Ⅰ对其基因组 DNA 进行部
分酶切，构建了平均长度 12.6 kb 的杜氏盐藻基因组
文库［8］。通过剪切仪随机断裂小麦基因组 DNA，成
功构建了 BAC shotgun 文库，为基因组特定区段的
研究奠定基础［12］。虽然本实验室已经获得了莱茵衣
藻的 RBCS2 启动子、Hsp70A 启动子，但它们的表达
效率还不能满足高效表达外源基因的需求，该基因
组文库的构建将为研究基因上游调控序列功能、筛
选高效启动子奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 藻株和菌株 莱茵衣藻（Chlamydomonas rein-
hardtii CC-849）由美国 Duke 大学 Chlamydomonas 遗
传中心提供，在 Tris-acetate-phosphate（TAP）培养
基中培养。
1.1.2 基因组文库构建试剂盒 ZAP Express Predig-
ested Vector Kit and ZAP Express Predigested Gigapack
Cloning Kits 购自美国 Stratagene 公司。本试验的插
入 载 体 是 以 λDNA 为 基 础 构 建 的， 其 结 构 如 图 1
所示。
lacp
CMVp
ColE 1
Neo
bio gamJA
19.2 kb 5.5 kb 4.6 kb 9.6 kb
38.9 kb
totalWL113 KH54 nin5
lacZ
MCS
*unique sites in the lambda vector Sac I*
Sal I*
Spe I*
Bam
H
I*
EcoR
I*
Xho I*
Xba I*
N
ot I*
Apa I*
Sm
a I*
K
pn I*
BstX
I
C
la I
Sca I
H
ind III*
BssH
II
Pst I
图 1 ZAP Express Vector 的结构图
1.1.3 酶及试剂 限制性内切酶 BamH Ⅰ和 Bgl Ⅱ
购自 TaKaRa 生物工程（大连）有限公司，LA Taq
聚 合 酶、T4 DNA 连 接 酶、Wide Range DNA Marker
（500-12000）、质粒提取试剂盒、PCR 反应试剂盒均
购自 TaKaRa 生物工程（大连）有限公司。DNA 提
取试剂盒购自晶美公司。引物均由上海生工生物工
程有限公司合成。酚氯仿、无水乙醇等生化试剂，
均为分析纯。
1.2 方法
1.2.1 莱茵衣藻的培养 莱茵衣藻用 Tris-acetate-
phosphate（TAP）培养基培养，培养条件为 22℃，
90 μE/m2/s 持续光照，取游动的绿色细胞作为构建基
因组文库的材料。
1.2.2 基因组 DNA 的提取 莱茵衣藻基因组 DNA
的提取采用 QIAGEN® Puregene Tissue Core Kit A。取
20 mL 对数生长期的莱茵衣藻液于 4℃条件 8 000×g
离心 3-5 min，去上清。加 990 μL 裂解液重悬，再
加 4.96 μL 蛋白酶 K 混匀，转移到 1.5 mL 的离心管，
55℃温浴 90 min，直至变褐色。冷却至室温，加
330 μL 蛋白沉淀剂，上下颠倒 150 次，冰浴 15 min，
然后 13 000×g 离心 5 min，取上清，加等体积的
酚氯仿抽提 1-3 次。加 2 倍体积无水乙醇摇匀沉淀
DNA，-20℃放置 20 min。然后 4℃条件 13 000×g
离心 5 min，去上清，加 500 μL 70% 乙醇洗涤一次，
沉淀溶于 25 μL 去离子水中，取 1-2 μL 进行 1% 琼
脂糖凝胶电泳，检测其浓度。
1.2.3 基因组 DNA 的酶切分析 取莱茵衣藻基因组
DNA， 冰 浴 10 min， 分 别 用 BamH Ⅰ、Sau3A Ⅰ、
BamH Ⅰ 和 Bgl Ⅱ 对 基 因 组 DNA 进 行 酶 切 分 析，
37℃ 16 h 酶切后取 10 μL 进行 0.8% 的琼脂糖凝胶电
泳分析，根据酶切片段在 6-12 kb 之间的分布情况
选择酶切方案。酶切体系如表 1 所示。
1.2.4 目的片段的分离、纯化及测定 通过 0.8% 琼
脂糖凝胶电泳分离酶切产物，切胶回收 6-12 kb 之
间的 DNA 片段，通过胶回收试剂盒回收 DNA 片段，
再通过真空浓缩仪浓缩至终浓度为 200 ng/μL，作为
2013年第4期 87王潮岗等 ：莱茵衣藻基因组文库的构建
文库构建的插入片段。核酸浓度及纯度的测定采用
紫外分光光度计，根据 A260/280 的比值来判断。
1.2.5 检测试剂盒的包装效率 （1）检测包装蛋白
的包装效率 ：根据文库构建的说明书，取 1 μg 野生
型 λcI857 Sam7 Lambda Contral DNA，用 Gigapack Ⅲ
Gold packaging extract 包装。加 10 μL 稀释 10-4 的包
装组分于 200 μL 的 VCS257 宿主菌中，于 37℃培养
15 min。加入 3 mL NZY 顶层培养基混匀，在 NZY
平板上铺板。用下列公式计算包装效率 ：噬菌斑的
数目 × 稀释倍数 × 包装液体积 / 总的包装微克数 ×
加入的微升数。（2）检测 ZAP Express vector 的连接
效率 ：取 0.4 μg 试剂盒提供的插入片段检测该试剂
盒的连接、包装效率，test insert 与载体 16℃连接过夜，
感染大肠杆菌 XL1-blue，计算试验的包装效率。（3）
检测 ZAP Express vector 的重组效率 ：利用载体上所
特有的蓝白筛选机制，将连接后的包装产物感染大
肠杆菌 XL1-blue，加入 X-gal 和 IPTG，进行蓝白斑
试验，检测载体的重组效率，蓝斑率应低于 1×105
pfu/μg 载体，白斑的数目应为蓝斑的 10-100 倍，这
样的重组效率才是可以信赖的。
1.2.6 莱茵衣藻基因组文库的构建 基因组文库的
构建参照产品说明书来进行，主要包括以下几个步
骤。（1）片段连接 ：取 400-750 ng 莱茵衣藻 6-12
kb 的基因组 DNA 片段，与 1 μg 的载体连接。（2）
连接产物用包装蛋白进行包装。（3）制备宿主菌并
确定合适的滴度。（4）计算包装效率和重组率。
1.2.7 莱茵衣藻基因组文库的扩增 基因组文库的
扩增也是参照产品说明书，先制备宿主菌，把噬菌
粒文库与宿主菌混合，温育、侵染后铺板，释放并
提取噬菌粒，分装后保存在 -80℃冰箱里。
2 结果
2.1 莱茵衣藻基因组DNA的提取
提取的莱茵衣藻细胞总 DNA，经 0.8% 的琼脂
糖凝胶电泳分离，结果（图 2）表明，莱茵衣藻基
因组 DNA 未被降解，可以作为构建基因组文库的材
料。利用蛋白酶 K 处理细胞后，获得的基因组 DNA
量也较大，每管可获得 50 μg 基因组 DNA。
表 1 莱茵衣藻基因组 DNA 的酶切分析
反应液成分 BamH I 组 Sau3A I 组 BamH I 和 Bgl II 组
基因组 DNA 量 1 μg 1 μg 1 μg
加入的限制性内切酶 60 μL BamH I，12 h 后补加 10 μL 0.7 μL 60 μL BamH I，12 h 后补加 10 μL BamH I 和 5 μL Bgl II
缓冲液 20 μL 20 μL 20 μL
去离子水 补至 200 μL 补至 200 μL 补至 200 μL
1 2 3 M bp
2500
1500
2000
3000
4000
5000
6000
8000
12000
M ：Wide Range DNA Marker ；1-3 ：莱茵衣藻基因组 DNA
图 2 莱茵衣藻基因组 DNA 的提取
2.2 基因组DNA的酶解分析
设定不同的酶和不同的浓度梯度，优化酶解
结果。试验结果表明，BamH Ⅰ处理组基因组 DNA
降解不充分，分布在 6-12 kb 的片段较少（图 3）；
BamH Ⅰ 和 Bgl Ⅱ 联 合 处 理 组 结 果 较 好， 使 基 因
组 DNA 降解为较多的 6-12 kb 基因组片段（图 4）。
Sau3A Ⅰ对基因组 DNA 的降解能力比较强，但基因
组 DNA 被过分降解，分布在 6-12 kb 的基因组片段
也较少（图 5）。
4000
bp M 1
5000
6000
8000
12000
M ：Wide Range DNA Marker ；1 ：用 BamH Ⅰ酶切莱茵衣藻基因组 DNA
图 3 BamH Ⅰ对基因组 DNA 的酶解
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第4期88
2.3 基因组文库片段的回收
通过琼脂糖凝胶电泳分离酶解产物，分离 6-12
kb 之间的 DNA 片段（图 6），通过胶回收试剂盒回
收 DNA 片段，再通过真空浓缩仪浓缩至终浓度为
200 ng/μL，作为文库构建的插入片段。
蛋白的包装效率为 1.35×108，达到构建文库的包装
效率要求。
2.5 文库连接效率及重组效率的分析
利用试剂盒提供的 4 kb 基因片段作为插入片段，
来检测试剂盒的连接效率与重组效率。结果表明，
该试剂盒的连接、包装效率为 1.3×105 pfu/μg 载体，
达到构建基因组文库的要求。利用蓝白斑筛选检测
ZAP Express vector 的重组效率，结果表明该试剂盒
的蓝斑率为 0.6×105 个蓝斑 /μg 载体，小于 1×105，
达到试剂盒的要求。
2.6 基因组文库的构建
纯化后的酶解基因片段与噬菌体 DNA 载体连
接，再将 4 μL 连接产物加入 20 μL 噬菌体包装蛋白
包装，用 500 μL SM buffer 终止反应。稀释后铺平板
测定滴度，得其滴度为 2.12×105 pfu/mL，蓝斑率为
0，获得的转化子数目为 4.26×104 个，表明莱茵衣
藻基因组文库已构建成功。随机提取 10 个转化子，
提取其 DNA 进行限制性内切酶切分析，分别获得了
从 6.5-12 kb 大小不等的片段，结果表明该基因组文
库插入片段的平均大小约为 9 kb。
2.7 基因组文库的扩增
用所有包装后的产物转化感受态大肠杆菌，做
10-4 稀释后铺平板测定滴度，得其滴度为 9.5×106
pfu/mL，蓝斑率为 0，表明莱茵衣藻基因组文库扩增
成功。
3 讨论
莱茵衣藻作为模式生物已经被广泛研究，遗传
背景清晰，转化方法成熟［13-15］。本实验室利用这些
技术已经成功获得可合成生物降解塑料 -PHB 的转
基因工程藻［16］，还在莱茵衣藻中成功表达了抗菌
肽［17］、绿色荧光蛋白［18］、人组织激肽释放酶等具
有经济潜力的外源基因。然而，将莱茵衣藻开发成
光生物反应器还需要表达效率更高的启动子，需要
进一步了解莱茵衣藻基因表达调控的机理。因此，
构建一个基因组文库非常重要，通过文库筛选获得
目的基因的上游调控序列，生物信息学的分析了解
其调控机理，最后通过莱茵衣藻外源基因表达系统
对其机理进行研究，为提高外源基因在莱茵衣藻中
的表达水平提供可行的策略。
M ：Wide Range DNA Marker ； 1-4 ：用 BamH Ⅰ和 Bgl Ⅱ共同酶切
莱茵衣藻基因组 DNA
500
bp
1000
2000
1500
2500
3000
4000
5000
8000
12000
M 1 2 3 4
图 4 BamH Ⅰ和 Bgl Ⅱ对基因组 DNA 的酶解
500
bp
1000
1500
2000
3000
4000
6000
8000
12000
M 1 2 3 4 M
M ：Wide Range DNA Marker ；1-4 ：用 Sau3A Ⅰ酶切莱茵衣藻基因组 DNA
图 5 Sau3A Ⅰ对基因组 DNA 的酶解
1500
bp
M 1 2
1000
2500
2000
3000
4000
5000
6000
8000
12000
M ：Wide Range DNA Marker ；1，2 ：莱茵衣藻 6-12 kb 基因组回收片段
图 6 基因组 DNA 酶解片段的回收
2.4 蛋白包装效率的检测
利用野生型噬菌体 DNA 检测包装蛋白的包装
效率，结果表明，10-4 稀释度每板有 540 个噬菌斑，
2013年第4期 89王潮岗等 ：莱茵衣藻基因组文库的构建
构建基因组文库最重要的就是获得尽可能完整
的基因序列，常见的方法就是酶解和超声波随机断
裂。徐志祥等［19，20］的研究表明 Sau3A Ⅰ对基因组
DNA 的降解效率非常高。在构建杜氏盐藻基因组文
库时，利用 Sau3A Ⅰ不完全酶解它的基因组 DNA，
获得的平均片段大小为 12.6 kb［8］。Hind Ⅲ酶解微囊
藻基因组 DNA，则显示较多的小片段，从 200 bp-
23 kb，可能因为连接载体的问题，获得的插入片段
仅为 200-700 bp，经过计算，该文库可覆盖基因组
约 10 倍［21］。本次试验，通过 3 组不同酶降解莱茵
衣藻基因组 DNA，结果显示 BamH Ⅰ和 Bgl Ⅱ的酶
解效果比较理想，各基因片段集中在 6-12 kb，而且
它们属于同尾酶，其酶切产物均可以与经 BamH I 处
理的载体连接，保证本试验获得了较高质量的基因
组文库。
4 结论
采用化学试剂和蛋白酶 K 共同裂解莱茵衣藻细
胞，释放基因组 DNA，获得了足够量的试验材料。
最后获得了高质量的莱茵衣藻基因组文库，该文库
的滴度为 2.12×105 pfu/mL，共有转化子 4.26×104 个，
符合文库筛选的需要。
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（责任编辑 马鑫）