全 文 ：遗　传 HEREDITAS(Beijing)26(5):711～ 713 , 2004 技术与方法
收稿日期:2003 06 30;修回日期:2003 10 30
基金项目:广州市科委重大科技攻关资助项目(2001-Z-006-01)[ Supported by Key S cience and Technology Fund of the Science Commission of
Guangzhou City(2001-Z-006-01)]
作者简介:徐志祥(1975 ),男 ,博士 ,研究方向:药用真菌的发酵工程和分子生物学。Tel:020-84110296;E-mail:xuzhixiang123@163.net
通讯作者:李宝健(1933 ),男 ,教授 ,博导 ,研究方向:植物遗传学。 Tel:020-84034519;E-mail:lsslbj@zsu.edu.cn
灰树花总 DNA的制备及基因组文库的构建
徐志祥 ,程　度 ,李宝健
(中山大学生命科学院 基因工程国家教育部重点实验室 ,广州 510275)
摘　要:灰树花是一种珍贵的药用真菌 , 因为多糖含量较高 , 较难获得高质量的总 DNA ,本文提出了一种制备高质
量灰树花总 DNA 及构建灰树花基因组文库的方法。 该方法制备的灰树花总 DNA , 经 Sau3A Ⅰ酶切后 , 用于构建
基因组文库 ,可得到 2×105个转化子/ 50mg , 平均插入片段为 14kb。为下一步克隆灰树花中的基因以及进行其他
分子生物学研究奠定了基础。
关键词:灰树花;DNA 提取;基因组文库
中图分类号:Q939.96　　　文献标识码:A　　　 文章编号:0253-9772(2004)05-0711-03
A Method for Preparation of Genomic DNA from
Grifola frondosa and Construction of A Genomic Library
XU Zhi-Xiang , CHENG Du , LI Bao-Jian
(Key Laboratory of Genetic Engineering of Ministry of Education
School of Life Sciences , Sun Yat-sen University , Guangzhou 510275 , China)
Abstract:Grifola frondosa , is a valuable medicinal fungus.High qual ity total genomic DNA is difficult to prepare due to
its high polysaccharide content.A method for the preparation of Grifola frondosa total genomic DNA and construction of
Grifola frondosa , genomic library is descr ibed.Genomic DNA prepared by this method is digested by Sau3A I restric-
tion enzyme.Constructed genomic l ibrary give a titer of 2×105 transformants/50mg , with a average insert size of
14kb.This has paved way for the cloning of other Grifola frondosa genes and molecular biology studies.
Key words:Gri fola frondosa;DNA preparation;genomic library
　　灰树花(Gri fola frondosa)是一种珍贵的药用
真菌 ,在日本俗称舞茸。它隶属于真菌门(Eumyco-
ta)、担子菌亚门(Basidiomycotina)、非褶菌目(A-
phyllophorales)、多孔菌科(Polyporaceae)、多孔菌属
(Polyporus)。
目前对灰树花的研究逐渐深入到分子水平。基
因组 DNA的提取是分子生物学研究的基本技术之
一。目前适用于灰树花等担子菌纲大型药用真菌
DNA提取的方法报道较少。按照曲霉等丝状真菌
DNA的提取方法提取灰树花的基因组 DNA时 ,不
但未能有效除去混在 DNA 中的多糖 , 而且所得
DNA片段小 ,构建文库时的转化率低。
为此我们建立了一种快速提取高质量基因组总
DNA的技术 ,并在此基础上探索出了一种构建高质
量基因组文库的方法 ,为以后进行有关的灰树花分
子生物学研究奠定了基础。
1　材 料和 方 法
1.1　材料与试剂
(1)限制性内切酶 、ExTaq酶 、分子质量标准购
DOI :10.16288/j.yczz.2004.05.028
自 TaKaRa公司 。
(2)T4DNA 核酸连接酶 、Agarase 购自 New
England Biolab。
(3)低熔点琼脂糖购自 Sigma公司。
(4)包装蛋白购自 Stratagen公司 。
(5)BamH Ⅰ -消化的 λ载体购自 Promega 公
司。
(6)灰树花(Gri fola frondosa)GR1为本室保存
的菌种。
1.2　菌丝培养与收集
(1)母种培养基均为 PDA 固体培养基:马铃薯
200g ,葡萄糖 20g ,琼脂 1.5g ,加水至 1000 mL ,自然
pH值 。
(2)摇瓶培养基采用 MYG培养基:麦芽糖10g ,
葡萄糖 4g ,酵母粉 4g , pH 自然 , 加水至总体积为
1000mL。
(3)收集菌丝。取菌丝生长旺盛的摇瓶 ,菌丝用
8层纱布过滤 ,并用无菌蒸馏水洗涤三次 ,略挤水
分 ,置于无菌滤纸上 ,滤纸下铺硅胶 ,风干菌丝 。
1.3　DNA提取方法
(1)收集的菌丝迅速在液氮中研成细粉。
(2)将冷冻的粉末及时转入 50 mL 的离心管
中 ,加入 15 mL 提取缓冲液(500 mmol/L NaCl;100
mmol/L tris-HCl , pH8;50 mmol/L EDTA , pH8;10
mmol/L β-巯基乙醇),轻轻旋转混匀。
(3)加入 1mL20%SDS(pH7.2),混匀 , 65℃水
浴保温 20 ～ 30min ,并轻轻混匀。
(4)加入 5mL 5mol/L KAC , 混匀后 冰浴
20min。10 000r/min ,4℃离心 10min。
(5)上清加入等体积的氯仿/异戊醇(24∶1),
10 000r/min , 4℃离心 10min 。
(6)取水相 ,加入 0.6 倍体积的异丙醇 ,轻轻混
匀 ,冰上放置 10min , 7000r/min , 4℃离心 10min ,沉
淀用 70%乙醇洗涤 ,离心后溶于无菌双蒸水中 。
(7)加入 30mL DNase-f ree RNase(10mg/mL),
37℃温育 30min。
(8)加入等体积的酚和氯仿 , 混匀 , 10 000r/
min ,4℃离心 10min。
(9)取水相 ,加入 0.6倍体积异丙醇沉淀 DNA 。
(10)将沉淀重悬于 30%乙醇中 ,4℃放置过夜 。
10 000r/min ,4℃离心 1min 。
(11)上清加乙醇至浓度为 80%, 10 000r/min ,
4℃离心 10min。沉淀用 TE溶解。
1.4　基因组文库的构建
采用上述方法所提的 50mg DNA 溶解在
500mL 的 Sau3A Ⅰ的酶切缓冲液中 ,加入 0.25 U
Sau3AⅠ ,在 30℃下酶切 30min 。0.4%低熔点琼脂
糖(1×TAE 缓冲液)电泳分离 DNA 片段 ,回收 9 ～
23kb片段 ,按照 New England BioLab 所述方法 ,用
Agarase消化低熔点琼脂糖 。基因组 DNA 片段
(3mg)与 BamH Ⅰ-消化的λ载体(5mg)用 T4DNA
连接酶在 25℃连接 4h 。取连接产物与包装蛋白混
和 ,22℃反应 4h。按分子克隆所述方法测定文库滴
度 。
1.5　文库质量的鉴定
参照萨姆布鲁克等的方法 ,从噬菌体平板上挑
5个分隔良好的噬菌斑 , 放入盛有 1mLSM 液
(50mmol/L Tris-HCl pH7.5 , 100mmol/L NaCl ,
8mmol/ L M gSO4 ,0.01%明胶)和 3mL 氯仿的灭菌
管中 ,混匀后放于 4℃过夜。取 50 ～ 100μL 噬菌体
悬液和 100μL 培养好的大肠杆菌 KW251 ,于 37℃
吸附 20min ,加入 3mL 融化的(45℃)顶层琼脂 ,迅
速铺于预热 LB平板 ,37℃倒置培养 6 ～ 8h 。平板上
加入5mL SM 溶液 。室温下轻摇 2h ,放于 4℃过夜。
次日 ,收集平板中的 SM 溶液 ,用 1mLSM 清洗平
板 ,合并收集液 ,加入氯仿(至 0.3%),轻轻振荡以
裂解细胞 ,贮于 4℃。提取噬菌体 DNA , 用 Sal Ⅰ
酶切 ,电泳。
2　结果与讨论
(1)在研究中发现 , 在高浓度钾离子存在下 ,
SDS与多糖或蛋白质结合生成复合物 ,能有效除去
多糖 ,所得 DNA 易溶解。DNA提取过程中只使用
SDS ,而不使用 CTAB ,减少了对 DNA 的损害。另
外我们用 30%乙醇溶解 DNA 后 ,于 4℃放置过夜 ,
能进一步去除多糖和其他杂质 ,提高所提取的 DNA
纯度 。本方法操作步骤少 ,不含 4℃放置过夜的时
间 ,所有操作在 3h内完成 。
(2)采用上述实验方法 ,每 100mg 灰树花湿菌
丝体能制备 10mg DNA , OD260/OD280 为 1.83 ,
OD260/OD230为 2.18。所提 DNA 能被限制酶有效
识别和切割 , 总 DNA 被 S au3A Ⅰ 、EcoR Ⅰ 及
BamH Ⅰ酶切前后的电泳结果如图 1所示。实验结
果显示 ,基因组 DNA 在几小时内能被 Sau3A Ⅰ完
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全酶切 ,而被 EcoR Ⅰ和 BamH Ⅰ完全酶切则需要
过夜甚至更长的时间 。该方法制备的 DNA 可用于
PCR 、RAPD 、Southern杂交等实验。
图 1　灰树花基因组 DNA酶切前和
酶切后的电泳结果
1:未酶切的灰树花基因组DNA;2:Sau3AⅠ酶切后的灰树花
基因组 DNA;3:EcoR Ⅰ 酶切后的灰树花基因组 DNA;
4:Bam HⅠ酶切后的灰树花基因组 DNA;5:λ-HindⅢ 消化的
标记。酶切条件:酶量为 0.4 U/mg DNA , 37℃反应 1h。
Fig.1　Agarose gel electrophoreisis
of Grifola frondos DNA sample before
and after restriction digestion
Lane 1 is DNA sample from Grifola frondosa without digest ion;
Lane 2 is DNA sample from Grifola frondosa partially digested
with Sau3AⅠ ;Lane3 is loaded with DNA sample from Grifola
frondosa after partial digestion with EcoR Ⅰ ;Lane 4 is DNA
sample fromGrifola frondosa after partial digestion with BamH
Ⅰ ;Lane 5 isλ-HindⅢ marker;Digest ion condition :0.4Units
enzyme/mg DNA , for 60min at 37℃.
(3)高分子质量的 DNA 对构建基因组文库尤
为重要 。如果小片段多 ,会导致 DNA 转化噬菌体
的效率低。本方法所提的灰树花大片段 DNA 经
Sau3A Ⅰ部分酶切 ,低熔点琼脂糖电泳回收 9 ～
23kb的片段 ,回收的 DNA片段与 BamH Ⅰ-消化的
λ载体连接 ,能获得 2×105 个转化子。丝状真菌的
基因组为 107 ～ 108bp ,当重组转化子为 2×103 ～ 2×
10
4 时 ,可保证 99%的基因存在于基因组文库中 。
从文库中随机挑取重组克隆 ,提取λDNA ,用 Sal Ⅰ
酶切 ,可切出 20kb 、14kb和 9kb 3个片段(如图 2所
示),其中 20kb和 9kb为λ载体的左右臂 ,插入片段
为 14kb ,与预期相符 ,说明文库的质量较高。
图 2　转化子 DNA的 Sal Ⅰ酶切电泳结果
1:Sal Ⅰ酶切后的重组子λDNA;2:转化子λDNA;
3:λ-HindⅢ 消化的标记。
Fig.2　Agarose gel electrophoreisis of
recombinant phage DNA sample
before and after Sal Ⅰ digestion.
Lane1 is DNA sample from recombinant phages digested
with Sal Ⅰ ;Lane2 isDNA sample f rom recombinant phages
without digest ion;Lane3 isλ-Hind Ⅲ marker.
运用本实验方法提取了高质量的灰树花基因组
DNA ,利用其构建了灰树花基因组文库 ,为下一步
克隆灰树花中的基因以及进行其他分子生物学研究
奠定了基础 。
参 考 文 献(References):
[ 1] 　Xu Jing-t ang.Chinese Medicinal Mycology .Beijing:Union Press
of Beijing Medical Universi ty and Peking Union Medical College ,
1997 , 707～ 717.
徐锦堂.中国药用真菌学.北京:北京医科大学 、中国协和医
科大学联合出版社 , 1997 , 707～ 717.
[ 2] 　Sambrook J , Fri tsch E F.Maniatis T.(Translated by J IN Dong-
Yan , LI M eng-Feng et a l.).Molecular Cloning:A Laboratory
Manual(2rd edition).Beijing:Science Press , 1989.
J·萨姆布鲁克 , E·F·弗里奇 , T·曼尼阿蒂斯(金冬雁 ,黎孟枫等
译).分子克隆实验指南(第二版).北京:科学出版社 , 1989.
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[ 4] 　Donglu Zhang et al.A method for the large scale isolat ion of high
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713　5 期　　　　　　　　　　　　　　徐志祥等:灰树花总 DNA 的制备及基因组文库的构建