全 文 ：农业环境科学学报 2011,30(10):1972-1977
Journal of Agro-Environment Science
摘 要：本文研究了不同 pH（5.0、7.0和 9.0）和 F-浓度（0.1、1、10、50、100、200 mmol·L-1）对莱茵衣藻和蛋白核小球藻的胞外碳酸酐
酶活性、PSⅡ实际光合效率 ΦPSⅡ和叶绿素 a合成量的共同影响。结果表明：在低于 1 mmol·L-1的 F-作用下，两种微藻的生理和生长
指标主要受 pH影响；酸性条件下，两种微藻胞外碳酸酐酶活性显著低于中性和碱性条件时，ΦPSⅡ随 pH升高而增大，叶绿素 a合成
量随 pH升高而增加。在高于 1 mmol·L-1的 F-作用下，两种微藻的生理及生长指标受 F-和 pH共同影响，且 F-的作用大于 pH的作
用，胞外碳酸酐酶活性随着 F-浓度升高先增加后降低，同时随着 pH下降而降低；ΦPSⅡ和叶绿素 a合成量则随着 F-浓度升高和 pH
下降而迅速下降。胞外碳酸酐酶活性、ΦPSⅡ和叶绿素 a合成量都能够作为指示微藻受氟胁迫的指标，以微藻为材料除去自然界氟超
标水体中的超标 F-，理论上是可行的。
关键词：pH；氟；莱茵衣藻；蛋白核小球藻；胞外碳酸酐酶；光合效率
中图分类号：X172 文献标志码：A 文章编号：1672- 2043(2011)10- 1972- 06
pH与氟对莱茵衣藻和蛋白核小球藻
胞外碳酸酐酶活性及光合效率的影响
吴运东 1，吴沿友 1，2*，李 潜 3，赵 宽 1
（1.现代农业装备与技术省部共建教育部重点实验室/江苏省重点实验室 江苏大学农业工程研究院，江苏 镇江 212013；2.中国科
学院地球化学研究所环境地球化学国家重点实验室，贵阳 550002；3.江苏大学环境学院，江苏 镇江 212013）
Effect of pH and Fluoride on Extracelluar Carbonic Anhydrase Activity and Photosynthetic Efficiency of
Chlamydomonas Reinhardtii and Chlorella Pyrenoidosa
WU Yun-dong1, WU Yan-you1, 2*, LI Qian3, ZHAO Kuan1
（1.Key Laboratory of Modern Agricultural Equipment and Technology, Ministry of Education & Jiangsu Province, Institute of Agricultural En－
gineering, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China; 2.State Key Laboratory of Environmental Geochemistry, Institute of Geochemistry,
Chinese Academy of Sciences, Guiyang 550002, China; 3.School of Environment, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China）
Abstract：Chlamydomonas reinhardtii and Chlorella pyrenoidosa were cultured in SE media at three pH levels（5.0, 7.0, 9.0）with added fluo－
ride（NaF）of six concentrations（0.1, 1, 10, 50, 100 and 200 mmol·L-1）, and extracelluar carbonic anhydrase activity, photosynthetic efficiency
and chlorophyll-a content of the two microalgaes were determined. The results indicated that physiologic activity and growth factors of the two
microalgaes were mainly affected by pH rather than fluoride under the combinion of pH and less than 1 mmol·L-1 fluoride. Extracelluar car－
bonic anhydrase activity of the two microalgaes was significantly lower under acidic media than under neutral and alkaline media. ΦPSⅡ and
chlorophyll-a synthesis of the two microalgaes decrease with pH descending. Physiologic activity and growth factors were significantly affected
by the combination of pH and more than 1mmol·L-1 fluoride concentration. Extracelluar carbonic anhydrase activity first increased and then
decreased until disappear with fluoride concentration increasing. The ΦPSⅡ and chlorophyll-a synthesis decreased with pH descending. Extra－
celluar carbonic anhydrase activity, ΦPSⅡ and chlorophyll-a synthesis can indicate whether microalgaes suffer from adversity. Physiologic ac－
tivity and growth factors of Chlamydomonas reinhardtii and Chlorella pyrenoidosa are better under alkaline environment than under neutral and
acidic environment. The results also indicated it′s theoretically feasible to remove excessive fluoride in rich-fluoride water using microalgaes.
Keywords：pH; fluoride; Chlamydomonas reinhardtii; Chlorella pyrenoidosa; extracellular carbonic anhydrase; photosynthetic efficiency
收稿日期：2011－04－04
基金项目：国家自然科学基金（40973060）
作者简介：吴运东（1984—），男，江苏徐州人，硕士研究生，研究方向为微藻生理生态学。E-mail：wu41831@163.com
*通讯作者：吴沿友 E-mail：yanyouwu@ujs.edu.cn
第 30卷第 10期 农 业 环 境 科 学 学 报
氟是人体健康必需的微量元素之一，氟缺乏对
人体健康不利，然而过多的氟会导致氟中毒，症状是
氟斑牙和氟骨病 [1]。氟是环境中广泛存在的天然元
素，同时会因工农业生产和使用造成环境的污染[2]。
由于氟离子（F-）呈游离态，迁移性强，在自然水体中
F-浓度往往很低，但是氟具有生物富集的特征，而且
摄入后很难排出，长期饮用 F-超标的水就会对人体
产生毒害。医学研究表明，氟对人体健康的影响是长
期的，尽管有时并没有表现出氟斑牙和氟骨病等典
型症状，但机体已发生器官或组织的病变，导致内分
泌失调、器官损伤、免疫力低下等严重后果[3]，因此除
去水体中浓度虽低但超标的 F-是十分必要的。目前，
工业污水除氟主要是 Ca2+沉淀法，虽然该法能降低工
业废水中较高浓度的 F-，但是出水仍难以达到国家
排放标准，同时产生的大量碱性污泥也会导致二次
污染[4]。由于CaF2溶解度为 40 mg·L-1，若采用 Ca2+沉
淀法去除自然水体中 F-，非但不能除去低浓度的 F-，
反而会使水质恶化，使污染加剧。利用微藻吸附去除
污染水体中重金属离子具有成本低、易培养、工艺简
单等特点，有很好的应用前景，利用微藻吸附 F-的研
究目前尚未见报道。
莱茵衣藻和蛋白核小球藻是常见的微藻，具有
光合能力强、生长速率快、世代周期短等特点，且对
元素具有吸收净化作用，对环境保护很重要。F-超标
水体的 pH往往不稳定，已有研究证明 F-对微藻的生
长会产生影响[5]，同时 pH也是微藻生长繁殖的重要
影响因素之一 [6]，pH对微藻光合作用有显著影响 [7]，
生长在水体中的微藻受到 pH和 F-的共同作用。微藻
的胞外碳酸酐酶通过催化 CO2的可逆水合反应，促
进水环境中的无机碳向微藻细胞内流动[8]，为光合作
用固定无机碳源源不断地提供原料，胞外碳酸酐
酶还与微藻的抗逆性有关，在逆境下其活性会升高。
叶绿素荧光参数中的光合效率 ΦPSⅡ反映微藻将光能
转化成不稳定的化学能的能力[9]，是光合作用的限速
步骤。
目前，有关 pH影响重金属对微藻毒性影响研究
是国内外研究者感兴趣的内容[10-11]，而 pH和 F-对微
藻的生理作用的交互影响尚未见报道。本文以莱茵
衣藻和蛋白核小球藻为实验材料，研究 pH和 F-对
这两种微藻胞外碳酸酐酶活性和 PSⅡ实际光合效
率的交互作用，初步探讨两种因子对微藻抗逆性和
光合效率的影响，并为微藻除氟的可行性提供理论
依据。
1 材料与方法
1.1 藻种与培养基
供试莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）和蛋
白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）由中国科学院武汉
水生生物研究所淡水藻种库提供。使用 SE培养基[12]
培养，培养温度约为 25 ℃；在光强 2 500 lx、光暗周期
比 14 h∶10 h条件下，于三角瓶中培养，每天人工摇瓶
2～3次。
1.2 培养条件和方法
将处于对数生长期的藻液离心浓缩（3 000 r·min-1，
5 min），接种于调好 pH并灭菌的培养基中，接种后的
吸光值约为 0.5A。按需要用 HCl或 NaOH溶液调节
培养基 pH值为 5.0、7.0、9.0。添加 NaF使培养基中 F-
终浓度分别为 0.1、1、10、50、100、200 mmol·L-1。培养
期为 10 d，每组处理设置 3个平行样。
1.3 胞外碳酸酐酶活性的测定
使用锑微电极开放电路法[13]进行测定。培养结束
后，离心收集藻细胞（5 000 r·min-1，5 min），用巴比妥
缓冲液（pH=8.3，20 mmol·L-1）冲洗后再如上离心一
次，加入巴比妥缓冲液悬浮细胞，细胞悬浮液终体积
为 3 mL；于 0℃迅速加入 2 mL 0 ℃饱和 CO2蒸馏水，
记录反应体系中变化 1个 pH所需时间 t，同时记录
对照体系变化 1 个 pH 所需时间 t0。碳酸酐酶活性
（EU）的计算公式为：EU=（t－t0）/t0。同时用分光光度法
测定反应体系中叶绿素 a的含量[14]。碳酸酐酶活性单
位（以叶绿素 a计）为 EU·μg-1，每个数据测定 3次。
1.4 PSⅡ实际光合效率 ΦPSⅡ的测定
在培养的第 9 d测定 ΦPSⅡ。将待测定的微藻暗处
理 20 min，使用便携式 IMAGING—PAM调制式荧光
仪测定[15]。
1.5 叶绿素 a合成量的计算
在接种和培养结束时分别测定叶绿素 a含量[16]
初始值 C0和叶绿素 a含量终值 C，合成量为△Cchl-a=
（C/C0－1）%。
2 结果与分析
2.1 pH对莱茵衣藻和蛋白核小球藻胞外碳酸酐酶活
性及ΦPSⅡ的影响
以未添加 F-但调整了 pH的对照组研究 pH对莱
茵衣藻和蛋白核小球藻胞外碳酸酐酶活性及 ΦPSⅡ的
影响。
由图 1可见，莱茵衣藻和蛋白核小球藻的碳酸酐
1973
2011年 10月
酶活性对 pH的响应现象相同，表现为：在 pH=5培养
条件下低于 pH=7和 9时，pH=7和 9相比则差异较
小。pH影响水体中可溶性无机碳（DIC）的存在形式。
Janette 等 [16]认为，在酸性 pH 条件下，培养液中 DIC
主要以 CO2形式存在，自由穿过细胞膜的 CO2能够满
足光合作用需求，因此莱茵衣藻在酸性 pH时胞外碳
酸酐酶活性较低。碳酸酐酶是一种诱导酶，环境中
CO2含量过低会诱导该酶的合成以加速转运 CO2至
细胞内。在碱性 pH条件下，DIC主要以 HCO-3形式存
在，需要依赖胞外碳酸酐酶催化 HCO-3转化成 CO2进
入细胞，以满足光合作用的需求，从而莱茵衣藻的胞
外碳酸酐酶活性升高。从本研究的结果（图 1）可以看
到，蛋白核小球藻和莱茵衣藻的碳酸酐酶活性在 pH=
5时显著低于 pH=7和 9时，莱茵衣藻胞外碳酸酐酶
活性受 pH的影响情况与 Janette等的结论相符。同时
发现蛋白核小球藻也具有较高的胞外碳酸酐酶活性，
且受 pH的影响与莱茵衣藻类似。
由图 2 可见，pH=5 时莱茵衣藻 ΦPSⅡ显著低于
pH=7和 9时，在 pH=7和 9差异较小；蛋白核小球藻
ΦPSⅡ在 pH=9时略高于 pH=7和 5，但 3种 pH条件下
没有明显差异。
pH=5时，莱茵衣藻和蛋白核小球藻的 ΦPSⅡ值低，
表明实际光合效率低；在 pH=7和 9时，两种微藻
ΦPSⅡ值略高于 pH=5，表明中性和碱性 pH下微藻具有
比酸性 pH时更高的光合效率。
2.2 pH和 F-对莱茵衣藻和蛋白核小球藻胞外碳酸酐
酶活性的影响
pH和 F-对莱茵衣藻和蛋白核小球藻胞外碳酸酐
酶活性的影响如图 3所示。两种微藻在同一 pH且
F-<1 mmol·L-1培养基中培养时，其胞外碳酸酐酶活性
变化甚微，而在相同 F-浓度（0.1 mmol·L-1和 1 mmol·
L-1）但不同 pH条件时，它们各自的胞外碳酸酐酶活
性随 pH 下降而降低。由此可见，当 F-浓度为 0.1
mmol·L-1和 1 mmol·L-1时，微藻胞外碳酸酐酶活性主
要受 pH变化的影响。当 F->1 mmol·L-1时，两种微藻
的胞外碳酸酐酶活性受 F-浓度和 pH的共同影响，但
受 F-浓度的影响更大。当 pH一定时，胞外碳酸酐酶
活性随着 F-浓度的增加而逐渐升高，到一定峰值后活
吴运东等：pH与氟对莱茵衣藻和蛋白核小球藻胞外碳酸酐酶活性及光合效率的影响1974
第 30卷第 10期 农 业 环 境 科 学 学 报
性降低直至检测不出。一定范围内，较高浓度的 F-能
够显著提高莱茵衣藻和蛋白核小球藻胞外碳酸酐酶
的活性。在不同 pH条件下，莱茵衣藻和蛋白核小球
藻表达出最高碳酸酐酶活性时的 F-浓度不同：pH分
别为 5、7、9时，莱茵衣藻分别在 F-浓度为 10、50、100
mmol·L-1时有最高的胞外碳酸酐酶活性；蛋白核小球
藻在 F-浓度为 50、100、100 mmol·L-1时有最高的胞外
碳酸酐酶活性。
2.3 pH和 F-对莱茵衣藻和蛋白核小球藻ΦPSⅡ的影响
pH和 F-对莱茵衣藻和蛋白核小球藻 ΦPSⅡ的影
响如图 4所示，在 F-≤10 mmol·L-1范围内，在同一
pH但 F-浓度不相同时，两种微藻的 ΦPSⅡ变化较小，
而当 F-浓度相同但 pH值不同时，两种微藻的 ΦPSⅡ随
pH降低而下降。在 F->10 mmol·L-1范围内，两种微藻
的 ΦPSⅡ都随着 F-浓度增加而显著（P<0.05）下降，直至
检测不出，说明高浓度的 F-对莱茵衣藻和蛋白核小球
藻的 ΦPSⅡ表现为抑制作用。在受到 F-和 pH共同作用
时，F-浓度的升高和 pH的下降均导致 ΦPSⅡ降低。
2.4 pH和 F-对莱茵衣藻和蛋白核小球藻叶绿素a合
成量的影响
叶绿素 a的含量变化一定程度上反映微藻叶绿
体的含量变化，同时叶绿素 a作为一种色素，其净增
加量能表现微藻合成有机物量的能力。当接种量相
同时，在相同 pH条件和相同生长时间下，莱茵衣藻
叶绿素 a合成量明显高于蛋白核小球藻（图 5），表明
莱茵衣藻具有比蛋白核小球藻更强的生长繁殖能
力。从图 5可以看出，pH影响微藻叶绿素 a合成，碱
性和中性环境中两种微藻叶绿素 a的合成量比酸性
环境中高，说明酸性环境不利于微藻的生长和有机
物的积累。当 F-<1 mmol·L-1时，两种微藻叶绿素 a的
变化量并不明显，可见低浓度的氟对两种微藻的生
长没有显著影响（P>0.05）。当 F->1 mmol·L-1时，随着
F-浓度的升高，叶绿素 a含量迅速降低，说明高浓度
的 F-抑制莱茵衣藻和蛋白核小球藻的生长。在受到
1975
2011年 10月
F-和 pH共同作用时，F-浓度的升高和 pH 的下降导
致叶绿素 a合成量减少。
3 讨论
逆境胁迫对植物的影响是多方面的，不仅影响各
种酶的活性，同时也直接导致光合结构的损伤和光合
效率的降低[17]。在本实验条件下，莱茵衣藻和蛋白核
小球藻的生理指标呈现出相似的变化趋势，总的来
说，在 F-<1 mmol·L-1情况下，莱茵衣藻和蛋白核小球
藻几乎不受 F-浓度变化的影响，而受 pH变化影响较
大，表现为胞外碳酸酐酶活性在酸性环境中低于中性
和碱性环境中，ΦPSⅡ和叶绿素 a合成量随着 pH的升
高而增加。在 F->1 mmol·L-1时，两种微藻生理指标受
到 F-和 pH共同作用，表现为胞外碳酸酐酶活性先升
高后降低，ΦPSⅡ和叶绿素 a合成量则随着 F-浓度增加
而迅速下降。在本实验高 F-浓度造成的逆境中，胞外
碳酸酐酶活性随 F-浓度变化波动较大，在 10～100
mmol·L-1范围内酶活显著（P<0.05）高于 0～10 mmol·
L-1范围，表明胞外碳酸酐酶活性能够作为指示微藻
处于高F-逆境的指标。ΦPSⅡ和叶绿素 a合成量在逆境
中均下降，且与 F-浓度有一定的对应关系，可见 ΦPSⅡ
和叶绿素 a合成量也可以作为指示微藻处于高 F-逆
境的指标。
交互作用指在一定条件下，两个或多个元素的结
合生理效应小于或超过它们各自效应之和[18]。在本实
验中，pH=5时较低浓度 F-的作用下两种微藻的胞外
碳酸酐酶活性即达到最高值，而在 pH=7和 9时，诱
导出两种微藻最高胞外碳酸酐酶活性所需的 F-浓度
更高。导致这一现象的可能原因是，在酸性环境下，微
藻生长状况较差，H+和 F-的协同作用下 F-的效应被
放大，故微藻胞外碳酸酐酶活性最高点出现在较低 F-
浓度水平。LeBlanc[19]的研究也揭示 pH 6.0条件下生
长的普通小球藻能够耐受的 F-浓度低于 pH 6.8 时。
碱性环境对微藻的生长有利，OH-部分抵消了 F-的胁
迫作用，表现为在更高浓度 F-作用下两种微藻胞外碳
酸酐酶活性才达到最高。在偏碱性环境中，微藻生长
状况最好，叶绿素的合成量和总无机碳固定量大于中
性和酸性环境中。叶绿素含量的多少影响了光合效率
的高低。酸性环境和高 F-逆境下，两种微藻叶绿素合
成量减少，导致 PSⅡ实际光合效率下降。碱性环境中
莱茵衣藻和蛋白核小球藻叶绿素 a合成量明显增加，
表明碱性环境有利于叶绿素的合成，保证较高的 PS
Ⅱ实际光合效率，即莱茵衣藻和蛋白核小球藻更适于
生长在碱性环境下。
总之，胞外碳酸酐酶活性、光合效率和叶绿素 a
的变化情况都表明碱性环境对莱茵衣藻和蛋白核小
球藻的生长有利，能够耐受的 F-浓度也较中性环境和
酸性环境下高。低于 1 mmol·L-1的 F-对莱茵衣藻和蛋
白核小球藻的胞外碳酸酐酶活性和光合效率影响甚
微，对叶绿素 a的合成也没有显著影响。自然水体中
F-浓度变化很大但均远低于 1 mmol·L-1[20]，说明两种
微藻在自然界高氟水体内均能正常生长。已有研究表
明，水生植物体内氟含量随环境中 F-升高以及培养时
间的增加而上升[5]，可见微藻可以作为除去水体中低
浓度超标 F-的材料。
4 结论
（1）在不同 pH和低于 1 mmol·L-1的 F-共同作用
下，两种微藻主要受 pH 的影响；在 pH 和高于 1
mmol·L-1的F-作用下，则受 F-和 pH共同影响。
（2）胞外碳酸酐酶活性、ΦPSⅡ和叶绿素 a合成量
都能够作为指示微藻是否受氟胁迫的指标。
（3）以微藻为材料除去自然水体中的超标 F-理论
上是可行的。
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