全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第3期
收稿日期 : 2011-09-26
基金项目 : 国家自然科学基金项目（30670189）, 湖南省重点学科建设项目（2011-76）
作者简介 : 黄国文 , 男 , 博士 , 讲师 , 研究方向 : 植物生物学 ; E-mail: huanggwdax@163.com
通讯作者 : 傅永福 , 男 , 博士 , 研究员 , 研究方向 : 植物发育生物学 ; E-mail: fuyf@caas.net.cn
SUA41蛋白表达和纯化及其多克隆抗体制备
黄国文1 韩玉珍2 傅永福3
（1 湖南科技学院生命科学和化学工程学院，永州 425100 ；2 中国农业大学生物学院，北京 100081 ；3 中国农业科学院作物科学研究所
农作物基因资源与遗传改良国家重大科学工程，北京 100081）
摘 要： 旨在制备特异性 SUA41多克隆抗体，为深入研究其在植物生长发育中的功能提供有力的分子生物学和生物化学的
工具。PCR 扩增拟南芥 SUA41基因中编码 280个氨基酸（401-680位氨基酸）的特异片段，经过 GATEWAY的 DNA重组技术构
建了原核表达载体 pDEST17-SUA41，用热休克法转化到 E. coli BL21（DE3）star 感受态细胞，以异丙基 β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）
诱导表达出 6×His-SUA41融合蛋白，用 8 mol/L尿素缓冲液溶解包涵体并且经过水逐级去除尿素获得提纯的融合蛋白，并利用
Western blotting鉴定确认。融合蛋白经 Ni金属螯合柱亲和层析得以纯化，用 SDS-PAGE进一步纯化。纯化的融合蛋白经过 SDS-
PAGE后切胶回收，免疫小白兔，制备多抗血清，然后用Western blotting进行检测，鉴定血清特异性和效价。结果显示，融合蛋
白 6×His-SUA41免疫兔，产生特异性的 SUA41兔抗血清，可以检测到细菌和拟南芥组织中 SUA41蛋白。用水提纯变性剂尿素溶
解的包涵体蛋白具有可行性。制备的特异性 SUA41兔抗血清效价高，能够有效地识别大肠杆菌表达的和拟南芥的 SUA41蛋白。在
有合适的对照情况下，该兔抗血清可以用于分析植物中 SUA41蛋白的功能。
关键词： SUA41 融合蛋白 蛋白纯化 兔抗血清
Expression, Purification and Polyclonal Antibody
Preparation of SUA41 Protein
Huang Guowen1 Han Yuzhen2 Fu Yongfu3
（1Department of Biological Sciences and Chemical Engineerings，Hunan College of Science and Technology，Yongzhou 425100；2College of
Creature，China Agriculture University，Beijing 100081；3Institute of Crop Sciences，National Key Facility of Crop Gene Resource and Genetic
Improvement，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081）
Abstract: It was to prepare rabbit antiserum against SUA41 for further study of the function of SUA41 protein and the relationship
between SUA41 protein and plant development. We cloned a specific fragment（1 021-2 040 bp）from Arabidopsis SUA41 gene, constructed
a fusion expression vector pDEST17-SUA41, and transferred it into E. coli BL21（DE3）Star. Cells were indued by IPTG to express fusion
polypeptide containing a 6×His-tag at the N-terminal of SUA41 fragment in inclusion bodies. Incluson bodies were dissolved in 8 mol/L
urea buffer, cleared progressively by water, and purified through Ni-NTA affinity chromatography, and confirmed by Western blot. The fusion
protein was further purified by SDS-PAGE. Polyacrylamide gel containing fusion proteins 6×His-SUA41 was used to immunize rabbits to
develop a polyclonal antiserum. The rabbit antiserum was evaluated by western blot and showed its effectiveness and specility. Results showed
a prokaryotic expression vector pDEST17-SUA41 was successfully constructed. The fusion protein 6×His-SUA41 was efficiently expressed in
inclusion bodies in BL21 Star, cleared with water, and purified by Ni-NTA and SDS-PAGE. The rabbit was immunized with this purified fusion
proteins and prepared a polyclonal antiserum, which could react effectively with SUA41 from E. coli and Arabidopsis tissues. Water could be
used to purify inclusion body proteins dissolved in urea buffer, which could promote affinity purification of proteins with Ni-NTA Resin. The
prepared SUA41 antiserum had high affinity to react SUA41 protein, and it may be used to analyse the function of SUA41 protein in the presence
of suitable controls.
Key words: SUA41 Fusion protein Protein purification Polyclonal antiserum
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第3期154
SUA41 是一种核孔蛋白，在拟南芥的生长发
育过程中起重要作用。拟南芥中 SUA41 基因的突
变体表现出早开花、下胚轴伸长等特征［1］。SUA41
基因突变体（sar3-1和 sar1）能够恢复生长素诱
导的 IAA1 和 IAA5 基因的表达 ；并且与野生型相
比，sar3-1和 sar1突变体的主根短、侧根少、早开
花，因而 SUA41 基因参与拟南芥激素信号传导和发
育［1, 2］；此外，SUA41 基因参与植物的防御反应［3］，
sua41突变体对病原菌有抗性。拟南芥 SUA41 基因
较长，编码区为 3 141 bp，其蛋白由 1 071 个氨基酸
组成，相对分子质量约为 121 kD，其空间结构和作
用方式目前不清楚。本研究通过 PCR 扩增 SUA41 基
因中编码 280 个氨基酸的特异片段，构建蛋白质高
效原核表达体系 BL21 Star/pDEST17-SUA41，诱导表
达 6×His-SUA41 融合蛋白，应用 His-标签与镍琼脂
糖凝胶亲和层析纯化特异性融合蛋白［4, 5］，并且制
备兔抗血清，旨在为研究 SUA41 在拟南芥生长发育
过程中功能和应用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 材料 载体 pDONR201 和 pDEST17，E. coli
DH5α 和 BL21 Star 均为本实验室保存。His 单克隆
抗体购自 Sigma 公司 ；辣根过氧化物酶（HRP）偶
联的羊抗兔 IgG 购自 Abmart 公司。DNA 扩增的高保
真 LA Taq DNA 聚合酶和 IPTG 购自 Promega 公司 ；
Ni 金属螯合柱和试剂均购自 Qiagen 公司。PCR 引物
由北京三博生物技术公司合成。
1.1.2 试剂 PCR 试剂盒和 DNA 回收试剂盒以及质
粒提取试剂盒（包括小量提取、大量制备 2 种）均
购自北京三博生物技术公司。蛋白质分子量标准为
Invitrogen 公司产品 ；用于配制 LB 培养基的化学试
剂均为分析纯。
1.2 方法
1.2.1 表达载体的构建 以拟南芥 cDNA 为模板，
以 P1 ：5-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGC
TGCATGTCTTCTGTGATCAATAAAG-3 和 P2 ：5-GG
GGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTCAGTCGG
GAGGTAGATGATG-3为引物，以及 LA Taq DNA 聚
合酶，PCR 扩增编码 401-680 位氨基酸的 DNA 片
段。在 P1 和 P2 两个引物上带有重组酶的重组位点，
利用 Gateway 技术［6］，通过 BP 反应，将 SUA41 基
因的特异片段连接到 pDONR201（Kan 抗性）载体
上。转化到 E. coli DH5α 中，提取重组质粒并用载
体上的通用引物对重组质粒测序。先将含有 SUA41
基因特异片段的 pDONR201 载体与原核表达载体
pDEST17（Amp 抗性，噬菌体 T7 启动子）混匀，通
过缓冲液中 LR 酶作用发生 LR 反应，产生表达载体
pDEST17-SUA41。用基因特异引物对重组质粒进行
PCR 鉴定。
1.2.2 重组载体转化大肠杆菌和 6×His 融合蛋白的
诱导表达 重组质粒转化大肠杆菌 BL21 Star。将转
化子铺在含 Amp 抗生素（50 μg/mL）的 LB 平板上，
于 37℃过夜培养。通过菌落或菌液 PCR 筛选带有
目的片段表达载体的阳性克隆。挑取表达 6×His 融
合蛋白的重组质粒阳性克隆和表达 6×His 的空载体
pDEST17 的阴性克隆，接种到含有 Amp 抗生素（50
μg/mL）的 15 mL LB 液体培养基中，37℃高速振荡
培养（230 r/min 左右）至 OD600 为 0.5-1.0 时，加入
IPTG（终浓度为 1 mmol/L），留 1 mL 不加 IPTG 的菌
液作对照，继续培养 4-6 h 后，将培养基分为两份（10
和 5 mL），低温离心分别收集细菌。一份 5 mL 的诱
导菌用 2×SDS 上样缓冲液煮沸裂解提取蛋白质，用
于鉴定目的蛋白的表达情况 ；另外一份 10 mL 的诱
导菌则按 16 1（V/V）的比例加入细菌裂解缓冲液
［100 mmol/L NaH2PO4 pH8.0，100 mmol/L NaCl，0.5%
Triton-X-100，0.1% NaN3，1 mmol/L PMSF（或蛋白
酶抑制剂 cocktail，购自 Loche 公司），10 mmol/L β-
巯基乙醇］悬浮，放置冰上，于超声破碎仪上以 10
mmol/L 直径的探头，48% 的功率超声 4 次，每次 2
min，每次间隔冰冷 2 min；裂解液在 4℃，12 000 r/min
离心 15 min，分别收集上清液和沉淀。进行 SDS-
PAGE，对凝胶用考马斯亮蓝染色方法或者 Western
blotting 分析菌体中融合蛋白的诱导表达情况。试验
分析每一个克隆的诱导前样品、诱导样品、上清和
细胞破碎沉淀以及裂解液的蛋白质表达量和可溶性。
选取适合的表达克隆用于表达大量的靶蛋白。
1.2.3 包涵体蛋白的提取和纯化 将筛选到的能表
达包涵体融合蛋白的克隆接种到含有 Amp 抗生素
（50 μg/mL）5 mL LB 液体培养基中，37℃高速振荡
2012年第3期 155黄国文等 ：SUA41 蛋白表达和纯化及其多克隆抗体制备
（230 r/min）培养过夜 ；按 1 100 的体积比转接到
含有 Amp 抗生素（50 μg/mL）500 mL LB 液体培养
基中，37℃高速振荡培养至 OD600 为 0.5-1.0 时，加
入 IPTG（终浓度为 1 mmol/L），留 1 mL 不加 IPTG
的菌液作对照，继续培养 4-6 h 后低温离心收集细
菌。先按 16 1（V/V）的比例加入细胞裂解缓冲
液 ［100 mmol/L NaH2PO4 pH8.0，100 mmol/L NaCl，
0.5% Triton X-100，0.1% NaN3，使用前加入 1 mmol/L
PMSF（或蛋白酶抑制剂 cocktail）和 10 mmol/L β-ME］
悬浮细菌沉淀，在冰上超声破碎菌体，在细胞超声
破碎后，添加 10 mmol/L MgSO4（使用 2.0 mol/L 母
液）来螯合去掉 EDTA。然后，加入 DNase（大约
0.01 mg/mL）和溶菌酶（大约 0.01 mg/mL）到裂解
产物中，放在室温下温育 20 min，以除去 DNA。裂
解液在 4℃，6 000 r/min 离心 15 min，收集包涵体
沉淀 ；用包涵体洗涤液（50 mmol/L NaH2PO4 pH8.0，
300 mmol/L NaCl，0.1% NaN3，1 mmol/L PMSF，
10 mmol/L β-ME）洗涤包涵体 ；然后按 16 1（V/V）
的比例加入 8 mol/L 尿素变性缓冲液（100 mmol/L
NaH2PO4 pH8.0，300 mmol/L NaCl，1 mmol/L PMSF，
10 mmol/L β-ME，8 mol/L 尿素，0.1% Tween-20）悬
浮包涵体。用细菌研磨器将包涵体溶液研磨均匀，
在室温下剧烈搅拌包涵体溶液 1-3 h，或在 4℃振荡
过夜，以充分溶解包涵体。在 4℃离心（5 000 r/min，
20 min）。去掉上清液，沉淀即为包涵体蛋白。进行
SDS-PAGE 分析，证实融合蛋白。
纯化 His-标签的包涵体蛋白的方法是按照
QIAexpress Ni-NTA 蛋白纯化试剂盒（Qiagen 公司）
说明书进行。产物于 -20℃保存备用。
1.2.4 6×His-SUA41 的切胶纯化 对已经纯化的目
的蛋白溶液，经 SDS-PAGE 分离，0.3 mol/L CuCl2 溶
液显色 5-15 min，切取含 6×His-SUA41 的 PAGE 胶
块。用脱色液（0.25 mol/L EDTA pH8.0，0.25 mol/L
Tris-HCl pH9.0） 脱 色， 在 MTPBS（mouse tonicity
phosphate-buffered saline: 150 mmol/L NaCl，16 mmol/L
Na2HPO4 ，4 mmol/L NaH2PO4 ，pH7.3）中平衡过夜。
把这些凝胶块放在研钵中，用液氮冷冻干燥，碾磨
成胶粉［7］，即为目的蛋白。取适量胶粉，经 SDS-
PAGE 分离及考马斯亮蓝染色，观察结果。
1.2.5 多克隆抗体的制备 将切胶回收的特异性
SUA41 蛋白（1 mg/mL）对大白兔腋下和腹股沟处
肌肉注射进行免疫，共 3 次。采取颈动脉放血方式
收集抗血清，血清在 4℃孵育过夜，离心收集上清，
分装冻存于 -70℃备用。本次用特异性 SUA41 蛋白
免疫小白兔制作抗血清由中国科学院遗传和发育研
究所完成。
1.2.6 抗体的 Western blotting 检验 取一定数量的
特异性 SUA41 蛋白与等体积的 2×SDS-PAGE 上样
缓冲液混合，100℃水浴 5 min，冷却后上样，进行
12% SDS-PAGE 电泳。电泳结束后，将蛋白电转移
到硝酸纤维素膜上。印迹膜在封闭液（5% 脱脂奶粉
的 TBS 缓冲液）中室温封闭 1 h。加入以封闭液稀释
的抗血清（稀释度为 1 500-1 2 000），室温轻摇 1 h，
TBST（25 mmol/L Tris-HCl pH5.7，150 mmol/L NaCl，
0.1% Tween-20）洗膜 3 次，每次 10 min，然后用封
闭液稀释（稀释度 1 5 000，V/V）过的耦联有辣根
氧化酶的羊抗兔二抗，室温轻摇 1 h，TBST 洗膜 3 次，
每次 10 min，用 ECL 试剂进行化学发光并压 X 光片
和显影进行检测。
1.2.7 SUA41 蛋白在拟南芥中的表达分析 取一定
量的植物材料，加入液氮研磨成粉末后装入到预冷
的 1.5 mL 离心管中，加入适量（2 1，V/V）预冷
的植物总蛋白提取缓冲液（50 mmol/L Tris-Cl pH8.0，
120 mmol/L NaCl，10% Glycerol，2% Triton X-100，
使用前加入 5 mmol/L PMSF，10 mmol/L DTT）。置
于冰中浸提 4 h。4℃，13 500 r/min 离心 2 次，每
次 20 min，小心吸取上清液即为蛋白质提取液。
取 20 μL 加入等体积的 2×SDS 上样缓冲液，煮沸
10 min，12 000 r/min 离心 1 min，取上清用于 SDS-
PAGE 电泳分析。然后进行 Western blotting 检测，
分析植物中 SUA41 蛋白的表达量。
2 结果
2.1 表达载体pDEST17-SUA41的构建和鉴定
以拟南芥 SUA41 基因为模板，PCR 扩增其中
1 201-2 040 bp 的特异片段，长度 840 bp，编码 280
个氨基酸，其分子量约为 36 kD。利用 Gateway 系统
中的 BP 反应，得到了 5 个相应的 pDONR201 克隆。
对这些克隆用 PCR 鉴定，进一步挑选到一个克隆用
于提取质粒并进行 DNA 测序。然后进行 LR 反应，
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第3期156
构建基因特异片段的表达载体 pDEST17-SUA41，将
其载体转化到 E. coli BL21 Star 菌株中，用特异性引
物进行菌株的 PCR 鉴定，并且保存克隆。
2.2 筛选表达SUA41基因特异片段的克隆
在平板上挑取 7 个阳性克隆（BL21 Star 细胞）
和 1 个含有空载体的 BL21 Star 阴性克隆，经过
IPTG 诱导培养后，用 SDS-PAGE 方法检测细菌中蛋
白（总蛋白）表达，凝胶用考马斯亮蓝染色。结果（图
1）显示，第 2 和第 4 个克隆诱导出明显的特异性
蛋白条带（图 1-A）。图中特异蛋白条带分子量约为
47 kD，大于预期的 36 kD，可能是因为 His-tag 中含
有连续 6 个组氨酸，带有较强的正电荷，改变了蛋
白在 SDS-PAGE 中的泳动行为，降低了蛋白的泳动
速率，导致了表观分子量的增大［8］。Western blotting
分析表明，特异性条带能够与His-抗体结合（图1-B）。
因此，特异性条带是 SUA41 基因特异片段产生的特
异性蛋白。保存图中第 2 泳道的克隆用于后续的蛋
白表达和纯化工作。
A.SDS-PAGE凝胶用考马斯亮蓝染色结果；B. Western blotting分析His-SUA41蛋白的表达；
M. 蛋白质 Marker ；1. 对照 ；2-8. 阳性克隆
图 1 筛选表达 SUA41基因特异片段的克隆
2.3 融合蛋白6×His-SUA41 的可溶性分析
经过 IPTG 诱导培养保存克隆（图 1 中第 2 泳
道）的子代克隆中，加入不同的裂解液（SDS-PAGE
上样缓冲液、6 mol/L 尿素缓冲液、8 mol/L 尿素缓
冲液，磷酸缓冲液）裂解表达克隆，离心后取上
清，用 SDS-PAGE 分析方法确定细胞中合成的蛋白
质可溶性。结果（图 2）显示，细菌合成的 6×His-
SUA41 融合蛋白在 SDS-PAGE 上样缓冲液和 8 mol/L
尿素缓冲液溶解的上清液中特异性蛋白质含量较多
（图 2，克隆 2 和 3 及 a-f），然而，与对照相比，用
6 mol/L 尿素缓冲液和磷酸缓冲液提取蛋白的上清液
含有特异性蛋白质很少，说明 SUA41 特异性蛋白在
合成过程中形成了包涵体，以疏水性蛋白形式表达
出来。
A. 用不同的缓冲液裂解诱导细胞，1-3. SDS 上样缓冲液 ;4-6. 6 mol/L 尿素变性缓冲液 ;7-10. 磷酸缓冲液，
其中，1,4,7. 非诱导细胞。B. 含 8 mol/L 尿素的变性缓冲液裂解细胞，a-f. 0.5 mol/L IPTG 诱导的细胞 ；g-j
分别是 a-d 的非诱导细胞
图 2 IPTG诱导 BL21 Star 细胞产生的 SUA41融合蛋白的可溶性分析
2.4 纯化包涵体蛋白
将在 5 mL 培养基中过夜生长的表达 SUA41
蛋白的克隆接种到新的 LB 培养基（500 mL）中，
IPTG 诱导后产生 SUA41 包涵体蛋白。通过低温离心
收集细菌。用含有 8 mol/L 尿素的裂解缓冲液 30 mL
来重悬细菌沉淀，在超声破碎仪上破碎细菌。低温
离心，收集上清液。
用 Ni-NTA 树脂来纯化上清液中的 SUA41 蛋白，
2012年第3期 157黄国文等 ：SUA41 蛋白表达和纯化及其多克隆抗体制备
结果（图 3）表明，在包涵体蛋白溶液中 SUA41 蛋
白含量很多，但是 SUA41 特异蛋白大部分未结合到
Ni-NTA 树脂上，使得洗脱出来的特异性蛋白很少，
而杂蛋白含量多。说明 Ni 金属离子螯合柱对 SUA41
融合蛋白的 His 标签的亲和力不强 ；或者 6×His
SUA41 融合蛋白本身的结构折叠限制了 His 标签对
Ni 金属离子螯合柱的亲和力。所以，有必要在裂解
液中去掉一部分杂蛋白，提纯融合蛋白后，再进行
纯化。
如图 2 显示，6 mol/L 尿素几乎不能溶解包涵
体蛋白，因此采用水稀释变性剂尿素来析出包涵体
蛋白，除去水溶性杂蛋白，可以提纯溶解的包涵
体蛋白。用含有蛋白酶抑制剂的水来逐步稀释含
8 mol/L 尿素细胞裂解液，尿素浓度依次为 8、4、2、
1 和 0.5 mol/L，通过离心收集包涵体蛋白。这些蛋
白再用少量的变性缓冲液溶解，进行聚丙烯酰氨凝
胶电泳和 Western blotting（图 4）分析，证明这些蛋
白质中含有较多的 SUA41 蛋白。
1. 沉淀 ；2. 上清 ；3. 穿透液 ；4. 第一次漂洗液 ；5. 第二次漂洗液 ；
6. 第一次洗脱液 ；7. 第二次洗脱液 ；8. 第三次洗脱液
图 3 在变性条件下大量纯化 SUA41蛋白
A.考马斯亮蓝染色，B.Western blotting。1.沉淀；2.一级浓缩；
3. 二级浓缩 ；4. 三级浓缩 ；5. 四级浓缩
图 4 分级纯化的蛋白
经过水提纯的融合蛋白溶液和 Ni-NTA 树脂结
合后，用 5 mmol/L 咪唑的漂洗缓冲液洗去未结合的
蛋白和杂蛋白，然后用 250 mmol/L 咪唑的洗脱缓冲
液洗脱出目的蛋白。结果表明，树脂经过严格的洗
脱后，纯化出的目的蛋白比较纯，杂蛋白较少。用
蛋白质印迹法检测，确定纯化出的蛋白质是 SUA41
蛋白。对这些洗脱蛋白溶液进行浓缩，用于下一步
切胶回收蛋白。
2.5 目的蛋白切胶回收及制备抗体
对已经纯化的目的蛋白溶液，进行 SDS-PAGE
电泳，聚丙烯酰胺凝胶用 0.3 mol/L CuCl2 负显色，
表现出凝胶变成灰白色，但是蛋白带保持透明。在
黑色的背景下，从一侧来的光照使蛋白带清晰可见，
用锋利的刀片切下含目的蛋白带的凝胶。在脱色液
脱色和 MTPBS 液中平衡后，用液氮冷冻干燥，研磨
成胶粉，即为 6×His-SUA41 融合蛋白样品。用于小
白兔免疫，制作兔抗血清。
2.6 特异SUA41蛋白兔抗血清效价的检测
在 IPTG 诱导的细菌中提取融合 SUA41 蛋白，
用 SUA41 蛋白兔抗血清进行 Western blotting 鉴定。
结果（图 5）显示，用 1 2 000 的比例稀释的抗血清
作为一抗，1 5 000 的羊抗兔抗体作为二抗，经过免
疫荧光显示，可以检测到 50 ng 的蛋白 ；但是在目
标条带的上下方有微弱的杂蛋白条带。说明 SUA41
蛋白抗血清效价较高，但特异性不强。
M. 蛋白质 Marker ；1-3. 分别是 50、100 和 200 ng 融合蛋白
图 5 Western blotting检测 SUA41蛋白抗血清的效价
2.7 SUA41特异蛋白兔抗血清的特异性检测
利用提取拟南芥总蛋白的缓冲液提取植物总蛋
白作为抗原。用 1 500 的比例稀释的 SUA41 蛋白抗
血清作为一抗，1 5 000 的羊抗兔抗体作为二抗，进
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第3期158
行蛋白质印迹试验。结果（图 6）显示，在分子量
为 83 kD 的位置上，非特异性蛋白条带 b 在 4 个材
料中数量接近，表明试验操作时对材料的相等上样
量与试验结果相符 ；在符合 SUA41 蛋白分子量约为
121 kD（SUA41 的分子量）的位置上，蛋白条带 a
在野生型 Col-0 植株中有微弱的信号，sua41突变体
中无蛋白信号，然而 SUA41 过表达植株中有较强的
蛋白条带信号，并且两个转化系的结果一致，说明
SUA41 多克隆抗血清能够识别植物体内的 SUA41 蛋
白。尽管 SUA41 多克隆抗血清也能识别在其他位置
的杂蛋白带，但是杂蛋白不影响抗血清识别 SUA41
蛋白，说明具有较高效价的抗血清可以用于分析植
物样品中 SUA41 蛋白的含量。
白质不固定，染色迅速，凝胶不收缩，并且不对蛋
白质产生任何修饰作用以及保持蛋白完整性等优点，
有利于回收蛋白的结构和生物学活性分析［12］。本研
究对 SUA41 特异性融合蛋白用 CuCl2 染色切胶回收
后制备了抗血清。Western blotting 检测表明，制备
的 SUA41 特异性蛋白兔抗血清能够有效识别细菌表
达的SUA41蛋白，表明抗体的效价是比较好的；另外，
抗体除了可以与目的蛋白起反应外，在目的条带的
上方和下方都可以看到一些相对较弱的非特异条带，
说明该多克隆兔抗血清的特异性具有一定的局限性，
但是该兔抗血清的这种不足对检测拟南芥 SUA41 蛋
白的影响是有限的。因为 Western blotting 研究表明，
SUA41 蛋白位置上 sua41突变体中没有蛋白信号，
在野生型和过表达植株中有信号，并且在过表达植
株中蛋白信号明显增强，表明该兔抗血清能识别植
物的 SUA41 蛋白特异条带，在有对照（突变体或者
过表达植株）条件下，能用于植物中 SUA41 蛋白的
功能分析。
4 结论
本研究成功构建了 pDEST17-SUA41 重组表达载
体，促进了在大肠杆菌中核膜蛋白 SUA41 特异片段
与 6×His 标签融合高效表达，获得了包涵体蛋白。
用水提纯了包涵体蛋白，实现了 Ni-NTA 树脂对包
涵体蛋白的有效纯化，为切胶回收蛋白质制备抗体
打下基础。这种表达纯化体系为利用大肠杆菌制备
包涵体形式的融合蛋白提供了一种切实可行的方法。
制备的 SUA41 蛋白兔抗血清具有较高的效价，可用
于植物组织特别是 SUA41 基因各种形式的过表达材
料的 Western blotting 检测，为进一步研究 SUA41 蛋
白的生物学功能提供参考。
参 考 文 献
［1］ Parry G, Ward S, Cernac A, et al. The Arabidopsis SUPPRESSOR OF
AUXIN RESISTANCE proteins are nucleoporins with an important
role in hormone signaling and development. The Plant Cell, 2006, 18
（7）: 1590-1603.
［2］ Cernac A, Lincoln C, Lammer D, Estelle M. The SAR1 gene of
Arabidopsis acts downstream of the AXR1 gene in auxin response.
Development, 1997, 124: 1583-1591.
1. 蛋白质 Marker ；2. 野生型 Col-0 ；3. sua41突变体 ；4,5. SUA41 过
表达植株的两个转化系 ；a. SUA41 蛋白 ；b. 非特异性蛋白
图 6 SUA41抗体对植物中 SUA41蛋白的
Western blotting分析
3 讨论
蛋白是基因功能的主要表现形式，高效价抗体
是检测抗原的关键［9］，因而高效价的抗体为基因功
能研究提供了一种重要工具。本试验在制备核膜蛋
白 SUA41 兔抗血清过程中，纯化 SUA41 蛋白是最
关键的步骤。因为，在制备和洗涤包涵体后，用 Ni-
NTA 树脂纯化 8 mol/L 尿素溶解的包涵体蛋白溶液时
获得很少的目的蛋白。其原因可能是包涵体裂解液
中较高的杂蛋白和目的蛋白共纯化，降低了 6×His-
SUA41 融合蛋白的 His 标签与 Ni 金属离子螯合柱的
亲和力［10］。因此，利用水逐级稀释尿素溶解的包涵
体蛋白溶液并析出包涵体蛋白，能够除去大量的水
溶性杂蛋白，从而加强提纯的包涵体融合蛋白 His
标签与 Ni-NTA 树脂的亲和力，最终纯化出融合蛋白。
经过这种用变性剂溶解和纯化融合蛋白，既能够用
于融合蛋白复性后的生化活性分析［11］，也可以直接
用于抗体的制备。用 CuCl2 对回收胶负染色具有蛋 （下转第 165页）
2012年第3期 165汤鸣强等 ：米曲霉 F-81 产中性蛋白酶的固定化条件及其特性
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