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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(7):132-137
铁离子代谢平衡对生命体至关重要，包括活性
氧运输、电子传递和 DNA 合成等过程都离不开铁离
子的参与。游离铁离子的浓度也是病原菌赖以生存
及病感染机体造成危害的重要因素［1］。转铁蛋白受
体（TfR）是一种细胞膜相关糖蛋白，是调控细胞内
铁离子吸收的“开关”。尽管 TfR 分子不直接和细胞
中的铁离子结合，但却可通过调控与细胞质内转铁
蛋白（Transferrin，Tf）的结合达到细胞内铁离子运
输和存储平衡［2］。目前，已知转铁蛋白受体有两类
（TfR1 和 TfR2），它们在分子结构上比较相似，但表
收稿日期 ：2014-11-12
基金项目 ：湖北省教育厅基金项目（Q20131206），湿地生态与农业利用教育部工程研究中心开放课题（2013A011），国家大学生创新创业
训练计划项目（104892014032）
作者简介 ：江翱，男，研究方向 ：生物技术制药 ；E-mail ：1362541137@qq.com
通讯作者 ：李伟，男，博士，副教授，研究方向 ：鱼类分子生物学 ；E-mail ：wetli@yangtzeu.edu.cn
黄鳝转铁蛋白受体 1 基因的克隆及表达分析
江翱1  李伟1，2
（1. 长江大学生命科学学院，荆州 434025 ；2. 湿地生态与农业利用教育部工程研究中心，荆州 434025）
摘 要 ： 旨在研究黄鳝转铁蛋白受体 1 基因的功能及其组织表达特异性，采用同源克隆结合 RACE 技术从黄鳝肝脏中分离
其转铁蛋白受体 1 基因，用生物信息学方法对获得的氨基酸序列进行分析，用半定量 RT-PCR 技术研究各组织中 TfR1 表达水平。
结果表明，克隆获得黄鳝 TfR1，GenBank 注册序列号为 KF819396。该 cDNA 全长 2 839 bp，5 UTR 长 134 bp，3 UTR 长 380 bp，
编码一个长 774 个氨基酸的多肽链。氨基酸多序列比对结果表明，黄鳝 TfR1 基因推断的氨基酸序列同其他鱼类的同源性较高，达
55.68%-68.41% ；而同哺乳动物的 TfR1 基因同源性较低。半定量 RT-PCR 分析表明，黄鳝 TfR1 基因转录本在不同组织表达量有明
显差异 ；在血细胞中表达量最高，而在肾脏、脾脏和小肠中表达中等，在肝脏、胃、皮肤、脑、心脏和肌肉中表达量很低。
关键词 ： 黄鳝 ；转铁蛋白受体 1 ；RACE 技术 ；RT-PCR 技术
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.019
Cloning and Expression Analysis of a Transferrin Receptor 1 Gene
from Swamp Eel，Monopterus albus
Jiang Ao1 Li Wei1，2
（1. College of Life Science，Yangtze University，Jingzhou 434025 ；2. Engineering Research Center of Ecology and Agricultural Use of
Wetland，Ministry of Education，Jingzhou 434025）
Abstract: For investigating the function and tissue expression specificity of transferrin receptor 1 gene（TfR1）from swamp eel, TfR1
gene was isolated from the liver of swamp eel using homologous cloning and RACE techniques, the bioinformatics method was used to analyze
the putative amino acid sequence, and semi-quantitative RT-PCR was used to study the expression of TfR1 gene in different tissues. The results
showed that the full length of cDNA（GenBank accession number：KF819396）was 2 839 bp including a 134 bp 5 un-translated region（UTR）
and a 380 bp 3 UTR, and it encoded a polypeptide of 774 amino acids. Sequence alignment by amino acid indicated that the inferred amino
acid sequence of TfR1 from swamp eel shared high identity with those of other teleosts in 55.68%-68.41%. Semi-quantitative RT-PCR analyses
demonstrated that the TfR1 transcripts were significantly varied in different tissues, the highest in blood cells, moderate in kidney, spleen and
intestine, and little in liver, stomach, skin, brain, heart and muscle.
Key words: swamp eel ；transferrin receptor 1（TfR1）；RACE ；RT-PCR
2015,31(7) 133江翱等 ：黄鳝转铁蛋白受体 1 基因的克隆及表达分析
达调控模式和功能上有着较大差异［3］。TfR1 分子几
乎可以在所有正常细胞中表达，但在成熟红细胞及
多能造血干细胞中很少或几乎不表达［2］；TfR2 分子
则是一种特异性介导肝脏细胞铁离子代谢的糖蛋白，
主要在肝脏及十二指肠隐窝细胞中表达［4］。TfR1 分
子目前比较明确的作用就是调控细胞对铁离子的吸
收［2］，而 TfR2 分子对体内铁平衡的调节作用比它对
铁的摄取作用重要得多［5］。迄今为止，只有人类和
小鼠转铁蛋白受体基因及其功能进行了较为深入的
研究。牛［6］、猪［7］、大菱鲆［8］和草鱼［9］等少数物
种上也已有转铁蛋白受体分子被报道。有关于黄鳝
转铁蛋白受体基因及其功能的研究国内外尚无报道。
黄鳝是我国及许多东南亚国家重要的淡水养殖种类，
具有较高的食用和药用价值。克隆并研究其铁离子
代谢相关功能基因有助于了解黄鳝抗细菌病的分子
机制及促进黄鳝健康养殖业的发展。本研究通过同
源克隆结合 RACE 的方法从黄鳝肝脏 cDNA 中克隆
了 TfR1 基因 cDNA 全长，对其进行生物信息学分
析并研究其组织表达特异性，旨在为深入了解鱼类
TfR1 基因在铁离子代谢中的作用提供基础资料。
1 材料与方法
1.1 材料
健康成体黄鳝（体质量 75-110 g）购买于荆州
市太湖水产市场。pMD18-T 克隆载体、PrimeScript
RT reagent 试 剂 盒、DL2000 DNA Marker 等 购 至 大
连 TaKaRa 公司 ；Trizol 试剂购买于 Invitrogen 公司 ；
DH5α 感受态细胞、DNA 凝胶回收试剂盒为北京全
式金公司产品 ；Smart Race cDNA Amplification Kit 试
剂盒购买于 Clontech 公司。
1.2 方法
1.2.1 总 RNA 提取、引物设计及 cDNA 片段获得
随机选取 3 条鳝鱼进行解剖取其血细胞、心脏、肝脏、
脾脏、胃、肾脏、皮肤、肌肉、肠和脑等 10 种组织
速冻于液氮中，保存于 -80℃冰箱，用于 RNA 的提
取。总 RNA 提取采用 Trizol 试剂按照说明书进行。
cDNA 合 成 用 TaKaRa 公 司 的 PrimeScript RT regent
试剂盒按照说明书进行。根据 GenBank 上报道的猪
（Sus scrofa，NP_999166.1）、普通狨（Callithrix jacc-
hus，NP_001288776.1）、 人（Homo sapiens，BAF84-
412.1）、狞猫（Caracal caracal，AFM73555.1）、黄牛
（Bos taurus，ADE09354.1）、 斑 马 鱼（Danio rerio，
NP_001009917.1）、 青鳉（Oryzias latipes，XP_0040-
79020.1）、虹鳟（Oncorhynchus mykiss，CDQ90669.1）
和红鳍东方鲀（Takifugu rubripes，XP_003975880.1）
的 TfR1 基因 cDNA 序列设计了简并性引物 de-F（5-
ccctcsttyaaycacacncagtt-3） 和 de-R（5-gccctggatgntc-
caggtggc-3）用来扩增肝脏 cDNA。PCR 反应程序为：
94℃ 4 min ；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1.5 min，35
个循环 ；72℃延伸 7 min。扩增得到的产物经回收
纯化后克隆至 pMD18-T 载体，转化大肠杆菌挑取 3
个阳性克隆送上海博尚生物科技有限公司进行序列
测定。
1.2.2 黄鳝 TfR1 基因 cDNA 全长的获得 根据上述
所得 cDNA 片段，设计基因特异性引物 GSP5（5-ga
atgtgggtagccatgcctgctgtg-3）和 GSP3（5-acatccagaacag-
cgacctg-3）用来进行 RACE 扩增。RACE 采用 Smart
Race cDNA Amplification Kit 试 剂 盒 说 明 书 进 行。
PCR 扩增产物经回收纯化后克隆至 pMD18-T 载体，
转化大肠杆菌挑取 3 个阳性克隆送上海博尚生物科
技有限公司进行序列测定。将上述所得 5 UTR、3
UTR 及中间 cDNA 片段进行拼接后即得黄鳝 TfR1 基
因 cDNA 全长。
1.2.3 黄鳝 TfR1 基因序列分析及进化树构建 利
用 SignalP 4.1 软 件（http ：//www.cbs.dtu.dk/services/
SignalP/）对黄鳝 TfR1 基因推断的氨基酸序列进行
信号肽预测。采用蛋白质二级结构分析软件 prosite
（http ：prosite.expasy.org/cg-bin/prosite/）对其进行 N-
糖基化位点和 O-糖基化位点的分析。采用 SMART
软件对其进行功能结构域分析（http ：//smart.embl-
heidelberg.de/）。 用 DNAMAN 软 件 对 不 同 物 种 的
TfR1 基因进行多序列比对。采用 MEGA4.0 软件中
的 N-J 法构建遗传进化树。
1.2.4 黄鳝 TfR1 基因组织表达分析 将各组织总
RNA 用 无 RNAase 的 DNase I 消 化 后 反 转 录 获 得
cDNA 第一条链。采用基因特异性引物 rt-F1（5-gt-
ccatgatcatctattgcggat-3） 和 rt-R1（5- gtactccaccttcat-
gatgc-3）检测各组织中 TfR1 基因转录本的表达量，
以 β-actin 基因的表达量为内参，设计的 β-actin 的
引 物 为 actin-F1（5-gctgtgctgtccctgta-3） 和 actin-R1
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.7134
（5-gagtagccacgctctgtc-3）。
2 结果
2.1 黄鳝TfR1基因cDNA序列分析
以简并引物 de-F/de-R 和黄鳝肝脏 cDNA 为模板
进行 PCR 扩增获得了 1 条约长 1 300 bp 的条带，经
序列测定后认为是 TfR1 基因的 cDNA 片段。经过 5
RACE 和 3 RACE 扩增分别获得了该基因的 5 UTR
区域和 3 UTR 区域，序列拼接后得到了全长 cDNA
序列（GenBank 登录号：KF819396）。序列分析（图 1）
表明，黄鳝 TfR1 基因 cDNA 全长 2 839 bp，5 UTR
长 134 bp，3 UTR 长 380 bp，编码一个长 774 个氨
基酸的多肽链，还包含一个 15 bp 的 poly（A）尾巴。
1
76
151
226
301
376
451
526
601
676
751
826
901
976
1051
1126
1201
1276
1351
1426
1501
1576
1651
1726
1801
1876
1951
2026
2101
2176
2251
2326
2401
2476
2551
2626
2701
2776
1
4
29
54
79
104
129
154
179
204
229
254
279
304
329
354
379
404
429
454
479
504
529
554
579
604
629
654
679
704
729
754
方框表示 N-糖基化位点 ；阴影表示 poly（A）尾巴
图 1 黄鳝 TfR1 基因全长 cDNA 及推断的氨基酸序列
2015,31(7) 135江翱等 ：黄鳝转铁蛋白受体 1 基因的克隆及表达分析
二级结构分析表明，该 TfR1 基因推断的氨基
酸序列没有信号肽序列 ；在开放阅读框内可能存在
着 4 个 N-糖基化位点和 2 个 O-糖基化位点（S107 和
S108）（ 图 1）；跨 膜 区（TM） 位 于 L77 和 H99 之 间，
将 TfR1 基因分成短的 N 端和长的 C 端。C 端含有完
整的 TFR_dimer 域、肽酶 M28 结构域、PA 结构域
和一个小的 SCOP 结构域（图 2）。
将黄鳝 TfR1 基因推断的氨基酸序列与其他物
SCOPTM
Pfam
PA
Pfam
Peptidase_M28
Pfam
TFR_dimer
7006005004003002001000
种的 TfR1 基因用 DNAMAN 软件比对（图 3）发现，
同其他物种 TfR1 基因相比，黄鳝 TfR1 基因与红鳍
东方鲀、青鳉、虹鳟、斑马鱼的同源性较高，分别
达 到 了 68.41%、67.65%、58.90% 和 55.68% ；而 与
人、猪、狞猫和狨等脊椎动物的同源性较低。基于
MEGA4.0 软件的 N-J 法构建的分子进化树（图 4）
表明，黄鳝与其他鱼类的 TfR1 聚于一个分支，同人、
猪等其他脊椎动物亲缘关系较远。
2.2 黄鳝TfR1基因组织特异性表分析
用 RT-CR 法对黄鳝的 10 种组织进行 TfR1 基因
转录本的检测分析，结果（图 5）显示，在所检测
到的 10 种组织里，TfR1 基因表达量有明显差异 ；
在血细胞（Bc）中表达量最高，在肾脏（K）、脾脏（Sp）、
小肠（I）中表达量中等，在皮肤（S）、胃（St）、肝
脏（L）、肌肉（M）、心脏（H）和脑（B）中表达
量较低。
3 讨论
铁离子对生命体至关重要，Tf-TfR 复合物不仅
在调控细胞铁离子代谢吸收平衡及降低 Fe3+ 离子转
化为 Fe2+ 造成的细胞毒性过程中具有重要的作用，
而且在机体系统性免疫机制激活中也具有重要作
用［10］。当病原细菌入侵细胞后，在细胞质外由于大
部分铁离子（Fe3+）被 Tf 分子结合从而导致病原细
菌因缺乏足够游离铁而不能生存 ；这些过量被 Tf 饱
和的铁会通过形成 Tf-2Fe-TfR 复合物的形式通过内
噬作用进入细胞质内参与细胞代谢［11］。
不同物种来源的 TfR1 基因往往具有相类似的
基因结构和功能域［6，12］；相同物种的 TfR1 和 TfR2
基因之间在结构和功能域之间也相对保守［6］，不同
图 2 黄鳝 TfR1 基因功能结构域
之处在于 TfR2 基因 3 UTR 区域往往缺少铁反应元
件（IREs）表达不受铁状态调节［13］。这为采用同源
克隆的方法克隆 TfR 基因提供了便利条件。本研究
就是根据不同物种 TfR1 功能保守区设计简并引物获
得的黄鳝 TfR1 片段，进而获得全长 cDNA。人类的
TfR1 分子是一个同源二聚体分子，每个单体包含有
1 个 760 个氨基酸长的多肽。每个多肽由 1 个长 671
个氨基酸的胞外 C 端、1 个 61 个氨基酸长的胞内 N
端区域和 1 个 28 个氨基酸长的跨膜区 3 个部分组成。
牛的 TfR2 和 TfR1 基因结构域非常保守，唯一的区
别在于 TfR1 基因 C 端含有一个小的 SCOP 区，类似
结构也在人的 TfR1 基因上被发现［6］。本研究发现黄
鳝 TfR1 基因结构上可分为 3 个主要的功能区域，C
端长 675 个氨基酸，N 端长 76 个氨基酸，跨膜区长
22 个氨基酸，在 M129 和 E186 间也存在一个长 58 个
氨基酸的 SCOP 区域。另外，人的 TfR1 的胞外区存
在 3 个 N-糖基化位点和 1 个 O-糖基化位点，这些糖
基化位点是 TfR 执行功能必须的位点［14］。本实验也
在黄鳝 TfR1 分子 C 端发现了 4 个 N-糖基化位点和 2
个 O-糖基化位点，造成这种现象的原因可能是由于
所使用分析软件不同的算法造成的。
人类的 TfR1 基因在除了一些成熟的红细胞和已
终止分化的细胞外的细胞中都可表达，但表达量会
有很大差异［2］。处于不断增值的如肿瘤细胞其 TfR1
的基因表达量会很高，这可能是因为细胞对铁的需
求量增加的原因［15］。人类 TfR2 分子的表达特征与
TfR1 也有不同 ；TfR1 在肝脏中表达较低，而 TfR2
在肝脏中高表达，胃中低表达，其他组织 TfR2 表达
量十分低［12］。林亚秋等［9］的研究表明草鱼的 TfR1
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.7136
基因转录本可在 12 种健康组织中检测到，但脑和鳍
哴匍㓒勽ьᯩ劰䶂勹㲩匏ᯁ傜劬⤘Ӫ⤎⥛⥚ KF819396XP_003975880.1XP_004079020.1CDQ90669.1NP_001009917.1NP_001288776.1BAF84412.1AFM73555.1NP_999166.1哴匍㓒勽ьᯩ劰䶂勹㲩匏ᯁ傜劬⤘Ӫ⤎⥛⥚ KF819396XP_003975880.1XP_004079020.1CDQ90669.1NP_001009917.1NP_001288776.1BAF84412.1AFM73555.1NP_999166.1哴匍㓒勽ьᯩ劰䶂勹㲩匏ᯁ傜劬⤘Ӫ⤎⥛⥚ KF819396XP_003975880.1XP_004079020.1CDQ90669.1NP_001009917.1NP_001288776.1BAF84412.1AFM73555.1NP_999166.1哴匍㓒勽ьᯩ劰䶂勹㲩匏ᯁ傜劬⤘Ӫ⤎⥛⥚ KF819396XP_003975880.1XP_004079020.1CDQ90669.1NP_001009917.1NP_001288776.1BAF84412.1AFM73555.1NP_999166.1哴匍㓒勽ьᯩ劰䶂勹㲩匏ᯁ傜劬⤘Ӫ⤎⥛⥚ KF819396XP_003975880.1XP_004079020.1CDQ90669.1NP_001009917.1NP_001288776.1BAF84412.1AFM73555.1NP_999166.1哴匍㓒勽ьᯩ劰䶂勹㲩匏ᯁ傜劬⤘Ӫ⤎⥛⥚ KF819396XP_003975880.1XP_004079020.1CDQ90669.1NP_001009917.1NP_001288776.1BAF84412.1AFM73555.1NP_999166.1哴匍㓒勽ьᯩ劰䶂勹㲩匏ᯁ傜劬⤘Ӫ⤎⥛⥚ KF819396XP_003975880.1XP_004079020.1CDQ90669.1NP_001009917.1NP_001288776.1BAF84412.1AFM73555.1NP_999166.1
87
87
87
120
84
76
76
79
79
193
195
195
230
191
192
192
201
198
307
309
309
343
304
309
309
318
317
423
425
425
459
426
427
427
436
435
541
542
541
580
545
541
541
550
549
660
662
657
698
660
650
650
659
658
774
772
767
808
770
760
760
769
768
图 3 黄鳝 TfR1 基因推断的氨基酸序列与其他物种的比较哴匍KF819396㓒勽ьᯩ劰XP_003975880.1䶂勹XP_004079020.1㲩匏CDQ90669.1ᯁ傜劬NP_001009917.1⤘NP_001288776.1
0.05
100
100
87
98
99
56 ӪBAF84412.1⤎⥛AFM73555.1⥚NP_999166.1
图 4 基于 N-J 法构建的分子遗传进化树
TfRl
S Sp St K L Bc B I H M Marker
500
bp
250
100
500
250
100
β-actin
S ：皮肤 ：Sp ：脾脏 ：St ：胃 ：K ：肾脏 ：L ：肝脏 ：Bc ：血液 ：B ：脑 ：I ：肠 ：
H ：心脏 ：M ：肌肉 ；Marker ：DNA Marker
图 5 黄鳝 TfR1 基因的组织表达分析
2015,31(7) 137江翱等 ：黄鳝转铁蛋白受体 1 基因的克隆及表达分析
中的表达量最高，肝脏等组织表达量中等，而黏液
与鱼鳔中的表达量最低。张立春等［6］发现牛的 TfR2
基因主要在肝脏组织中表达，其他器官如脾脏、心
脏和肠道也有少量表达，这个结果与人的组织分布
规律基本一致，从而在一定程度上证明了不同物种
TfR 基因功能的保守性。本研究发现，在黄鳝的 10
种健康组织里，血细胞的表达量最高，而肝脏、脾脏、
心脏、肌肉、肾脏和小肠等组织里 TfR1 基因转录本
都较低的表达 ；这也与人类和草鱼 TfR1 基因表达情
况类似 ；在血细胞里的表达量比较高的原因可能是
血细胞形成需要更大量的铁，因为血红素细胞铁的
含量占成体铁含量总量比重较高［2］。
4 结论
本研究通过同源克隆结合 RACE 技术克隆得到
了黄鳝 TfR1 类分子全长 cDNA 序列，该基因与已知
鱼类 TfR1 基因具有较高的同源性，具有其他物种
TfR1 基因相类似的结构功能区域和糖基化位点，是
脊椎动物 TfR 家族中一个新成员。该基因在黄鳝不
同健康组织里具有不同的表达水平，血细胞中表达
量最高，而在肝脏、脾脏和小肠等组织里表达量较低。
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（责任编辑 马鑫）