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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 11 期
长江中下游黄鳝遗传多样性的微卫星分析
周宇芳 胡杭娇 张龙韬 舒妙安
(浙江大学动物科学学院，杭州 310058)
摘 要: 为了解我国长江中下游地区野生黄鳝(Monopterus albus)的种质资源现状，利用黄鳝微卫星分子标记分析我国
长江中下游 4 个黄鳝野生群体(湖北群体、安徽群体、江苏群体和浙江群体)的遗传多样性水平。通过磁珠富集法获得 50 个
黄鳝微卫星序列，设计并合成了 30 对微卫星引物，经筛选得到 8 对多态性稳定的引物，均为高度多态位点。每对引物扩增得
到等位基因数 12 － 26，平均等位基因数 17。4 个群体的平均多态信息含量分别为 0. 804、0. 864、0. 824 和 0. 736，平均等位基因
数分别为 9. 13、11. 00、9. 00 和 7. 25，平均期望杂合度分别为 0. 865、0. 918、0. 882 和 0. 813，表明 4 个黄鳝群体遗传多样性丰
富，其中安徽群体遗传多样性水平最高，浙江群体相对较低。4 个群体间遗传分化指数(FST)为 0. 031 2 － 0. 096 5，6. 28%的遗
传变异存在于群体间，表明 4 个群体间存在一定的遗传分化。聚类分析显示，浙江群体与安徽群体先聚在一起，再与江苏群体
聚为一支，湖北群体单独聚为一支。
关键词: 黄鳝 磁珠富集法 微卫星标记 遗传多样性
Microsatellite Analysis of Genetic Diversity of Monopterus albus
Along the Middle and Lower Reaches of Yangtze River Basin
Zhuo Yufang Hu Hangjiao Zhang Longtao Shu Miaoan
(College of Animal Science，Zhejiang University，Hangzhou 310058)
Abstract: In order to explore the genetic diversity and genetic structure of Monopterus albus in different areas，we had developed
some microsatellite markers with magnetic beads，and used them to evaluate genetic variation in four wild populations of Monopterus al-
bus(Hubei，Anhui，Jiangsu and Zhejiang)along the middle and lower reaches of the Yangtze River Basin． Sixty-four positive clones were
selected and sequenced，getting fifty microsatellite sequences． Thirty pairs of primers were synthesized，and eight polymorphic microsat-
ellite markers were screened out． All the eight markers were high polymorphic loci． The mean polymorphic information content of Hubei，
Anhui，Zhejiang and Jiangsu population was 0. 804，0. 864，0. 824 and 0. 736，respectively;mean number of alleles was 9. 13，11. 00，
9. 00 and 7. 25，respectively;mean expected heterozygosity was 0. 865，0. 918，0. 882 and 0. 813，respectively. Results showed that all
four populations had abundant genetic diversity，and Anhui population was the highest among them，Zhejiang population was the poorest．
The genetic differentiation coefficient(FST)among four populations was from 0. 031 2 to 0. 096 5，which showed moderate values of ge-
netic differentiation among populations． Analysis of molecular variance(AMOVA)revealed that the variation within populations was
93. 72%，whereas the variation among populations explained 6. 28% of the total variation． Cluster analysis indicated that Zhejiang，An-
hui and Jiangsu populations were clustered as one，while Hubei population was as an independent cluster．
Key words: Monopterus albus Enrichment by magnetic beads Microsatellite markers Genetic diversity
收稿日期:2011-04-14
基金项目:国家公益性行业农业专项(201003076)
作者简介:周宇芳，女，硕士研究生，研究方向:水产动物遗传育种;E-mail:daisychou@ zju． edu． cn
通讯作者:舒妙安，男，副教授，研究方向:水产动物遗传育种;E-mail:shuma@ zju． edu． cn
黄鳝(Monopterus albus)隶属于硬骨鱼纲合鳃目
合鳃科，主要生活于稻田、沟渠、池塘和湖泊等水域
中，是我国重要淡水名优鱼类之一，广泛分布于我国
湖北、湖南、四川、江西、安微、江苏和浙江等省。由
于黄鳝具有性逆转特性，再加上怀卵量较少等原因，
目前黄鳝人工繁育苗种数量有限，黄鳝养殖所需苗
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 11 期
种主要依赖于野生苗种［1］。然而，由于栖息环境恶
化、过度捕捞等原因，野生黄鳝数量越来越少［2］。
因此，有必要对我国黄鳝不同地理群体的遗传多样
性进行研究，以了解我国黄鳝种质资源现状。目前，
已有利用同工酶［3］、RAPD［4 － 6］及 mtDNA［7，8］对我
国江西、湖南、四川及福建等不同地理群体黄鳝的遗
传多样性分析的报道，但有关长江中下游地区不同
地理群体黄鳝的遗传多样性研究尚未见报道。
微卫星(Microsatellite)是一种多态性丰富、重复
性好、共显性的分子标记，广泛应用于水产动物遗传
多样性分析［9，12］、亲缘关系鉴定［13，14］等方面研究。
目前，有关黄鳝微卫星的筛选工作虽已有报
道［15 － 17］，但所获微卫星数量有限。因此，本研究通
过磁珠富集法自主筛选了一批黄鳝微卫星标记，并应
用于我国长江中下游地区 4 个黄鳝不同地理群体的
遗传多样性分析，为进一步了解我国黄鳝种质资源情
况以及开展良种培育提供一些基础资料。
1 材料与方法
1. 1 材料
黄鳝野生群体分别采自湖北荆州(HB，33 尾)、
安徽芜湖(AH，33 尾)、江苏泰州(JS，33 尾)、浙江
德清(ZJ，30 尾)等天然水域。活体运回实验室后，
尾部采血 5 mL，EDTA抗凝，－ 70℃保存。
1. 2 方法
1. 2. 1 基因组 DNA 的提取及酶切 采用苯酚 /氯
仿抽提法提取黄鳝基因组 DNA。取 1 μg 基因组
DNA用限制性内切酶 MboⅠ酶切，1. 0%琼脂糖凝
胶电泳检测，切下 400 － 900 bp 大小的片段，AxyPrep
DNA凝胶回收试剂盒(上海生工生物工程有限公
司)进行回收备用。
1. 2. 2 微卫星筛选 酶切纯化产物与接头(A:5-
GATCGTCGACGGTACCGAATTCT-3;B:5-GTCAAGA
ATTCGGTCGGTACCGTCGAC-3)相连。以连接产物
(2 μL)为模板，PrimerB(0. 5 μL)为引物，25 μL反应
体系进行 PCR扩增，程序为:72℃预延伸 2 min，94℃
预变性 3 min;94℃变性 1 min，58℃退火 1 min，72℃
延伸 1 min，28个循环;最后 72℃延伸10 min。
建立 50 μL 反应体系:探针［(CA)16-biotin］
(10 μmol /L)1. 5 μL，PrimerB(50 μmol /L)5 μL，20
× SSC 15 μL，10% SDS 0. 5 μL，ddH2O 3 μL，68℃
预热待用。取连有接头的扩增产物 25 μL 95℃变性
5 min 后加入预热的杂交混合液中，68℃杂交 1 h。
杂交过程中平衡磁珠，然后将含生物素探针的杂交
液加入平衡好的磁珠中，25℃温育 20 min，通过磁珠
将微卫星序列吸附出来。
PCR扩增捕获的微卫星片段，经蓝白斑克隆筛
选，所得阳性克隆送至南京金斯瑞有限公司测序。
去除载体及接头序列后，挑取两侧翼区足够长的
微卫星序列，用 Oligo6. 0 软件进行引物设计，引物
由上海英潍捷基生物公司合成。以混合 DNA样品
为模板，对微卫星引物进行 PCR条件优化，从中选
择扩增稳定、条带清晰且具有多态性的微卫星
引物。
1. 2. 3 遗传多样性分析 利用筛选获得的多态性
引物对长江中下游地区 4 个黄鳝不同地理群体进行
遗传多样性分析。PCR 反应体系 15 μL:10 × PCR
buffer 1. 5 μL，Mg2 + (25 mmol /L)1. 2 μL，dNTP
(10 mmol /L)0. 3 μL，正反向引物(10 μmol /L)0. 3
μL，Taq酶(5 U)0. 2 μL，基因组 DNA(50 ng /μL)1
μL，ddH2O 10. 2 μL。反应程序:94℃预变性 5 min;
94℃变性 40 s，退火 40 s(具体退火温度见表 1) ，
72℃延伸 40 s，30 个循环;最后 72℃延伸 10 min，
PCR扩增产物经 8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和
银染法检测，Tannon凝胶成像系统中观察并照相。
1. 2. 4 数据统计 根据每个个体产生的条带位置
确定其基因型。用 PopGene3. 2 软件分析等位基因
数(A)、有效等位基因数(Ne)、观测杂合度(Ho)、期
望杂合度(He)、遗传相似系数、Nei 氏遗传距离［18］、
Hardy-Weinberg平衡等;多态信息含量(PIC)参照
Bostein等［19］的公式计算:
PIC = 1 －∑
n
i = 1
Pi
2 －∑
n－1
i = 1
∑
n
j = i+1
2Pi
2Pj
2
式中 Pi、Pj分别为群体中第 i和第 j个等位基因
频率，n 为某一基因座上等位基因数。用 Arle-
quin3. 1 软件［20］计算群体间遗传分化系数(FST值) ，
进行遗传分子方差分析(AMOVA)。根据遗传距离
利用 MEGA4. 0 软件［21］构建 UPGMA聚类图。
2 结果
2. 1 克隆与测序
挑取 64 个阳性克隆测序，得到 50 个微卫星序
881
2011 年第 11 期 周宇芳等:长江中下游黄鳝遗传多样性的微卫星分析
列，其 中 (CA /GT)n 46 个，占 92%; (ACC)n、
(TTAT)n、(AG)n、(CT)n各 1 个，分别占 2%。根据
Weber［22］提出的分类标准将这些微卫星序列进行
归类，其中完全型微卫星 49 个(98%) ，复合型微卫
星 1 个(2%)。重复次数在 11 － 20 次之间的微卫
星 29 个(58%) ，20 次以上的微卫星 13 个(26%) ，
最高重复次数为 36 次。
2. 2 微卫星引物扩增
在 50 个微卫星序列中，除少数因本身结构或两
端太短不能设计引物外，其余均可根据微卫星的侧
翼序列设计引物，用 Oligo6. 0 软件设计引物 30 对，
经优化 PCR扩增条件及混合 DNA 样检测，从中筛
选出 8 对扩增稳定、条带清晰且具有多态性的微卫
星引物，筛选结果见表 1。图 1 为浙江群体部分个
体的 SSR扩增图谱。8 对微卫星引物在 4 个黄鳝群
体中共扩增获得 136 个等位基因，平均等位基因数
(A)为 17，多态信息含量(PIC)为 0. 571 － 0. 911
(表 2)。
表 1 八对黄鳝微卫星引物信息
位点 重复单元 引物(5 － 3) 退火温度(℃) 产物大小(bp)
Ma73 (CA)18
F:CATTTCTCAGATTCACCCA
R:GTATGAGCCACTGAAGAGG
59 127 － 262
Ma32 (CA)18
F:GAGGTCGTTCAGTTCAAT
R:AACAAAACAGGTGGACAGA
59 124 － 277
Ma59 (AC)21
F:CTCAGTGATTCCAGTGCC
R:CGCACTGCTTTCTAAACT
59 106 － 169
Ma84 (TG)29
F:GTGAGTTATTTTGGTCCTG
R:GCACAGTGTTCTAGCACAA
59 256 － 395
Ma15 (TG)21
F:CACCTCCCTGCTGGAATGT
R:GTCGTACACAGCCTTGCC
64 353 － 435
Ma74 (CA)13
F:ACTGCCATGTCCACTAAG
R:GGTCTATACAGACAGAGGCT
64 225 － 296
Ma72 (GA)12(GC)4(GT)10
F:AGTTCAGGTGAACATGCA
R:GCAGCAGGGGATATTGAG
60 148 － 202
Ma70 (GT)19
F:AGGTCGCCGACTTTAACG
R:AAGGCGTTCAGCAGACTC
60 251 － 338
图 1 浙江群体部分个体在Ma72 位点的 SSR扩增电泳图谱
981
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 11 期
2. 3 群体内遗传多样性
4 个群体的遗传多样性信息如表 2 所示，每个
群体产生的等位基因数(A)为 3 － 15，有效等位基
因数(Ne)为 2. 78 － 12. 10，其中，安徽群体的平均
A 与平均 Ne 最多(11. 00，8. 29) ，浙江群体最少
(7. 25，5. 55)。4 个群体中，平均观测杂合度(Ho)
最高的是湖北群体(0. 709) ，浙江群体最低
(0. 589) ，平均期望杂合度(He)最高的是安徽群
体(0. 918) ，浙江群体最低(0. 813) ;平均多态信
息含量(PIC)最高的是安徽群体(0. 864) ，浙江群
体最低(0. 736)。Hardy-Weinberg 平衡检测发现，
除了浙江群体在 Ma59 和 Ma72 位点上显著偏离
了平衡，其它各位点在不同地理群体中均达到
平衡。
表 2 四个黄鳝群体的遗传多样性信息
Ma73 Ma32 Ma59 Ma84 Ma15 Ma74 Ma72 Ma70 平均值
湖北 A 12 7 9 13 8 10 9 5 9. 13
Ne 10. 08 5. 26 4. 57 9. 31 6. 25 7. 81 6. 37 2. 94 6. 57
Ho 0. 727 0. 909 0. 455 0. 909 0. 500 0. 818 0. 455 0. 900 0. 709
He 0. 944 0. 848 0. 818 0. 935 0. 884 0. 913 0. 883 0. 695 0. 865
PIC 0. 893 0. 784 0. 762 0. 883 0. 821 0. 859 0. 826 0. 601 0. 804
P 0. 983 0. 349 0. 540 1. 000 0. 238 0. 908 0. 344 0. 052
安徽 A 14 11 9 13 9 12 10 10 11. 00
Ne 9. 31 8. 07 7. 81 11. 00 6. 37 8. 34 8. 07 7. 33 8. 29
Ho 0. 727 0. 727 0. 455 0. 818 0. 545 0. 909 0. 636 0. 545 0. 670
He 0. 935 0. 918 0. 913 0. 952 0. 883 0. 922 0. 918 0. 905 0. 918
PIC 0. 884 0. 864 0. 858 0. 902 0. 826 0. 869 0. 863 0. 849 0. 864
P 1. 000 0. 950 0. 202 0. 992 0. 578 0. 995 0. 653 0. 582
江苏 A 9 6 8 15 9 7 8 10 9. 00
Ne 8. 07 5. 26 5. 63 12. 10 6. 05 5. 26 5. 63 6. 54 6. 82
Ho 0. 636 0. 909 0. 545 0. 909 0. 455 0. 727 0. 455 0. 545 0. 648
He 0. 918 0. 848 0. 861 0. 961 0. 874 0. 848 0. 861 0. 887 0. 882
PIC 0. 863 0. 782 0. 800 0. 911 0. 818 0. 784 0. 800 0. 831 0. 824
P 0. 318 0. 066 0. 394 1. 000 0. 347 0. 069 0. 126 0. 761
浙江 A 13 5 3 10 9 8 4 6 7. 25
Ne 10. 53 2. 63 2. 78 9. 52 6. 06 5. 59 3. 51 3. 76 5. 55
Ho 0. 800 0. 800 0. 000 0. 900 0. 400 0. 889 0. 300 0. 625 0. 589
He 0. 953 0. 653 0. 674 0. 942 0. 879 0. 869 0. 753 0. 783 0. 813
PIC 0. 897 0. 571 0. 563 0. 885 0. 815 0. 798 0. 665 0. 693 0. 736
P 1. 000 0. 281 0. 000＊＊ 0. 910 0. 393 0. 585 0. 003＊＊ 0. 531
A．等位基因数;Ne．有效等位基因数;Ho．观测杂合度;He．期望杂合度;PIC．多态信息含量;＊＊表示差异极显著(P ＜ 0. 001)
2. 4 群体间遗传变异
4 个黄鳝群体的遗传分化系数(FST)和 Nei’s
遗传距离见表 3。从表 3 可以看出，浙江群体和安
徽群体遗传距离最小，浙江群体和湖北群体遗传距
离最大;群体间遗传分化系数 FST介于 0. 031 2 －
0. 096 5，群体间存在一定的遗传分化。
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2011 年第 11 期 周宇芳等:长江中下游黄鳝遗传多样性的微卫星分析
表 3 四个黄鳝群体的 Nei氏遗传距离和 F-统计量
群体 湖北 安徽 江苏 浙江
湖北 0. 031 2 0. 072 4 0. 096 5
安徽 0. 660 5 0. 041 8 0. 062 1
江苏 0. 872 0 0. 658 4 0. 077 6
浙江 0. 937 9 0. 643 9 0. 756 7
对角线以下为 Nei氏遗传距离，对角线以上为遗传分化系数 FST
4 个群体间遗传变异的 AMOVA 分析如表 4 所
示，93. 72%的遗传变异存在于群体内，6. 28%的遗
传变异存在于群体间，群体间遗传分化差异极显著
(P ＜ 0. 001)。
表 4 四个黄鳝群体的分子方差分析
变异来源 自由度 平方和 方差组分 方差比例
群体间 3 22. 234 0. 203 58 6. 28＊＊
群体内 82 248. 932 3. 035 75 93. 72＊＊
总变异 85 271. 163 3. 239 33
＊＊表示差异极显著(P ＜ 0. 001)
基于 Nei’s 遗传距离构建的 UPGMA 聚类图
(图 2)显示，浙江群体与安徽群体先聚在一起，再与
江苏群体聚为一支，湖北群体单独聚为一支。
图 2 四个黄鳝群体的 UPGMA聚类图
3 讨论
3. 1 微卫星序列特征及多态性分析
微卫星标记的筛选是以其不同核心重复序列在
基因组中的丰度为基础的。目前有关研究认为，鱼
类基因组一般都含有丰富的 CA/GT 重复序列，草鱼
(Ctenopharyngodon idella)中(CA/GT)n占84. 62%
［23］，
团头鲂(Megalobrama amblycephala)88. 3%［24］，大
口鲶(Silurus meridionalis)96. 54%［25］。本研究中，
黄鳝以 CA /GT 为单位的重复序列占 92%，与上述
研究结果相似，这为利用磁珠富集法富集鱼类微卫
星 DNA时设计核心探针序列提供了理论依据。此
外，本研究检测到的黄鳝完全型微卫星序列最丰富，
这与草鱼(69. 23%)［23］、团头鲂(53. 15%)［24］、大
口鲶(75. 76%)［25］等淡水鱼类中完全型微卫星最
丰富结果一致。
多态信息含量(PIC)能反映出某个遗传标记所
含的或能提供的遗传信息容量，是衡量微卫星序列
多态性的较好指标。Botstein 等［19］指出，当 PIC ＞
0. 5 时，该位点为高度多态位点;0. 25 ＜ PIC ＜ 0. 5 时
为中度多态位点;PIC ＜ 0. 25 时为低度多态位点。
本研究中，8 个微卫星位点的 PIC为 0. 571 － 0. 911，
均表现为高度多态。由此说明，本研究中所筛选的
黄鳝微卫星标记可作为有效的遗传标记应用于黄鳝
群体遗传学研究。
3. 2 群体遗传多样性分析
群体遗传多样性是评价物种资源状况的一个重
要依据，是物种适应多变的环境条件、维持长期生存
和进化的基础。多态信息含量(PIC)、等位基因数
(A)、杂合度(Ho与 He)等都是反映群体遗传多样性
的重要参数，其数值越大，说明群体遗传多样性越丰
富。本研究中，4个黄鳝群体的平均 PIC 为0. 807，平
均 A为 9. 10，平均 Ne为 6. 81，平均 Ho和 He为 0. 654
和 0. 870，由此可知长江中下游地区 4 个黄鳝群体的
遗传多样性水平丰富。贺顺连等［4］利用 RAPD 技术
分析中国湖南、缅甸及印度尼西亚黄鳝的遗传多样
性，结果显示，3 种黄鳝间多态位点比例达 85. 08%，
遗传多样性指数为 0. 157 5，3个群体都具有丰富的遗
传多样性;尹绍武等［5］利用 RAPD技术分析湖南洞庭
湖野生黄鳝的遗传结构，结果表明黄鳝野生群体多态
位点比例为 44. 79%，平均杂合度为 0. 215 5，遗传变
异水平较高;鲁双庆等［15］利用远缘种鲤的微卫星引
物对湖南、广东、孟加拉 3 个地域黄鳝群体进行分析
得出平均等位基因数为 6. 5，认为 3 个黄鳝群体基因
多态性较高。上述研究均表明，目前我国黄鳝野生资
源的遗传多样性较丰富，种质资源处于较好状态，具
有较丰富的遗传改良的潜力。
本研究中，综合 4 个黄鳝群体的 A、Ho、He 和
PIC等遗传参数(表 2)发现，安徽群体的遗传多样
性最为丰富，江苏群体和湖北群体次之，而浙江群体
相对较低。究其原因，可能与当地的资源状况、自然
环境条件及人为因素有关。浙江黄鳝市场需求量
大，但人工养鳝规模小，所需黄鳝主要由外省输入及
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 11 期
采捕本地野生黄鳝，由此浙江本地的野生黄鳝资源
面临较大的捕捞压力。Hardy-Weinberg 平衡检验发
现，只有浙江群体在 Ma59 和 Ma72 两位点上出现显
著偏离，进一步反映浙江群体可能存在一定程度的
近交积累或遗传漂变，应加强浙江野生黄鳝种质资
源的合理利用和保护。
3. 3 群体间遗传变异分析
遗传分化系数是表征群体间遗传分化程度的重
要参数，Wright［26］指出，当 FST在 0. 01 －0. 05时，群体
间遗传分化较弱;在 0. 05 － 0. 15 时，遗传分化中等;
在 0. 15 －0. 25时，遗传分化较大。本研究中，4个黄鳝
群体间 FST为 0. 031 2 －0. 096 5，说明野生黄鳝群体间
遗传分化水平中等。黄鳝不同地理群体出现一定的遗
传分化，这可能与黄鳝的生活习性有关，黄鳝属穴居性
鱼类，个体迁移范围有限，因此在一定程度上限制了基
因的交流，长期的地理隔离可能导致黄鳝群体遗传结
构发生一定的变化。此外，穴居性鱼类易受人为捕捞
等因素的影响，容易产生瓶颈效应，加快群体间的遗传
分化速度。由不同地理群体间遗传距离来看，浙江与
安徽群体具有较近的遗传距离，湖北和浙江群体遗传
距离最远，由此可预测，在生产上可利用浙江和湖北的
黄鳝群体进行杂交育种以获得最大的杂种优势。
参 考 文 献
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(责任编辑 马鑫)
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