全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第10期
收稿日期 : 2012-06-15
基金项目 : 烟草基因组计划重大专项研究项目［110201101009（JY-03）, 110200902036］
作者简介 : 刘峰 , 男 , 博士研究生 , 研究方向 : 基因组学与蛋白质组学 ; E-mail: caas666@126.com
并列第一作者 : 刘贯山 , 男 , 研究员 , 研究方向 : 烟草抗逆分子育种 ; E-mail: liuguanshan2002@163.com
通讯作者 : 路铁刚 , 男 , 研究员 , 研究方向 : 植物功能基因组学 ; E-mail: tiegang@caas.net.cn
王元英 , 男 , 研究员 , 研究方向 : 烟草遗传育种 ; E-mail: wyytob@126.com
烟草是目前研究最多的高等植物之一，是世界
范围内种植的重要经济作物，烟草基因组测序将大
大加快烟草功能基因组学的研究，在全基因组水平
上诱发突变体的产生以及突变体材料的收集为功能
基因组学的研究搭建了技术平台［1］。烟草功能基因
组学的研究对烟草突变体材料的需求将会大大增加，
而目前国内外有关烟草突变体库的报道甚少［2］。因
此加快创建烟草突变体库，在较短时间内实现对烟
草功能基因组的系统研究以及重要基因的克隆，对
于阐明烟草重要农艺性状形成的分子机制及培育烟
草新品种都具有重要的战略意义。
烟草激活标签突变体库的创制和突变表型的初步鉴定
刘峰1 刘贯山2 张芊1 王卫锋2 丁昌敏2 吕婧2 路铁刚1 王元英2
（1 中国农业科学院生物技术研究所，北京 100081 ；2 中国农业科学院烟草研究所，青岛 266101）
摘 要： 突变体库在烟草功能基因组研究中具有重要的作用，本研究建立了快速、高效农杆菌介导的烟草遗传转化体系，
目前已经创制了 3万份激活标签（pSK1015）突变体。利用 PCR扩增对突变体库进行阳性检测，扩增结果表明其阳性率接近 90%。
大田 T1代可视突变表型调查结果表明，在团棵期具有可视突变表型的概率为 5.4%，在现蕾期具有可视突变表型的概率为 3.6%。
关键词： 烟草 突变体库 激活标签 表型
Construction and Phenotype Analysis of Tobacco Mutant Library by
Activation Tagging
Liu Feng1 Liu Guanshan2 Zhang Qian1 Wang Weifeng2 Ding Changmin2
Lü Jing2 Lu Tiegang1 Wang Yuanying2
（1Biotechnology Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081；2 Tobacco Research Institute，Chinese
Academy of Agricultural Sciences，Qingdao 266101）
Abstract: Mutants play important roles in tobacco functional genomic research. We established a rapid and efficient Agrobacterium
tumefaciens mediated tobacco transformation protocol and have generated approximately 30 000 independent activation tagging lines with
pSK1015 that possessed resistance to the herbicide glufosinate. PCR analysis showed that about 90% Basta resistant plant were transgene-
positive plant. Field phenotyping of part of the activation tagging populations in T1 generations showed that approximately 5.4% and 3.6% of
activation-tagged lines showed visible phenotypes at resettling stage and squaring stage, respectively.
Key words: Tobacco Mutants Activation tagging Phenotype
目前在全基因组水平上利用物理化学诱变［3］、
插入突变包括 T-DNA 插入突变［4-6］和转座子插入突
变［7-9］等方法创制功能缺失型突变体以及利用激活
标签技术（activation tagging technology）和 FOX 捕获
系统（Full-length cDNA Over-eXpression gene hunting
system）创制功能获得型突变体［10-13］已经成为人工
创制突变体的主要途径。激活标签技术是 T-DNA 插
入突变的一种，由于其载体携带多聚化的 CaMV 35S
增强子，可以增强插入位点旁侧基因的表达而产生
显性表型。此方法已成功应用于拟南芥和水稻的功
能基因组研究，克隆了多个重要的基因，例如油菜
2012年第10期 181刘峰等 ：烟草激活标签突变体库的创制和突变表型的初步鉴定
素内酯（BR）信号途径中的 BRS1［14］和 BAK1 基
因［15］，编码生长素合成过程的 1 个限速酶基因
YUCCA［16］，水稻 BR 信号途径下游 OsILI1 和 IBP16
基因［17］。
本研究构建烟草农杆菌高效转化体系，创建烟
草激活标签突变体库，初步鉴定突变体的表型，旨
在为烟草功能基因组学研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
烟草材料（红花大金元）由中国农业科学院烟
草研究所提供。宿主农杆菌 LBA4404 由本实验室保
存，载体 pSKI015 为本实验室保存（图 1）。
75% 酒精震荡灭菌 1.5 min，50%（V/V）次氯酸钠 +
1 滴 Tween20 震荡灭菌 2 次，15 min/ 次，无菌水清
洗 3 次以上，灭菌的种子干燥之后均匀铺在萌发培
养基上，10 d 左右将小苗移栽到移苗培养基上培养，
温度 25-28℃，光照 16 h/d 下，光照强度 2 000 lx。
1.2.2 烟草叶盘法转化
1.2.2.1 农杆菌活化和收集 将 -80℃冰箱内保存的
农杆菌（含载体 pSKI015）加到 200 mL 的液体 YEB
中，再加入 200 μL 的 20 mg/L 氨苄青霉素（Amp）
和 200 μL 的 20 mg/L 利福平（Rif）。在温度为 28℃，
260 r/min的黑暗条件下振荡培养至OD600 值约为0.8，
5 000 r/min 离心 5 min 收集农杆菌，然后利用含有
10 mg/L 乙酰丁香酮（AS）的 MS0 液体培养基重悬，
调整至 OD600 值 0.8 备用。
1.2.2.2 叶盘法转化 当烟草无菌苗生长至 30-40
d 时，选择生长健壮，叶脉清晰的叶片用剪刀剪成
0.6 cm2 的叶盘。将叶盘浸泡在农杆菌悬浮液中 8-10
min，然后用滤纸吸取残余菌液，叶脉朝上平铺于共
培养培养基上（G）。
1.2.2.3 共培养 在共培养培养基上26℃暗培养3 d。
1.2.3 选择分化培养 将共培养的叶盘转入选择分
化培养基Ⅰ（S1）中暗培养两周左右，待叶盘周围
长出芽点后转入光下培养一周。将芽点和连带的部
分叶盘一起转移至选择分化培养基Ⅱ（S2），在光
下培养一周。将单个嫩芽转移至选择分化培养基Ⅲ
（S3），在光下培养一周，芽长成幼嫩小苗（表 1）。
pUC19. pUC19 序列；BAR. Basta 选择标记；T3. T3 RNA 聚合酶启动子；
T7. T7 RNA 聚合酶启动子 ；LB. T-DNA 左边界 ；RB. T-DNA 右边界 ；
4×35S. 4 个串联重复的 CaMV 35S 增强子
图 1 激活标签载体 pSKI015
表 1 培养基配方（1 L）
MS 大量 20×
（mL）
MS 微量 1000×
（mL）
MS 有机 1000×
（mL）
MS 铁盐 200×
（mL）
MES
（g）
蔗糖
（g）
6-BA
（mg）
IAA
（mg）
Cef
（mg）
Basta
（mg） pH
萌发 50 1 1 5 30 5.8
移苗 25 0.5 1 2.5 0.5 30 5.8
MS0 50 1 1 5 30 5.8
G 50 1 1 5 0.5 30 1 0.1 5.8
S1 50 1 1 5 0.5 30 1 0.1 500 3 5.8
S2 50 1 1 5 0.5 30 0.5 0.05 500 5 5.8
S3 50 1 1 5 0.5 30 0.2 0.02 500 10 5.8
R 50 1 1 5 0.5 30 500 40 5.8
1.2.4 生根培养 将 S3 培养基上幼嫩小苗转移至生
根培养基上（R），光下培养 10 d，待移栽。
1.2.5 幼苗移栽 幼苗首先移栽至温室培养，在移
栽之前营养土连同营养盘一起放到 1 000 倍移栽灵
1.2 方法
1.2.1 种子灭菌及无菌苗种植 取烟草种子，于
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第10期182
液体中浸泡，在移栽之后用塑料薄膜小工棚覆盖，
提高移栽成活率，待幼苗健壮之后再移栽大田。
1.2.6 转基因烟草 PCR 检测 利用 CTAB 法提取 T0
代烟草叶片基因组 DNA 进行 PCR 检测，利用载体
pSKI015自身携带的CaMV 35S增强子序列设计引物，
引物如下：正向引物序列 5-GACTCACTATAGGGCG-
AATTG-3；反向引物序列 5-GATATCACATCAATCC-
ACTTGC-3。预扩增片段大小为 395 bp。反应扩增程
序：94℃预变性 5 min；94℃变性 30 s，58℃退火 30 s，
72℃延伸40 s，30个循环；72℃延伸5 min。电泳检测。
1.2.7 转基因烟草突变体鉴定 分别在廊坊育种基
地和中国农业科学院烟草研究所实验基地（山东省
即墨市石门镇邹家蒲渠村）种植转基因 T0 与 T1 代，
T0 的植株单株种植，T1 植株于 T0 代单株收获后单行
种植，每行 15 株。T1 植株参试材料共计 8 528 份，
2011 年 3 月 22 日托盘育苗，5 月 3日-6 日假植，6
月 10日-14 日移栽。T1 代试验材料生长至团棵期和
现蕾期时，主要对株高、生长势、叶数、茎叶夹角、
叶长、叶宽、叶色等植物学性状进行调查，并对典
型突变单株照相。田间管理按正常烤烟生产进行，
不打顶不抹杈。
2 结果
2.1 烟草激活标签突变体库创制
我们利用含有激活标签载体 pSKI015 的农杆菌
菌株 LBA4404，转化叶龄为 30-40 d 的烟草无菌苗
叶盘，26℃黑暗条件下培养 3 d，经过 3 次继代培养
（S1，S2，S3）之后在不含激素的生根培养基上培养
10 d，然后将生根苗移栽到温室大棚，待苗子健壮
之后移栽大田（图 2），单株收获 T0 种子并保存。截
止目前为止已完成 3 万份烟草激活标签突变体 T0 的
大田移栽工作，并已经收获 1.6 万份 T0 种子，另有
3 万多份转基因烟草组培苗在组培室进行培养，即
将移栽温室大棚。
图 2 农杆菌介导的烟草叶盘法转化流程图
2.2 烟草激活标签突变体阳性率检测
对不同批次得到的转基因烟草植株 T0 随机取样
进行 PCR 检测（图 3），共检测样品 2 000 份，其中
阳性植株为 1 756 份，阳性率为 87.8%。
在继代培养过程中（S1-S2-S3-R），筛选标记
Basta 的浓度依次提高（3 mg/L-5 mg/L-10 mg/L-40
mg/L），形成了一个 Basta 选择压，确保了转基因烟
草植株 T0 的高阳性率。
2.3 烟草激活标签突变体可视突变表型初步鉴定
参试烟草激活标签突变体 T1 材料共计 8 528
份，采用托盘育苗，实际出苗 7 847 份，出苗率为
92.0%，实际移栽 7 847 份。团棵期调查结果（表 2）
2012年第10期 183刘峰等 ：烟草激活标签突变体库的创制和突变表型的初步鉴定
表明，在突变群体中，可视突变表型主要集中在株
高、生长势、叶形、叶色、节间距等性状上发生改
变，其中株高变矮较为常见，在突变群体中的突变
率为 11.2‰，各种突变表型累计突变率为 5.4%。图
4 为团棵期部分突变单株。现蕾期对突变单株的调
查表明，可视突变表型主要集中在株高、叶面、叶色、
节间距、花期等几个方面（表 3），各种突变表型累
计突变率为 3.6%。现蕾期部分突变单株见图 5。
M. DNA Marker ； +. 质粒 pSKI015 阳性对照 ；－ . 野生型烟草
隐性对照 ；1-20. 转基因 T0 植株
图 3 转基因烟草的 PCR检测
表 2 T1代植株团棵期主要突变表型统计
突变表型 出现突变次数 在株系中的突变率（‰）
株高矮 88 11.2
生长势弱 75 9.6
叶宽宽 54 6.9
叶尖钝尖 50 6.4
叶色浅绿 36 4.6
叶色深绿 21 2.7
叶宽窄 14 1.8
生长势强 13 1.7
节间距小 12 1.5
节间距大 11 1.4
叶数多 9 1.1
叶数少 9 1.1
株高高 7 0.9
腋芽多 6 0.8
叶面皱 6 0.8
叶基部窄 5 0.6
叶尖急尖 5 0.6
总计 421 53.7
图 4 团棵期部分可视突变表型
表 3 T1代植株现蕾期主要突变表型统计
突变性状 出现突变次数 在株系中的突变率（‰）
株高矮 31 4.0
叶皱 28 3.6
叶色深绿 26 3.3
早花 24 3.1
节间距小 19 2.4
叶宽 18 2.3
节间距大 18 2.3
腋芽多 13 1.7
叶数少 10 1.3
生长势弱 10 1.3
叶面光亮 7 0.9
花叶病重 7 0.9
叶面平整 6 0.8
花序密集 6 0.8
花色淡 6 0.8
叶面平整 5 0.6
叶窄 5 0.6
生长势强 5 0.6
花期晚 5 0.6
花序松散 5 0.6
花器官发育不良 5 0.6
茎叶夹角小 5 0.6
叶片畸形 4 0.5
株高高 4 0.5
抗病性好 3 0.4
主茎弯曲 2 0.3
叶面粗糙 2 0.3
主茎细 1 0.1
总计 280 35.8
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第10期184
3 讨论
与功能丧失性突变引起隐性表型不同，功能获
得型突变在 T1 代表现出显性表型［18］，尤其对于功
能冗余的基因（例如基因家族中的基因）［19］，基因
家族中一个成员的改变可以产生突变表型，而无需
干扰家族中的其它成员［20］。本研究利用激活标签载
体 pSKI015 已经创建了 3 万份烟草功能获得型突变
体材料，且转基因阳性率为 87.8%，预计在 2012 年
年底突变体将达到 10 万份，这为后续将要开展的烟
草功能基因组学研究奠定了坚实的基础。
许多研究证明激活标签技术是研究植物功能基
因组学的有效方法。在 2.5 万份拟南芥突变体中，
23 株为具有显著形态表型的显性突变，占 0.1%［18］。
日本学者创制了 5.5 万份拟南芥激活标签突变体库，
在 T1 代具有形态表型的有 1 262 株（2.3 %）［19］。4.3
万水稻份激活标签突变体库，在 3 290 份突变体材
料中获得了 9 个显性突变体（0.27%）［21］。本课题
组在 2009 年创制了 5 万份激活标签水稻突变体库，
使用的质粒为 pER38，包含双 CaMV 35S 增强子，
确定了 400 份显性、具有可视表型的突变体（0.8%），
T0 代和 T1 代可视突变表型的概率分别为 2.1% 和
6.4%［22］。本研究部分 T1 突变体（7 847 份）由中国
农业科学院烟草研究所种植并调查突变表型，在团
棵期具有可视突变表型的概率为 5.4%，在现蕾期具
有可视突变表型的概率 3.6%。
4 结论
本研究利用农杆菌介导法，构建烟草（红花大
金元）的激活标签突变体库，建立了高效的烟草激
活标签 pSKI015 遗传转化体系，现已创制突变体材
料 3 万份，预计在 2012 年年底达到 10 万份。利用
载体自身携带的 CaMV 35S 增强子序列设计引物，
对转基因植株进行 PCR 检测，其检测结果阳性率为
87.8%，进一步证明了该转化体系的高效性和稳定性。
大田种植 T1 代，调查突变体的可视突变表型，结果
表明在团棵期具有可视突变表型的概率为 5.4%，在
现蕾期具有可视突变表型的概率为 3.6%。
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（责任编辑 马鑫）