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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第8期
壳聚糖酶在工业上可用于降解壳聚糖制备壳寡
糖，壳寡糖具有抗菌、调节机体免疫、抗肿瘤及促
进农作物增产等功效［1-5］，在食品、医药等领域中
具有广泛的应用前景。壳聚糖酶在农业上可以作为
农业应用中的生物控制剂，壳聚糖酶在基础研究方
面也得到了广泛应用［6］。
壳聚糖酶来源广泛，不同的微生物产生的壳
聚糖酶其降解作用模式有所不同［7］。通过对不同
微生物产壳聚糖酶的来源、性质和产量等的研究也
收稿日期 ：2013-03-03
基金项目 ：中国博士后科学基金项目（2011M501169），江苏省海洋生物技术重点实验室开放课题（2009HS01）
作者简介 ：孙玉英，女，博士研究生，副教授，研究方向 ：微生物酶技术 ；E-mail ：sunyuying125@163.com
通讯作者 ：张继泉，男，博士，研究方向 ：海洋生物技术 ；E-mail ：zhangjiquan@qdio.ac.cn
一株产壳聚糖酶的噬纤维菌分离及产酶发酵条件优化
孙玉英1，2  张继泉2  邬世昂1
（1. 淮海工学院海洋学院，连云港 222005 ；2. 中国科学院海洋研究所，青岛 266071）
摘 要 ： 从连云港海域中筛选出一株产壳聚糖酶活力较高的菌株 M5。根据其形态特征、生理生化以及 16S rDNA 鉴定，初
步认定该菌为噬纤维菌属，命名为 Cellulophaga sp. M5。通过单因素优化结合正交试验初步确定菌株 M5 产酶的培养基（g/L）及培
养条件 ：粉末壳聚糖 10，酵母提取物 3，硫酸铵 5，葡萄糖 1.0，K2HPO4·3H2O 1.4，NaCl 5，MgSO4·7H2O 1.4，陈海水 1 L ；发酵起
始 pH 为 6.5，250 mL 三角瓶中装 70 mL 培养基，1% 接种量，30℃ 180 r/min 培养 84 h。经过优化 Cellulophaga sp. M5 发酵产酶由
2.67 U/mL 提高到 6.67 U/mL，产酶活力提高了 1.5 倍。
关键词 ： 壳聚糖酶 筛选 鉴定 发酵优化 噬纤维菌属
Screening of a Chitosanase-producing Strain Cellulophaga sp. and
Optimization of the Fermentation Conditions
Sun Yuying1，2 Zhang Jiquan2 Wu Shiang1
（1. Marine College, Huaihai Institute of Techology, Lianyungang 222005 ；2. Institute Oceanology, Chinese Academy of Sciences,
Qingdao 266071）
Abstract:  A chitosanase-producing bacterium M5 was isolated from Lianyungang sea area. It was identified as Cellulophaga sp. based on
its morphological, physiological and biochemical properties and 16S rDNA sequence analysis and named Cellulophaga sp. M5. By single factors
combination with orthogonal experimental, the optimum medium composition for producing chitosanase by Cellulophaga sp. M5 was as follows
（g/L）：chitosan powder 10, yeast extract 3, ammonium sulfate 5, glucose 1.0, NaCl 5, MgSO4·7H2O 1.4, K2HPO4·3H2O 1.4, the initial pH6.5.
The optimum cultivation condition was to incubate in 250 mL flask installed with 70 mL medium of 1% inoculum size at 30℃ , 180 r/min for
84 h. The maximal chitosanase activity could reach 6.67 U/mL when Cellulophaga sp. M5 was incubated in flask under the optimum cultural
conditions. The activity increased by 1.5 times in comparision with initial activity of 2.67 U/mL.
Key words:  Chitosanase Screening Identification Fermentation optimization Cellulophaga
可扩大壳聚糖酶在科研、医药、卫生和材料等多领
域的应用。关于壳聚糖酶工程菌的构建已有许多报
道［8-15］：原核表达多形成包涵体，重组蛋白分离纯
化相对复杂，抗性基因对于壳寡糖的生产可能存在
安全性问题 ；酵母体系中也有成功表达的实例，但
产酶量较低，因此继续寻找不同微生物来源的壳聚
糖酶，以期得到具有工业化潜在应用价值新酶源，
仍然是研究壳聚糖酶的一个方向。本研究从连云港
海域中分离出一株产壳聚糖酶活力较高的菌株，并
2013年第8期 151孙玉英等 ：一株产壳聚糖酶的噬纤维菌分离及产酶发酵条件优化
从形态、生理生化特征和 16S rDNA 序列分析上对
该菌进行鉴定，并对该菌的产酶条件进行初步研究，
旨在为高产壳聚糖菌株的产业化应用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 土样 本研究所用海泥主要从连云港附近潮
间带采集，共在 4 个地方采集了 4 批泥样，每批泥
样在不同地点采 5 个土样。
1.1.2 壳聚糖与胶体壳聚糖 壳聚糖为青岛海汇产
品，脱乙酰度为 90%，分子量 30 cp。胶体壳聚糖为
实验室自制，参考 Yabuki 等［16］方法。
1.1.3 培养基
（1）富集培养基（g/L）：粉末壳聚糖 20，蛋白胨 5，
陈海水 1 L。
（2）初筛培养基（g/L）：（NH4） 2SO4 5，K2HPO4 2，
NaCl 5，MgSO4·7H2O 1，胶体壳聚糖 10，琼脂 20，
酵母粉 1，调 pH 至 6.5-7.5，陈海水 1 L ；壳聚糖单
独灭菌（1.69×105 Pa，10 min）。
（3）斜面种子培养基 ：组分配方同平板分离培
养基。
（4）液体种子培养基（g/L）：蛋白胨 5，酵母提
取物 5，K2HPO4 0.7，KH2PO4 0.3，NaCl 5，MgSO4·
7H2O 0.5，葡萄糖 3，陈海水 1 L，调节 pH6.5-7.5。
（5）发酵培养基（g/L）：粉末壳聚糖 10，硝酸
铵 10，酵母提取物 3，K2HPO4·3H2O 1.4，NaCl 5，
MgSO4·7H2O 1.4， 葡 萄 糖 1.0， 陈 海 水 1 L， 调 节
pH6，500 mL 三角瓶中分别装 100 mL 种子培养基和
发酵培养基。
1.1.4 培养条件 种子培养基接入菌体在 150 r/min，
30℃摇床中培养 20 h，按 4% 的接入量接入发酵培
养基中，发酵培养基在 150 r/min，30℃的摇床中发
酵 96 h。在发酵培养基中加入酵母提取物和葡萄糖
是为了促进菌体细胞的生长，因此在碳源和氮源的
优化中，不再予以考虑。
1.2 方法
1.2.1 产酶菌株的分离 平板筛选法，参照 Huta-
dilok 等［17］方法。
1.2.2 壳 聚 糖 酶 活 力 测 定 测 定 方 法 见 参 考 文
献［6］。
1.2.3 16S rDNA 序列鉴定、测定及系统发育树的
构建详见参考文献［16］。
1.2.4 形态特征和生理生化特性鉴定 通过活菌形
态观察和菌体染色制片对 M5 进行形态特征鉴定 ；
采用细菌微量生化鉴定管进行生理生化特性鉴定，
依据《伯杰细菌鉴定手册》（第 9 版）对菌种鉴定。
1.2.5 发酵条件的优化
1.2.5.1 不同碳源对产酶的影响 在发酵培养基中，
分别以胶体壳聚糖、粉末几丁质、可溶性淀粉、胶
体几丁质、羧甲基纤维素钠代替发酵培养基中的粉
末壳聚糖作为碳源（碳源浓度为 10 g/L），试验不同
碳源对产酶的影响。
1.2.5.2 不同氮源对产酶的影响 在发酵培养基中，
分别以硝酸钾、牛肉膏、蛋白胨、硫酸铵代替培
养基中的硝酸铵（氮源浓度为 5 g/L），同时把硝酸
铵浓度为 0 作为空白对照，试验不同氮源对产酶的
影响。
1.2.5.3 碳氮比对产酶的影响 考虑到经济原因，
固定碳源浓度为 1%，改变氮源的比例分别为 0.5%，
1%、1.5%、2%、2.5% 和 3%，试验不同量的氮源对
产酶的影响。
1.2.5.4 正交试验 在单因素试验的基础上，对发
酵时间、接种量、装液量和碳氮比 4 因素利用 L9（3
4）
进行正交试验。
1.2.5.5 数据分析 每个试验点取 3 个平行样，最
终的测量值取平均值，3 个平行样的误差控制在
5% 以内。
2 结果
2.1 菌株初筛结果
从采集的土样筛选到 20 株有产酶能力的菌株，
经过进一步初筛，挑取菌落周围产生明显的水解透
明圈，并且水解圈直径和菌落直径的比值（D/d）较
大的 5 株，编号分别为 M2、M3、M5、M6 和 M7（图
1）。菌落特征和 D/d 如表 1 所示。
2.2 菌株的复筛
将已纯化的具有较强产壳聚糖酶能力的 5 株菌
进行摇瓶复筛，结果表明 M5 在液体培养基中的产
酶能力最强，酶活力大约为 2.67 U/mL，所以将 M5
作为进一步研究的试验菌株。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第8期152
2.3 M5菌株的鉴定
2.3.1 16S rDNA 基因 PCR 克隆与序列分析 通过
PCR 扩增得到长约 1.5 kb 的片段，将目的片段切胶
回 收 后， 连 接 到 pMD18-T 载 体 上， 并 转 化 E. coli
TOP10F’，PCR 法筛选阳性克隆。
经序列测定，确定该扩增片段长度为 1 452 bp，
该 16S rDNA 序列已提交 GenBank（登录号 ：JX435-
328）。经同源性分析，发现 M5 与 Cellulophaga fuc-
icola 同源性达到 99%，根据 16S rDNA 序列同源性
属内不低于 95％的标准，初步确定该菌属于噬纤维
菌属。由 MEGA4.1 软件绘制系统发育树。从建立的
系统发育树（图 2）中可以看出，M5 与 Cellulophaga
fucicola NN015860 构成了同一个分支，因此它们之
间的亲缘关系最近。
2.3.2 菌株的形态特征鉴定 通过菌落形态观察，
菌体染色制片在显微镜油镜下观察，鉴定结果如下：
在平板培养基上菌落不透明，有光泽，黄色，幼培
养物与老培养物的菌体形态几乎无变化，在老培养
物中会产黄色色素 ；革兰氏阴性杆菌。
2.3.3 菌株的部分生理生化特征鉴定 菌株的生理
生化鉴定结果如表 2 所示。
2.3.4 菌 株 的 鉴 定 从 16S rDNA 序 列 分 析 来 看，
M5 与 Cellulophaga fucicola NN015860 的同源性最高，
为 99% ；根据上述菌株形态特征，该菌株与《伯杰
细菌鉴定手册》上噬纤维菌属的分类学特征最相符；
对 M5 进行的生理生化特性鉴定结果也符合噬纤维
菌属的特征，因此初步把该菌株鉴定到属，即噬纤
维菌属 M5。
2.4 发酵条件的优化
2.4.1 不同碳源对 M5 产酶的影响 如表 3 所示，
最适合菌体产酶的是胶体壳聚糖，其次是胶体几丁
质，后依次是壳聚糖粉末、几丁质粉末、淀粉，说
明菌株产壳聚糖酶的能力不仅与碳源类别有关，还
与碳源的形态有关。本研究中，由于胶体壳聚糖和
胶体几丁质制作过程繁杂，成本高，各批次重复性
差，同时在灭菌的过程中胶体壳聚糖容易发生焦糖
化，因此使用壳聚糖粉末作为碳源，进行后续发酵
条件研究。
2.4.2 不同氮源对 M5 产酶的影响 由表 4 可知，
最适菌体产酶的氮源是（NH4）2SO4。同时该菌株在
M3
M5
M6
M2
M7
图 1 平板初筛结果
表 1 产酶菌落特征和 D/d 值
菌株编号 平板菌落特征 D/d
M2 菌落白色，不透明，圆形，边缘整齐，干，小 2
M3 菌落白色，不透明，圆形，边缘整齐，湿 2
M5 菌落黄色，不透明，椭圆，边缘不整齐 3
M6 菌落黄色，不透明，圆，边缘整齐光滑，干 2.5
M7 菌落黄色，不透明，圆，干 3
M5
Cellulophaga fucicola NN015860
Cellulophaga baltica NN015840
Cellulophaga pacifica KMM3664
Flavobacteriurn frigoris PS1
Coenonia anatina AF118419
Blattabacterium sp.
Pedobacter heparinus
Sphingobacterium faecium
Sphingobacterium faecium DSM
Capnocytophaga sputigena ATCC33612
Leptospira fainei BUT6
Vibrio cholerae BH1
Vibrio fluvialis CCMMB664
Vibrio splendidus NO1
Escherichia coli ATCC25922
86
99
99
99
100
100100
98
52
49
93
54
94
图 2 菌株 M5 的 16S rDNA 序列系统发育树
表 2 M5 菌株的部分生理生化鉴定结果
测试项目 结果 测试项目 结果
鸟氨酸 - 胆汁七叶苷 +
赖氨酸 - 半乳糖 -
精氨酸 - 甘露糖 -
果糖 + 侧金盏花醇 -
阿拉伯糖 - 阿拉伯醇 -
乳糖 - 肌醇 -
棉籽糖 - 硫化氢试验 +
蔗糖 + 明胶液化 -
+ ：阳性 ；- ：阴性
2013年第8期 153孙玉英等 ：一株产壳聚糖酶的噬纤维菌分离及产酶发酵条件优化
不外加氮源（培养中其他成分含有氮源）也能生长
产酶，不过低于外加氮源。
表 4 不同氮源对 M5 产酶的影响
氮源 壳聚糖酶活力（U/mL）
蛋白胨 1.24±0.09
牛肉膏 1.07±0.12
硝酸钾 1.91±0.14
硫酸铵 2.49±0.16
空白对照 0.84±0.14
2.4.3 碳氮比对 M5 产酶的影响 不同的碳氮比对
菌体的生长和产酶有不同程度的影响。通过图 3 可
知，随氮源浓度增加产酶能力也随着增加，超过 1%
时氮源浓度增加产酶能力反而下降，氮源浓度为 1%
时最适合菌株产酶。而较高氮含量对菌株产酶有抑
制作用。
氮源浓度为 1%，250 mL 三角瓶装瓶量为 70 mL，接
种量为 1%。
表 5 发酵时间、接种量、装瓶量和氮源浓度 4 因素的正交
试验数据
试验编号
时间
（h）
接种量
（%）
装瓶量
（mL/250 mL）
氮源浓度
（%）
壳聚糖酶活力
（U/mL）
1 72 1 30 0.20 2.09
2 72 2 50 0.50 2.18
3 72 3 70 1 2.18
4 84 1 50 1 6.67
5 84 2 70 0.20 5.20
6 84 3 30 0.50 3.96
7 96 1 70 0.50 2.98
8 96 2 30 1 2.40
9 96 3 50 0.20 1.20
K1 6.44 11.73 8.44 8.49
K2 15.82 9.78 10.04 9.11
K3 6.58 7.33 10.36 11.24
k1 2.15 3.91 2.81 2.83
k2 5.27 3.26 3.35 3.04
k3 2.19 2.44 3.45 3.75
R 3.08 1.47 0.64 0.92
优顺序 A>B>D>C
优水平 A2 B1 C3 D3
优组合 A2B1C3D3
3 讨论
海洋微生物酶的开发和利用是实现海洋资源高
值化的关键技术之一，海洋生态环境复杂，从而产
生出具有独特生理活性的酶系。目前，已报道一系
列产几丁质酶和壳聚糖酶的海洋细菌［18］。不同细菌
所产壳聚糖酶的种类不同，其降解作用模式也是不
同的，因此从海洋中寻找产酶活力高的菌株是我们
目前利用壳聚糖的一个研究方向。本研究从海洋中
筛选到一株产壳聚糖酶较高的菌株，经初步鉴定为
噬纤维菌属，噬纤维菌属产壳聚糖酶目前尚未见报
道，本研究丰富了壳聚糖酶的基础理论研究。
壳聚糖酶按照酶的产生又可以分为诱导型和组
成型，目前研究公认大多数微生物来源的壳聚糖酶
属于诱导酶，因此当以壳聚糖作为唯一碳源时，微
生物产壳聚糖酶的能力就能被诱导出来。而该菌株
M5 当以壳聚糖为诱导物时，所产壳聚糖酶活力最高，
初步说明该菌株为诱导酶。但是该菌株在以淀粉为
表 3 不同碳源对 M5 产酶的影响
碳源 壳聚糖酶活力（U/mL）
胶体壳聚糖 3.60±0.16
胶体几丁质 3.02±0.20
淀粉 2.62±0.15
几丁质粉末 2.67±0.13
壳聚糖粉末 2.80±0.18
羧甲基纤维素钠 0
4.0
3.0
2.0
1.0
0.5
1.5
2.5
3.5
0
0 0.5 1 1.5 2.5 3.532≞Ⓚ⎃ᓖ%
༣㚊
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U/m
L
图 3 碳氮比对 M5 产酶的影响
2.4.4 发酵时间、接种量、装瓶量和氮源浓度正交
试验 如表 5 所示，A 的 R 值最大说明培养时间对
菌株产酶影响最显著，R 值的排序为 A>B>D>C，即
其 4 因素对产酶结果影响顺序排名大小为 ：发酵时
间 > 接种量 > 氮源浓度 > 装瓶量。A 因素中的 k2 最大；
B 因素中 k1 最大 ；C 因素中 k3 最大 ；D 因素中 k3 最
大，说明其最优方案为 A2B1C3D3，即发酵时间 84 h，
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第8期154
碳源时，仍然产生壳聚糖酶，淀粉诱导菌株产壳聚
糖酶目前尚未见报道，因此该菌株所产壳聚糖酶有
可能为一种新型酶制剂。相比较壳聚糖来说，淀粉
的成本远低于壳聚糖，从这方面来说该菌株有产业
化应用潜力。目前对该菌株所产的酶的分离纯化及
酶的特征正在研究中。
4 结论
在以壳聚糖为唯一碳源的平板上产生的透明
圈的大小为依据筛选出产壳聚糖酶酶活较高的菌株
M5。结合形态特征、部分生理生化特性和 16S rDNA
鉴定，将 M5 菌株初步鉴定为噬纤维菌属。通过单
因素优化结合正交试验初步确定菌株 M5 产酶的培
养基（g/L）及培养条件为 ：粉末壳聚糖 10，酵母提
取物 3，硫酸铵 5，葡萄糖 1.0，K2HPO4·3H2O 1.4，
NaCl 5，MgSO4·7H2O 1.4，陈海水 1 L ；发酵起始
pH 为 6.5，250 mL 三角瓶中装 70 mL 培养基，1%
接种量，30℃ 180 r/min 培养 84 h。在上述培养条件下，
M5 发酵产酶由 2.67 U/mL 提高到 6.67 U/mL。
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（责任编辑 马鑫）