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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第5期
脂肪酸转运蛋白 1（Fatty acid transporter protein，
FATP1），全称长链脂肪酸转运蛋白 1，又名 SLC27a1
（Solute carrier family 27 member 1），是脂肪酸转运蛋
白 家 族（Fatty acid transport family proteins，FATPs）
的一员。脂肪酸转运蛋白家族目前已发现了 6 个亚
收稿日期 ：2012-12-27
基金项目 ：国家转基因生物新品种培育科技重大专项（2011ZX08009-004），贵州省科技计划课题［黔科 NY 字（2012）3008 号］
作者简介 ：龚婷，女，硕士研究生，研究方向 ：动物遗传育种与繁殖 ；E-mail ：750980455@qq.com
通讯作者 ：许厚强，男，博士，教授，博士生导师，研究方向 ：分子遗传与动物育种 ；E-mail ：houqiang0524@yahoo.com
牛 FATP1 基因 5 侧翼启动子克隆及序列分析
龚婷  许厚强  陈伟  赵佳福  骆衡  陈祥  张勇
（1. 贵州大学 高原山地动物遗传育种与繁殖省部共建教育部重点实验室，贵阳 550025 ；
2. 贵州大学 贵州省动物遗传育种与繁殖重点实验室，贵阳 550025）
摘 要 : 旨在克隆牛 FATP1 基因 5 侧翼启动子，研究其特异性转录调控元件的调控机制。利用 PCR 方法扩增牛 FATP1 基因 5
侧翼区，并通过产物纯化、连接、转化及测序比对，获得 2 164 bp （-1 969- +194 bp）的 5 侧翼启动子序列。利用生物信息软件对
获得的 2 164 bp 5 侧翼启动子克隆载体进行分析预测，发现其有 4 处转录起始点和 40 个潜在转录因子结合位点；该序列与人、小鼠、
大鼠和狗的同源性分别为 74.1%、71.1%、72.0%、62.8%，且不同物种 FATP1 基因 5 侧翼区的同源序列主要集中在转录起始点上
游 -578- -93 bp 区域，保守性较强的区域在转录起始点上游 -263- -174 bp，推测转录起始点上游 -263- -174 bp 可能是其核心启动
子区域，从而成功克隆了 FATP1 5 侧翼启动子序列 2 164 bp，初步预测了该基因的核心启动子区域。
关键词 : 牛 克隆 FATP1 基因 启动子 转录因子
Cloning and Sequence Analysis of 5-Flanking Region of
Bovine FATP1 Gene
Gong Ting Xu Houqiang Chen Wei Zhao Jiafu Luo Heng Chen Xiang Zhang Yong
（1. Key Laboratory of Animal Genetics，Breeding and Reproduction in the Plateau Mountainous Region，Guizhou University，
Guiyang 550025 ；2. Ministry of Education Key Laboratory of Animal Genetics，Breeding and Reproduction，
Guizhou University，Guiyang 550025）
Abstract:  The experiment was conducted to clone 5-flanking region of bovine FATP1 gene to study regulatory mechanism of the specific
transcriptional regulation region. The 5-flanking region of bovine FATP1 gene was amplified with PCR, and then the 2 164 bp （-1969- +194
bp） 5-flanking promoter sequence was obtained by product purification, ligation, transformation, and sequence comparison. The obtained cloning
vector of 5-flanking region of bovine FATP1 gene was analyzed by the promoter software in this study. The results indicated that there were 4
transcription start sites and 40 potential transcription factor binding sites. Comparing bovine with human, mouse, rat and dog, the homology of 5-
flanking promoter sequence were 74.1%, 71.1%, 72.0%, and 62.8%, respectively. The conservative region was mainly concentrated in -578- -93
bp of the upstream of transcription start sites, and the highly conserved region was in -265- -162 bp of the upstream of transcription start sites,
which may be conclude that the -265- -162 bp of the upstream of transcription start sites was the core promoter region of the gene. The 2 164 bp
5-flanking region of the bovine FATP1 gene was cloned successfully and the core promoter region was preliminary predicted in the gene.
Key words:  Bovine Cloning FATP1 gene Promoter Transcription factor
型， 即 FATP1-FATP6［1］。 不 同 亚 型 的 FATP 均 含
有 311 个高度保守的氨基酸信号序列和一段一磷酸
腺苷（AMP）结合序列。大量研究证实 FATPs 的主
要生理功能是促进长链和极长链脂肪酸进入细胞内，
并根据代谢需要较快地协调游离脂肪酸的摄取，从
2013年第5期 87龚婷等 ：牛 FATP1 基因 5 侧翼启动子克隆及序列分析
而间接影响脂质分布与沉积，对动物肉质的改良有
着非常重要的意义［2］。
FATP1 是该家族中发现最早的基因，主要分
布在脂肪组织和肌肉组织中，其表达具有组织特异
性［3］。该基因 1994 年首次在小鼠 3T3-L1 脂肪细胞
中发现，并证实其参与长链脂肪酸的合成和脂肪代
谢［4］。进一步研究表明，FATP1 基因引导外源性
脂肪酸进入细胞，参与脂肪酸的摄入和酯化［5］。而
且该基因在参与脂肪代谢的同时也参与能量代谢。
2009 年，Sebastian 等［6］ 证 实，FATP1 基 因 与 线
粒体相关且对肌肉细胞线粒体脂肪酸氧化起作用。
Wiczer 等［7］研究发现，FATP1 基因有调控三羧酸
循环活性及线粒体代谢的功能。同年，Guitart 等［8］
通过亚细胞成分免疫印迹和 FATP1-GFP 融合蛋白的
免疫细胞学发现，FATP1 定位于线粒体中，并能提
高丙酮酸脱氢酶的活性。Mitchell 等［9］转染 FATP1
siRNA 与 HEK293 细胞，发现 FATP1 能够调控心脏
磷脂的重新合成。综上所述，FATP1 基因是影响脂
肪酸转运代谢和能量代谢的关键因子。
目前对于牛 FATP1 基因的表达和分子机理方面
的研究还不是很多，启动子作为真核生物基因表达
调控的顺式作用元件，含有基因表达调控网络的重
要信息，决定基因表达的强度及特异性［10］。因此，
本研究从牛 FATP1 基因的启动子入手，通过设计特
异性引物进行 PCR 扩增牛 FATP1 基因 2 164 bp 的启
动子序列，将其产物与 pMD19-T 载体连接后，获得
含 FATP1 基因启动子序列的亚克隆载体，以期对后
续研究牛 FATP1 基因特异性转录调控奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
克隆所需载体 pMD19-T vector、限制性内切酶
Kpn I、限制性内切酶 Xho I、T4 DNA ligase、质粒
DNA 抽提试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒、DL10000
Marker、DL2000 Marker 均购自于 TaKaRa（中国，大连）
有 限 公 司。 其 它 的 化 学 试 剂 均 为 国 产 分 析 纯 级
别，而整个试验采用 Milli-Q 超纯水系统制成的超纯
水作为试验用水。
本次研究所用关岭牛血样采于 2011 年 12 月 17
日贵州省安顺市西秀区幺铺镇屠宰场。用作感受态
的大肠杆菌 JM109 为本实验室保存菌种。
1.2 方法
1.2.1 引物设计 根据 GenBank 中收录的牛 FATP1
基因的 mRNA （NM_001033625.2）与已经公布的牛
基因组 Blast 比对，下载获得相应的启动子序列并
利用 Primer Premier 5.0 软件设计引物。上游引物 5-
GGGGTACCGCATCCCCACTCAACTAATAC-3，下游引
物 5-CCGCTCGAGCCACAG AGTCCTTTATTTGC-3，
带下划线的序列为引入的两个带保护碱基的酶切
位点 Kpn I 和 Xho I 位点。用这对引物扩增 2 164 bp
（-1969-+194 bp）的 5 侧翼序列，以转录起始点为 0，
以上为负，以下为正。引物合成由上海捷瑞生物工
程有限公司（中国，上海）完成。
1.2.2 PCR 扩增 从血液中提取关岭牛的基因组
DNA，以关岭牛的基因组 DNA 为模板进行扩增。
PCR 总反应体系为 25 μL，其中模板 1 μL，上下游
引物各 1 μL，2×PCR Master Mix 12.5 μL，ddH2O 补
至 25 μL。扩增条件 ：94℃预变性 4 min ；94℃变性
40 s、64℃退火 50 s、72℃延伸 1 min，35 个循环 ；
72℃延伸 10 min ；4℃保存。反应结束后，用 1.0%
琼脂糖凝电泳检测 PCR 产物。
1.2.3 扩增产物的克隆及测序 用琼脂糖凝胶 DNA
回收试剂盒纯化 PCR 产物，再将其与 pMD19-T 载体
16℃连接过夜后，转化大肠杆菌 JM109 中，然后涂
布于含有氨苄青霉素的 LB 琼脂糖平板上培养 16 h，
挑取单菌落接入 LB 液体培养基中培养，37℃ 200
r/min，培养 12 h 后提取质粒，进行酶切和 PCR 双
重鉴定。选取阳性克隆进行测序，测序于 TaKaRa（中
国，大连）有限公司完成。将测定的结果与 NCBI
登录的牛 FATP1 基因启动子序列（NM_214286.1）
进行比对分析，以确定克隆结果。
1.2.4 启动子的序列分析及预测 利用网站 Web Pr-
omote Scan Service （Bioinformatics and Molecular Anal-
ysis Section，Dan Prestridge）和 Neural Network Prom-
oter Prediction （Berkeley Drosophila Genome Project，
M.G. Reese）预测转录起始位点［11］；使用在线分析
软件 TFSEARCH （Parallel Application TRC Laboratory，
RWCP，Japan）和 PROMO （Algorithms and Data Stru-
ctures for Information，Retrival，Dom enec Farre）预测
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第5期88
转录因子结合位点 ；应用 VISTA （Genomics Division
of Lawrence Berkeley National Laboratory and US Depar-
tment of Energy Joint Genome Institute，Pachter Lior）
软件进物种间序列比对，再用 DNASTAR （DNSSTAR
Software Company，Frederick Blattner）中 Megalign 程
序进行进化树构建［12］。同时收集相关启子转录调控
位点研究的文献，综合多方面信息判定牛 FATP1 基
因 5 侧翼区最具可能性的启动子序列。
2 结果
2.1 牛FATP1基因5侧翼启动子序列的扩增
PCR 产物经电泳检测，出现单一的目的条带，
片段大小为 2 164 bp 与预期结果一致（图 1）。
2.2 阳性克隆的双酶切和PCR检测
将氨苄抗性筛选的阳性克隆子双酶切，经电泳
检测后，出现两条明显条带，T 载体为 2 692 bp，目
的片段为 2 164 bp（图 2），片段大小与预期相一致。
克隆载体 PCR 检测结果（图 3），出现单一的目的条
带，与预期相符初步判定 T 载体克隆成功，可以送
予生物公司测序。
2.3 启动子测序结果Blast比对
利用 NCBI 网站上提供的 Blast Sequences 将测
序结果（图 4）和牛基因组进行对比分析（图 5），
结果表明两序列 100% 一致，说明牛 FATP1 基因 5
端 2 164 bp 大小片段的克隆载体已构建成功，可进
行后续试验。
4000
2000
1000
2164
bp
500
250
10000
bp
M 1 2
7000
M ：DL1000 DNA marker ；1，2 ：克隆载
体扩增产物
图 3 promoter-T 载体 PCR 验证
M ：DL1000 DNA marker ；1 ：Promoter-T 载 体
经 Kpn I 和 Xho I 双酶切
图 2 promoter-T 载体双酶切验证
M ：DL1000 DNA marker ；1，2 ：PCR 扩
增产物
图 1 目的条带 PCR 扩增图
4000
2000
1000
2692
bp
2164
500
250
10000
bp
M 1
7000
4000
2000
1000
2164
bp
500
250
10000
bp
M 1 2
7000
图 4 启动子克隆载体的测序结果
2.4 牛FATP1启动子序列分析
2.4.1 启动子转录起始点预测 利用软件 Promoter
Scan 和 Neural Network Promoter Prediction 对牛 FATP1
基因 2 164 bp 5 侧翼启动子序列进行生物信息学
分 析（ 图 6） 发 现， 分 别 在 -1 912 bp、-1 412 bp、
-1 132 bp、-211 bp 位置预测到转录起始点（Transcri-
ption start sites，TSS）， 且 发 现 该 区 域 存 在 类 似 的
TATA-box 和多个 CAAT-box 与 GC-box。
2.4.2 启动子转录因子结合位点的预测 利用网站
TESS （Transcriptional factor search system）和在线生
物软件 Promo （ALGGEN）与 TFSEARCH （Parallel Ap-
plication TRC Laboratory，RWCP，Japan）对牛 FATP1
2013年第5期 89龚婷等 ：牛 FATP1 基因 5 侧翼启动子克隆及序列分析
基因 5 侧翼区序列进行综合分析，预测潜在的转
录因子结合位点。结果发现在 2 164 bp （-1 969 bp-
+164 bp）范围内存在丰富的转录因子结合位点，如
甾 醇 调 控 元 件 结 合 蛋 白（Sterol regulatory element-
binding protein，SREBP ） 、CCAAT 增强子结合蛋白
β（Enhancer binding protein β，C/EBP-β） 、糖皮质激
素受体 α（Glucocorticoid receptor α，GR-α）、过氧化
物酶体增殖物激活受体 α（Peroxisomal proliferator-
Query 1
Sbjct 816117
Query 61
Sbjct 816057
Query 121
Sbjct 815997
Query 181
Sbjct 815937
Query 241
Sbjct 815877
60
816058
120
815998
180
815938
240
815878
300
815818
图 5 启动子克隆测序结果的 blast 比对
 *&$7&&&&$& 7&$$&7$$7$ &77&7$&7*7 **7***&$&7 7*$$&77*&& 7*$*$*$$$& &$&&&&&7&& &&&$&$*&*& 7&$7777&7$ 777$7$*&*&
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图中阴影位置和带方框位置分别表示软件预测的转录起始位点和转录调控元件
图 6 牛 FATP1 基因 5 侧翼序列 TSS 预测
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第5期90
activated receptor alpha，PAR-α） 、激活增强子结合
蛋 白 2α（Activating enhancer binding protein 2 alpha，
AP-2αA） 、特异性转化因子（Transformation-specific，
c-Ets-1）、B 细 胞 特 异 性 激 活 蛋 白（B-cell lineage
specific activator，Pax-5）、TATA 结 合 蛋 白（TATA-
binding protein，TBP）、垂体特异性转录因子 1（Pitu-
itary specific transcription factor 1，POU1F1） 等 40 个
转录因子，详见表 1。
表 1 牛 FATP1 基因启动子区域潜在转录因子结合位点预测
位置 转录因子结合位点
-100 bp-+164 bp C/EPB-β （TTGC/TTGT），YY1 （ATGG），Pax-5 （GGGCCTG），AP-2αA （GCCT GC），GR-α （CCTAT）
-600 bp- -100 bp C/EBP-β （TTGC/TTGT），GR-α （CCTAT），FOXP3 （GACAAC），GR-β （AATGT），PPAR-α （CTCTGGGCCTG），YY1
（ATGG），TFIID （TTTTCTA），TFII-I （GGAAA G），RXR-α （TGAACCC），MZF1 （CCACTCAA），AML-la （TGTGGT），
Nkx-2 （TGAACT），CdxA （ATTTATA），AP-2αA （GCCTGC），STAT4 （GGAACT），C-Ets-1 （GAGGAAG），C/EBP-α
（CGCAATT），POU1F1 （AGCAGGAA），NF-Y （GGCCCAAT），NF-1 （GGGCCCA），GATA1 （CTGATA） Pax-5 （GGGCCTG），
GATA2 （GCGCTATCT），NF-kappaB1 （GGGGAGTG），NFI/CTF （CCAAGCAG），GATA3 （AGCGCTATCTGG）
-1969 bp- -600 bp C/EBP-β （TTGC/TTGT），PXR-1 （TTAGTTCA），GR-β （AATGT），YY1 （ATGG），STAT4 （GGAACT），T3R-β1
（CAGAGGTGA），GR-α （CCTAT），TBP （TTTATAGCGC），FOXP3 （GACAAC），ER-α （TGACC），RXR-α （TGAACCC），
AP-2αA （GCCTGC），PRB （GACTGTT），GATA-1 （TGATA），GR（CTTTTG），TFIID （TTTT CTA），PRA （TAGTGTT），
C-Ets-1 （GAGGAAG），C/EBP-α （CGCAATT），ELK-1 （TGGAGGAAG），TFII-I （GGAAAG），AR （GGACAATCC），
XBP-1 （GGTCAT），IRF-2 （TCACTT），PEA3 （AGGATGTTG），P53 （GGGCAGA），SREBP （GATCA CCCCA）
注 ：以转录起始点为 0，以上为负，以下为正
2.4.3 不同物种 FATP1 基因 5 侧翼区序列比对和进
化树构建 对不同物种 FATP1 基因 5 侧翼区序列进
行序列比对，结果如图 7 所示。不同物种 FATP1 基
因的转录起始点上游 -263 bp- -174 bp 区域保守性较
强，同源序列主要集中在转录起始点上游 -578 bp-
-93 bp 区域，其中牛与人、大鼠、小鼠、狗同源性
分 别 为 74.1%、71.1%、72.0%、62.8%， 在 该 区 域
中未发现与斑马鱼的同源序列。利用 DNASTAR 中
的 Megalign 程序进行进化树构建，结果如图 8 所示，
其中小鼠和褐家鼠聚为一类，再与牛聚为一类，再
与人聚为一类，然后与猪聚为一类，再与狗聚为一类，
最后与斑马鱼聚合。该进化树真实反应了物种间序
图 7 不同物种 FATP1 基因 5 侧翼区的序列比对
列保守性和进化关系。
3 讨论
基因启动子区域在基因的表达调控过程中发挥
着重要的作用，各种转录因子能够识别基因 5 调控
区的特异位点并与之作用，调控基因的表达。目前
关于 FATP1 基因表达调控研究表明，FATP1 主要受
过氧化物酶体增生物激活受体（PPARs）、激素（研
究较多的是胰岛素）、细胞因子等多种物质调控，与
2013年第5期 91龚婷等 ：牛 FATP1 基因 5 侧翼启动子克隆及序列分析
其他调节因子共同调节长链脂肪酸的转运，维持
机体稳态［13］。很多研究都指出在小鼠的肝脏和肿
瘤细胞中过氧化物增殖酶体及其受体（PPAR）对
FATP1 起到一个正调控的作用［14，15］。该基因上游
区域 -474 bp- -458 bp 存在功能性过氧化物酶体增
生物激活受体（PPARs）反应元件且能被 PPARα 和
PPARγ 激活物上调［16］。有关研究表明，胰岛素在
脂肪细胞中负向调控 FATP1 的表达［17，19］。胰岛素
对 FATP1 调控快速、可逆，主要通过定位于 -1 353
bp 和 -1 347 bp 的顺式磷酸烯醇丙酮酸羧基酶类似
元件［20］，在转录水平上调控成熟脂肪细胞中 FATP1
基因的表达。因此，研究该基因的转录因子与结合
位点间的相互作用是认识转录调控机制的关键所在。
本 研 究 利 用 启 动 子 在 线 分 析 软 件 研 究 了 牛
FATP1 基因 5 侧翼区的各种转录因子结合位点的分
布情况，找到了 4 个转录起始位点和 40 个转录因子
结合位点。一些多次出现且分值较高的转录因子包
括 AP-2αA、C/EBP-β、C/EBP-α、GR-α、RXR-α 和
Pax-5 等，可能对调节 FATP1 基因的调控起着至关
重要的作用。近年来，有关 AP-2α 在调控脂肪细胞
成熟和脂肪因子分泌的研究表明，AP-2α 表达的下
调，是启动脂肪细胞分化的重要环节之一。AP-2α
可与脂肪细胞分化关键转录激活因子 C/EBP-α 基
因结合，调控 C/EBP-α 基因转录活性，C/EBP-α 基
因表达增加显著促进前脂肪细胞向成熟脂肪细胞
分化［21］。RXR-α 作为配体激活型转录因子，能与
PPARγ 形成二聚体促进小鼠前脂肪细胞分化［22］。最
近研究表明，RXR-α 具有促进猪前体脂细胞分化和
抑制猪前体脂肪细胞凋亡的作用［23］。而 Pax-5 对 B
淋巴细胞的定向分化发育起着重要作用，它通过调
节组蛋白的甲基化、乙酰化修饰，调控 B 淋巴细胞
特异性基因表达，从而实现 B 细胞定向分化发育［24］。
所以这些多次出现的转录因子结合位点的区域更有
可能是启动子区。同时还有一些单次出现，且分数
较高的转录因子结合位点，包括 PPAR-α （-360 bp-
-349 bp）、NFI/CTF （-190 bp- -182 bp）、NF-kappaB1
（-275 bp- -267 bp）等，它们参与调节基因的复制和
表达，对动物的生长调控起着重要作用［25，26］。所以
研究基因的转录因子结合位点对于启动子的定位意
义重大。
4 结论
牛与人、小鼠、大鼠、狗的 FATP1 基因 5 侧
翼区同源性分别为 74.1%、71.1%、72.0%、62.8%。
并且牛与人、小鼠和大鼠在 FATP1 基因 5 侧翼区的
转录起始点上游 -263 bp- -174 bp 区域保守性较强，
同源序列主要集中在转录起始点上游 -578 bp- -93
bp 区域。在 FATP1 基因 5 侧翼区的转录起始点上
游 -263 bp- -174 bp 区域，牛与人、小鼠、大鼠有共
同的转录因子结合位点，在调控基因转录和翻译方
面具有共同的作用，所以可能是启动子的核心区域。
参 考 文 献
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图 8 FATP1 基因启动子区域系统进化树
Nucleotide Substitutions100×Bootstrap Trials = 1000, seed = 111
0
129.3
20406080100120
mouse
rat
100.0
cattle
84.4
human
NA
pig
76.5
dog
73.6
zebrafish
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（责任编辑 李楠）