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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第12期
农作物经常会遭受各种各样的逆境（干旱、低
温、高温、盐碱、虫害和病害等），严重影响其生长
发育和产量。植物无法躲避逆境，因此它们必须激
活体内的多种防御机制，即表达特异抗性基因或合
成大量的胁迫蛋白来应对不利的环境条件［1］。转录
因子由于可以调控多个抗逆相关基因的表达［2］，近
年来已成为抗逆基因工程中的研究热点。
乙烯响应因子（Ethylene-responsive factor，ERF）
属于 AP2 /ERF 转录因子家族中的 ERF 亚家族，是
植物特有的一类转录因子［3］，广泛参与植物细胞
发育、激素应答、抗病和抗生物与非生物胁迫等反
应［4］。其共同点是所编码的蛋白都含有 1 个高度保
守的 ERF 结合域，可以特异地结合 GCC-box 和 DRE
收稿日期 ：2013-07-12
基金项目 ：齐齐哈尔大学青年教师科研启动支持计划项目（2012k-M20）
作者简介 ：翟莹，女，博士，讲师，研究方向 ：大豆分子育种 ；E-mail ：fairy39809079@126.com
大豆乙烯响应因子 GmERF6 的功能分析
翟莹1  赵艳1  杨晓杰1  孙天国1  张军2  姚雅男3 
（1. 齐齐哈尔大学生命科学与农林学院 遗传重点实验室，齐齐哈尔 161006 ；2. 黑龙江省兽医科学研究所，齐齐哈尔 161006 ；
3. 长春农业博览园，长春 130117）
摘 要 ： GmERF6 是从大豆中克隆到的一个新的 ERF 转录抑制子基因，对其功能作了进一步的分析。亚细胞定位试验结果
显示 GmERF6 蛋白定位于细胞核中 ；利用原核表达纯化 GmERF6 蛋白并进行凝胶阻滞分析（EMSA），结果显示，GmERF6 蛋白在
体外可以与 GCC-box 元件特异结合 ；对 GmERF6 转基因拟南芥干旱条件下的种子萌发率和植株表型进行观察，结果证实 GmERF6
提高了转基因拟南芥的抗旱性，表明该基因可作为培育抗旱材料的候选基因。
关键词 ： 大豆 GmERF6 亚细胞定位 EMSA 抗旱性
Functional Analysis of Ethylene-response Factor GmERF6 in Soybean
Zhai Ying1 Zhao Yan1 Yang Xiaojie1 Sun Tianguo1 Zhang Jun2 Yao Yanan3
（1. Key Laboratory of Genetics，College of Life Science and Agro-Forestry，Qiqihaer Univesity，Qiqihaer 161006 ；2.Heilongjiang Institute of
Veterinary Science，Qiqihaer 161006 ；3.Changchun Agriculture Expo Garden，Changchun 130117）
Abstract:  GmERF6 is a new ERF transcription repressor isolated from soybean. The function of GmERF6 was further analyzed in this
research. GmERF6 protein localized to the nucleus when transiently expressed in onion epidermal cells. Furthermore, EMSA showed GmERF6
protein binding to the GCC-box element in vitro. The seed germination rates of GmERF6 transgenic Arabidopsis were significantly higher than
that of wild type Arabidopsis under drought stress. GmERF6 transgenic Arabidopsis grew much healthier than wild-type Arabidopsis by removing
water for 18 d. These data indicated that GmERF6 enhanced drought tolerance in transgenic Arabidopsis. These results suggest GmERF6 is likely
to be a useful tool for improving drought tolerance of plants.
Key words:  Soybean GmERF6 Subcellular localization EMSA Drought tolerance
/CRT 等逆境相关元件［5，6］，从而调控下游基因的
转录或参与植物抗逆信号转导。到目前为止，已鉴
定的 ERF 转录因子大部分都是转录激活子，而关于
ERF 转录抑制子的研究相对较少。拟南芥（Arabidopsis
thaliana）中已发现 8 个 ERF 转录抑制子，它们在
拟南芥中具有不同的表达模式，可能发挥不同的作
用［7］。在大豆（Glycine max L.）中，仅报道过一个
ERF 转录抑制子 GmERF4，它可以被多种生物及非
生物胁迫所诱导，过量表达 GmERF4 可以提高转基
因烟草的抗旱性和抗盐性［8］。
研究人员前期已克隆了一个新的大豆 ERF 转录
抑制子 GmERF6（GenBank 登录号 ：JN416601），可
被乙烯、干旱、高盐和低温所诱导，可以降低转基
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第12期74
因拟南芥离体后的脱水率，在抗旱方面发挥调控功
能［9］，但并未从转基因植物的表型方面加以鉴定。
为了获得 GmERF6 提高转基因植物抗旱性的直接证
据，本研究检测了 GmERF6 转基因拟南芥植株在干
旱条件下的表型，并对 GmERF6 蛋白的亚细胞定位
和结合特性作分析，为 GmERF6 基因在植物抗逆基
因工程中的应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
大豆品种吉林 32、转 GmERF6 基因拟南芥 T2
代 种 子［9］、 带 有 目 的 基 因 的 克 隆 载 体 pMD18-T-
GmERF6 均由吉林大学植物种质资源与利用研究室
提供。原核表达载体 pET28、植物表达载体 PBI121-
GFP 及根癌农杆菌 EHA105 菌株、大肠杆菌 DH5α
菌株和 Rosetta（DE3）菌株等均由本实验室保存。
所用引物均由北京六合华大基因公司合成，引物序
列如表 1 所示（酶切位点用下划线标示）。
1.2 方法
1.2.1 GmERF6 蛋白的亚细胞定位分析 以 T 载体
质粒 pMD18-T-GmERF6 为模板，用亚细胞定位引物
表 1 所用引物序列
引物名称 引物序列 酶切位点
亚细胞定位引物 F 5-GCTCTAGAATGGCCCCAAGAGACAG-3 Xba I
亚细胞定位引物 R 5-GCTCTAGAGGCAACCTCCGGGAGA-3 Xba I
原核表达引物 F 5-CGAGCTCATGGCCCCAAGAGACAGC-3 Sac I
原核表达引物 R 5-GGGTTCGAATCAGGCAACCTCCGGGAG-3 Hind III
GCC 探针序列引物 F 5-AATTCATAAGAGCCGCCACTCATAAGAGCCGCCACTCCC-3 无
GCC 探针序列引物 R 5-GGGAGTGGCGGCTCTTATGAGTGGCGGCTCTTATG-3 无
mGCC 探针序列引物 F 5-AATTCATAAGATCCTCCACTCATAAGATCCTCCACTCCC-3 无
mGCC 探针序列引物 R 5-GGGAGTGGAGGATCTTATGAGTGGAGGATCTTATG-3 无
进行 PCR 扩增。扩增产物与用同样酶酶切的 pBI121-
GFP 载体连接，构建成组成型表达的 pBI121-GmER-
F6-GFP 融合蛋白植物表达载体，并将其转化根癌
农杆菌 EHA105。参考刘肖飞和梁卫红［10］的方法，
利用农杆菌介导法转化洋葱表皮细胞。用 MS 液体
培养基清洗共培养后的洋葱表皮，置于载玻片上，
90% 甘油封片后在激光共聚焦显微镜下拍照。
1.2.2 GmERF6 蛋白的纯化及凝胶阻滞分析（EM-
SA） 以 T 载体质粒 pMD18-T-GmERF6 为模板，用
原核表达引物进行 PCR 扩增。扩增产物与用同样
酶酶切的 pET28 载体连接并转化大肠杆菌 Rosetta
（DE3）。重组蛋白的诱导表达参照翟莹等［11］的方法
进行，按照 His 标记蛋白纯化套装试剂盒（TIANDZ）
说明书对其进行纯化回收。使用 Bradford 蛋白定量
试剂盒（TIANGEN）测定回收液中的蛋白含量。
参照 Liu 等［12］的方法并加以修改进行 EMSA。
将 5-7 μg 纯化蛋白、0.5 μL 双链探针加到结合缓冲
液中，补水至终体积 15 μL，室温结合 25 min。加 2
μL 6×loading buffer 混匀，于 8% 非变性聚丙烯酰胺
凝胶中跑电泳（冰上进行），100 V 恒压，进行约 1.5
h 后拆板，浸泡于 EB 中染色 10 min，紫外灯下拍照。
1.2.3 GmERF6 转 基 因 拟 南 芥 干 旱 胁 迫 条 件 下 萌
发率测定 取 100 粒野生型拟南芥（WT）和 T2 代
GmERF6 转基因拟南芥种子，分别播种于含有 0%、
2%、3% 和 4% 聚乙二醇（PEG）8000 的 MS 培养基
上，在湿度为 80%，16 h 光照（24℃）/8 h 黑暗（22℃）
条件下培养 7 d，重复处理 3 次，统计萌发率。
1.2.4 GmERF6 转基因拟南芥干旱胁迫条件下表型观
察 将 WT 拟南芥和 T2 代 GmERF6 转基因拟南芥种
子播种于小花盆中，在湿度为 80%，16 h 光照（24℃）/8
h 黑暗（22℃）条件下培养 2 周，选取长势一致的幼苗，
停止浇水 18 d，每盆 7 棵植株，重复处理 3 次，用
相机记录拟南芥表型。
2 结果
2.1 GmERF6蛋白的亚细胞定位
采 用 农 杆 菌 介 导 的 遗 传 转 化 将 对 照 空 载 体
2013年第12期 75翟莹等 ：大豆乙烯响应因子 GmERF6 的功能分析
pBI121-GFP 和 目 的 载 体 pBI121-GmERF6-GFP 分 别
转化到洋葱表皮细胞。激光共聚焦显微镜扫描结果，
如图 1 所示，转化对照空载体 pBI121-GFP 后，绿
色荧光蛋白（GFP）遍布于洋葱表皮的整个细胞中，
观察不到明显的细胞核，表明 GFP 在整个细胞中都
表达 ；而在转化 pBI121-GmERF6-GFP 载体后，GFP
只在洋葱表皮细胞的细胞核中表达，表明 GmERF6
蛋白定位于细胞核中。
fluorescence
35S:GFP GmERF6:GFP
bright-filed
overlay
图 1 GmERF6 蛋白的亚细胞定位
2.2 GmERF6蛋白与GCC-box元件的结合
经 Bradford 法 测 定 洗 脱 液 中 GmERF6 蛋 白 含
量为 0.61 mg/mL，可用于后续试验。将纯化后的
GmERF6 蛋白分别与人工合成的 GCC 探针和 mGCC
探针进行 EMSA。结果如图 2 所示，在只含有自由
探针和 GmERF6 蛋白的泳道中没有形成滞后带（图
2，1、2 泳道）；当 GmERF6 蛋白与 GCC 探针混合时，
在泳道顶部形成明显的滞后带（图 2，3 泳道）；相反，
当 GmERF6 蛋白与 mGCC 探针混合时，泳道中没有
形成滞后带（图 2，4 泳道）。此结果表明 GmERF6
蛋白在体外可与 GCC-box 元件特异结合，由此推测
GmERF6 转录的蛋白在大豆中可与启动子中的 GCC-
box 元件相结合，以此调控下游抗逆基因的表达。
2.3 GmERF6转基因拟南芥的抗旱性鉴定
首先通过 PEG 模拟干旱试验对拟南芥种子萌发
率进行检测。结果如图 3 所示，在没有进行干旱处
理时，野生型（WT）和转基因拟南芥种子的萌发
1 2 3 4
1 ：GCC 和 mGCC 自 由 探 针 ；2 ：GmERF6 蛋 白 ；3 ：GCC 探 针 和 GmERF6
蛋白混合物 ；4 ：mGCC 探针和 GmERF6 蛋白混合物
图 2 GmERF6 蛋白与 GCC-box 的结合情况
率都接近于 100%，二者相差不大 ；当 PEG 处理浓
度达到 2% 时，GmERF6 转基因拟南芥种子萌发率
（91.33%）极显著高于 WT 拟南芥种子（72.67%）；
当 PEG 处理浓度分别达到 3% 和 4% 时，转基因拟
南芥种子萌发率（82%、45.67%）均显著高于 WT
拟 南 芥 种 子（61.33%、22.67%）。 表 明 GmERF6 可
以提高转基因拟南芥干旱条件下的种子萌发率。
100
80
60
40
20
㨼ਁ
⦷%

0
0 2 3 4
PEG 8000%
**
*
*
WT
GmERF6
** 表示在 1% 概率水平上差异显著 ；* 表示在 5% 概率水平上差异显著
图 3 干旱胁迫下 GmERF6 转基因拟南芥种子萌发率
接下来对拟南芥植株进行断水处理 18 d，观察
植株表型。结果如图 4 所示，断水处理 18 d 后，WT
拟南芥植株全部严重枯萎，下部伴随有轻微的黄化
现象 ；而转基因拟南芥植株相对于 WT 植株来说生
长的比较健康，并且开始开花。表明 GmERF6 提高
了转基因拟南芥的抗旱能力。
3 讨论
转录激活子在植物防御与胁迫响应中发挥重要
的调控作用［13，14］。但在正常生长条件下，持续地
激活大量防御与胁迫响应相关基因的表达从植物代
谢角度来说是一种浪费，甚至会对植物造成伤害。
转录抑制子就是一种在正常生长发育条件下控制植
物体内胁迫相关基因表达的重要方法［15］。GmERF6
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第12期76
型的 ERF 转录因子结合元件［5］。目前，多采用体
外 EMSA 来鉴定蛋白与元件的作用情况［21，22］。在
EMSA 中通常采用放射性同位素来标记探针，但放
射性同位素不易操作，且对人体存在危害。Liu 等［12］
在 EMSA 中用 EB 染色代替传统的放射性同位素标
记探针发现，BnDREBIII-1 蛋白能够与 GCC-box 元
件和 DRE 元件结合并调控下游基因的表达。本研
究同样采用了 EB 染色的 EMSA 方法，让 GmERF6
蛋白与 GCC-box 探针结合，经非变性聚丙烯酰胺凝
胶电泳后于 EB 中染色，最终证实了 GmERF6 蛋白
在体外可以与 GCC-box 元件特异结合。但本研究未
能验证 GmERF6 蛋白与 DRE/CRT 元件的结合情况。
Park 等［6］的研究表明，烟草中的 ERF 转录因子 Tsi
蛋 白 与 DRE/CRT 元 件 的 结 合 活 性 要 弱 于 与 GCC-
box 元件的结合活性。由此推测，GmERF6 蛋白与
DRE/CRT 元件的结合活性也较弱，可能无法用 EB
染色的 EMSA 检测到。
研究发现，某些外源基因在植物体内稳定的超
表达以后会引起转基因植物生长延缓，出现植株矮
化和开花期延迟现象，甚至导致植株死亡［23，24］。本
研究中，转基因拟南芥植株在生长发育的各个阶段
与野生型植株生长情况基本一致，没有发生生长延
缓、植株矮化以及生育期改变等情况。由此表明，
大豆 GmERF6 基因在拟南芥中稳定的超表达并不影
响其生长和发育。前期研究表明 GmERF6 的过量表
达可降低转基因拟南芥植株的离体脱水率［9］。本试
验通过干旱处理下转基因拟南芥种子萌发率检测和
植株表型观察进一步证实，GmERF6 可提高转基因
拟南芥对干旱的抗性，为植物抗逆基因工程提供有
效基因资源，并为大豆 ERF 转录因子基因功能的理
论研究提供有力的依据。
4 结论
大豆转录因子 GmERF6 蛋白定位于细胞核中 ；
GmERF6 蛋白可在体外与 GCC-box 元件特异结合 ；
GmERF6 导入拟南芥后可提高转基因拟南芥对干旱
的抗性。
参 考 文 献
［1］ Xiong L, Ishitani M, Zhu JK. Interaction of osmotic stress,
A B
A ：WT 拟南芥 ；B ：GmERF6 转基因拟南芥
图 4 干旱胁迫下 GmERF6 转基因拟南芥表型
为含有 EAR 抑制元件的转录抑制子［9］。胁迫相关
的 EAR 转录抑制子在植物细胞中至少行使两个功
能 ：（1）在没有任何胁迫发生时抑制防御反应的发
生和胁迫基因的表达 ；（2）调控胁迫相关基因的激
活，防止它们因失控导致过量表达而对植物造成伤
害［15］。Zhang 等［8］在大豆中分离了一个含有 EAR
元件的转录抑制子 GmERF4，该基因受乙烯诱导表
达，转基因烟草对盐和干旱胁迫都有一定的耐性，
表明该基因在大豆应对非生物胁迫时起一定作用。
同样，过量表达一个含有 EAR 抑制元件的 Cys2/His2
型锌指蛋白提高了转基因拟南芥的抗盐性［16］。
转录因子基因在细胞质中合成，但在细胞核中
发挥调控作用，因此必须在核定位信号的引导或依
靠与具有核定位信号的转录因子的协助下进入细胞
核内发挥功能作用。不论 ERF 转录激活子还是转录
抑制子，如 Pti4/5/6、Tsi1 和 AtERF4 等都定位于细
胞核中［7，17，18］。此前的蛋白质氨基酸序列分析表
明，GmERF6 含有两个预测的核定位信号［9］，推测
其编码蛋白定位于细胞核中。本研究对此作了进一
步的试验验证，以根癌农杆菌介导的方法转化洋葱
表皮细胞，通过检测 GFP 报告基因的表达，确定了
GmERF6 蛋白定位于细胞核中。以往有关基因的亚
细胞定位研究大多采用的是基因枪转化法［19］，但此
方法需要昂贵的试验设备且操作复杂。与其相比，
农杆菌介导的转化方法具有试验成本低，不需要特
殊仪器，并且对操作者的技术要求不高等优点［20］。
转录因子与顺式元件的结合特性对于了解转录
因子的功能与作用机制是必不可少的。以往研究表
明，ERF 转录因子可以与多种逆境顺式作用元件结
合，调控下游基因的表达，其中 GCC-box 是最典
2013年第12期 77翟莹等 ：大豆乙烯响应因子 GmERF6 的功能分析
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（责任编辑 狄艳红）