全 文 ：·研究报告· 2011年第12期
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
收稿日期 : 2011-05-03
基金项目 : 国家林业局“948”项目（2004-44）
作者简介 : 陈少瑜，女，博士，研究方向：林木种质资源与遗传育种；E-mail: sherry9872@yahoo.com.cn
丽江云杉体胚发生过程差异蛋白分析
陈少瑜1 吴涛1 陈芳1 王寅冰2 易善军2
（1云南省林业科学院 国家林业局云南省珍稀濒特森林植物保护和繁育实验室
云南省森林植物培育与利用重点实验室，昆明 650204 ；2西南林学院，昆明 650224）
摘 要 ： 以丽江云杉非胚性愈伤组织、胚性愈伤组织以及体胚发育过程的球型胚、鱼雷胚和子叶胚培养物为材料，采用双
向电泳技术对体胚发生过程中特异表达蛋白进行分析。结果表明，丽江云杉非胚性、胚性愈伤组织及不同发育阶段体胚的蛋白质
种类丰富（1 857-2 344 个），胚性愈伤及发育体胚蛋白种类多于非胚性愈伤，球型胚蛋白种类最为丰富（2 344 个）。非胚性、愈
伤组织及各发育阶段体胚共检测到 44 个差异表达蛋白，它们有明显的变化特点，子叶胚阶段的差异蛋白变化最为显著（23 个，占
特异蛋白总数的 52.3%），鱼雷胚新出现大比例的分子量小于 30 kD、pI 为 6.0 左右的弱酸性小分子量特异蛋白（8 个，占此阶段特
异蛋白总数的 88.9%），这些体胚发育晚期特异表达蛋白可能与体胚形态建成有密切关系。
关键词 ： 丽江云杉 体细胞胚胎发生 胚性愈伤组织 双向电泳技术 差异蛋白
Analysis on Differential Expression Proteins During Somatic
Embryogenesis of Picea likiangensis
Chen Shaoyu1 Wu Tao1 Chen Fang1 Wang Yinbing2 Yi Shanjun2
（1Yunnan Academy of Forestry， Yunnan Laboratory for Conservation of Rare， Endangered and Endemic Forest Plants of State Forstry
Administration， Yunnan Key Laboratory for Forest Plant Cultivation and Utilization， Kunming 650204;
2 Southwest Forestry College， Kunming 650224）
Abstract: Analysis on differential expression proteins during somatic embryogenesis development of Picea likiangensis was conducted
by 2-DE technique， in which non-embryogenic callus， embryogenic callus， globular embryo， torpedo-shaped embryos， cotyledonary embryo
were applied. The results showed that the above 5 samples demonstrated rich kinds of proteins （1 857-2 344 kinds）. The proteins in non-
embryogenic callus were less than other 4 samples and globular embryos showed the most proteins （2 344 kinds）. Total of 44 differential
expression proteins were detected for all 5 samples， which showed a obvious change during somatic embryo development. The differential
proteins in cotyledonary stage had the siginificant change， for which 23 differential proteins emerged， accounting for 52.3% of the total. In
torpedo-shaped stage， a large proportion of low molecular weight （lower than 30 kD） and weak acid （pI6.0） differential proteins appeared.
These highly differential expressed proteins in later somatic embryogenesis were probably closely associated with somatic embryo development.
Key words: Picea likiangensis Somatic embryogenesis Embryogenic callus Two-dimentional electrophoresis Ddifferential
expression proteins
植物体细胞胚胎发生（somatic embryogenesis）
是植物界一种普遍存在的现象，无论是在裸子植物、
双子叶植物还单子叶植物上均有体胚发生的研究报
道 [1]。据不完全统计，全世界约 1 000 多种高等植物
作过离体培养的研究，其中大多数可通过体细胞胚
发生的途径形成再生植株，并在许多珍稀或重要树
种上实现了体细胞工程育苗的产业化 [2]。如今，植
体细胞胚胎发生不仅成为植物快速繁殖的重要手段
之一，而且已发展成为植物胚胎发生机理研究和遗
传转化的重要系统。
针叶树种是在世界范围内分布广泛的一类重要
的用材树种，在整个林木类群中占有重要的地位，
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011年第12期118
但相对于阔叶树种，这一类树种体细胞胚胎发生被
认为是难度最大的 [3]。自 1985 年，首例针叶树种挪
威云杉（Picea abies）未成熟胚经体细胞胚再生植株
成功以来 [4]，针叶树种的体外胚胎发生研究迅速兴
起，并取得了很大进展，已有不少成功诱导体细胞
胚的报道 [5，6]。据不完全统计，到目前为止，国内
外已经从冷杉属（Abies）、落叶松属（Larix）、云杉
属（Picea）、 松 属（Pinus）、 黄 杉 属（Pseudotsuga）
及红杉属（Sequoia）等的 50 多种针叶树培养产生了
体细胞胚。该领域的研究主要集中在云杉属和松属，
其中火炬松（Pinus taeda）、辐射松（P. radiata）、花
旗松（Pseudotsuga menziesii）及挪威云杉等树种体
胚途径的再生植株已应用于生产实践 [7]。20 余年来，
尽管针叶树种体胚发生研究取得了较大进展，但成
功诱导体胚的针叶树种数量还很有限，体胚发生机
理的研究还不够深入，大多树种体细胞胚的生产应
用还存在许多问题。鉴于此，在开展体胚发生体系
探索的同时，加强体胚发生生理生化机理以及进一
步的体胚发生基因调控及表达研究显得尤为重要。
本研究以云杉属树种丽江云杉（Picea likiangensis）
非胚性愈伤组织、胚性愈伤组织及不同发育阶段体
胚为材料，采用蛋白质双向电泳技术对各材料进行
差异蛋白分析，揭示差异蛋白及变化情况，为针叶
树种体胚发生分子机理研究提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
以丽江云杉非胚性愈伤组织（NEC）、胚性愈伤
组织（EC1）以及球形胚（EC2）、鱼雷胚（EC3）、
子叶胚（EC4）发育阶段的体胚为差异蛋白分析的
材料。
丽江云杉体胚发生的试验方法参照文献 [8]，以
胚性愈伤诱导率最高的 DBS-98 家系合子胚为外植
体，接种于胚性愈伤诱导培养基（1/2 LM+3 mg/L
2, 4-D +1.5 mg/L BA，附加 2% 蔗糖，500 mg/L 谷氨
酰胺，1 g/L 水解酪蛋白，100 mg/L 肌醇，0.7% 琼脂粉，
pH5.8），室温暗中培养，10-12 周部分合子胚产生
胚性愈伤组织。将胚性愈伤组织挑出，进行继代培养。
继代培养（1/2 LM+1 mg/L 2, 4-D +1.5 mg/L BA，暗中
培养）的胚性愈伤组织转入球型胚同步化培养基（1/2
LM+0.2 mg/L 2，4-D +60 mg/L ABA +40 g/L 蔗糖）培
养 15 d，得到球型胚（EC2），球型胚转入体胚发育
培养基（1/2 LM+60 mg/L ABA +40 g/L 蔗糖），第 20
天得到鱼雷胚（EC3），第 35 天得到子叶胚（EC4）。
所有材料取一次平行样，-30℃冰箱保存备用。
1.2 蛋白质样品的提取
采用三氯乙酸（TCA）/ 丙酮法提取蛋白质。样
品中加入适量聚乙烯丙烙烷酮（PVP），液氮下研磨
成白色粉末 ；加入 10 倍体积的 -20℃预冷丙酮（含
10% TCA 和 0.07% β- 巯基乙醇），涡旋后静置 -20℃
过夜 ；4℃，15 000 r/min 离心 20 min，弃上清，沉
淀悬浮于 -20℃预冷的含 0.07% β- 巯基乙醇丙酮溶
液中，-20℃过夜 ；4℃，15 000 r/min 离心 20 min，
弃上清，重复清洗两次，离心，沉淀干燥 ；加入
适量蛋白裂解液、蛋白酶抑制剂 PMSF 至终浓度 1
mmol、EDTA 至终浓度 2 mmol/L，5 min 后加入 DTT
至终浓度 10 mmol/L（蛋白裂解液成分：7 mol/L 尿素、
2 mol/L 硫脲、4% NP40、20 mmol/L Tris，调 pH8.5）；
冰浴超声促溶，15 000 r/min 离心取上清 ；上清用
clean up 试剂盒（GE 公司）处理得到蛋白液（参考
试剂盒说明书操作）。
1.3 第一向：固相pH梯度等电聚焦（IEF）
1.3.1 胶 条 选 择 及 蛋 白 样 品 制 备 选 用 24 cm，
pH4-7 的固相 pH 梯度（IPG）干胶条作为第一向电
泳的凝胶。根据样品蛋白的含量，取一定量样品（每
样品含蛋白 200 µg），加入 1 mol/L 二硫苏糖醇（DTT）
至终浓度 50 mmol/L，加入 IPG 缓冲液到终浓度 0.2%
或 者 0.5%， 加 入 rehydration buffer 使 总 体 积 达 到
450 µL，充分混匀（或超声 5-10 min），14 000 r/min，
10℃离心 5 min 备用。
1.3.2 电泳 取出胶条室温放置 10 min，平衡胶条
的温度，沿着聚焦盘中槽的边缘从左至右线性加入
样品，分清胶条的正负极，将 IPG 胶条胶置于聚焦
盘中样品溶液上，在每根胶条上覆盖 1-3 mL 矿物油，
设置等电聚焦程序 ：依次 50 V 电泳 4 h，500 V 电泳
1 h，1 000 V 电泳 1 h，8 000 V 电泳 8 h，按照以上
程序开始等电聚焦。
1.3.3 固定 将胶转移至 20%（体积分数）TCA 溶
液中，在摇床上震荡 30 min，固定蛋白质。
2011年第12期 119陈少瑜等 ：丽江云杉体胚发生过程差异蛋白分析
1.3.4 平衡 倒掉固定液，用蒸馏水漂洗 15 min，
倒掉蒸馏水。加入含 1% DTT 的平衡液Ⅰ（50 mmol/L
Tris-HCl pH8.8，6 mol/L 尿素，30% 甘油，2% SDS，
100 mg DTT 10 mL，痕量溴酚蓝）中，低速摇床上
放置 15 min；取出胶条转入 2.5% 含碘代乙酰胺（IAA）
的平衡液Ⅱ（50 mmol/L Tris-HCl pH8.8，6 mol/L 尿素，
30% 甘油，2% SDS，250 mg IAA/10 mL，痕量溴酚蓝）
中，低速摇床上放置 15 min。平衡后的胶条要立刻
胶条转移，进行 SDS-PAGE。
1.4 第二向 SDS-PAGE垂直板电泳
1.4.1 凝胶制备 安装灌胶模具，配制 SDS-PAGE
凝胶（凝胶浓度 T=12%）。
1.4.2 电泳 小心将已平衡好的第一向胶条放置在
胶面上，支持膜紧贴长玻板，轻轻压紧，胶条一端（一
般为碱端）加入分子量 marker，覆盖一层 0.5% 琼脂
糖固定胶条，开始电泳。设置控温系统为 25℃，开
始 10 mA/ 板，30 min 后增至 50 mA/ 板，至溴酚兰
条带距离凝胶底部 1 cm 处停止电泳。
1.5 染色（银染）
1.5.1 染色 固定（40% 乙醇，10% 冰醋酸）30 min
或 更 长 时 间 ；致 敏（75 mL 30% 乙 醇，17 g 乙 酸
钠，28.2 g 三水乙酸钠，0.5 g 硫代硫酸钠，加水至
终体积 250 mL）30 min ；水洗（ddH2O，3 次），每
次 10 min ；银染（0.625 g AgNO3，100 µL 37% 甲醛，
加水至终体积 250 mL）20 min；水洗（ddH2O，2 次），
每次 1 min。
1.5.2 显色 在 6.25 g Na2CO3，50 µL 37% 甲醛，加
水至终体积 250 mL 的显色液中显色至背景透明，蛋
白点清晰。
1.5.3 终止及保存 置于 3.65 g EDTA.Na2·2H2O（或
1 g 甘氨酸加水至终体积 250 mL 中 10 min，终止显
色反应 ；水洗（ddH2O，2 次），每次 10 min ；1% 冰
醋酸，4℃保存。
1.6 图胶分析
染色后的图胶用 ImageScanner 扫描仪进行扫
描（软件 ：Powerlook2100，参数 ：全彩、300 dpi）。
用图像分析软件（Image master 5.0）对扫描图像通
过电检测和手动修改进行图像分析，包括凝胶的校
准、蛋白点的检测和匹配、图像数据的分析和整合。
按照一定的蛋白检测点参数设置以 NEC 与 EC1，
EC1 与 EC2，EC2 与 EC3，EC3 与 EC4 进行两两图
胶间蛋白点的匹配和分析，以获取差异蛋白点及相
关信息。
2 结果
2.1 丽江云杉胚性、非胚性愈伤及不同发育阶段
体胚的2-D电泳图谱
通过等点聚焦双向电泳分离了丽江云杉胚性、
非胚性愈伤及不同发育阶段体胚（球型胚、鱼雷胚
和子叶胚）共 5 份样品的蛋白质（图 1）。结果表
明，5 份样品分离到的蛋白质点 1 857-2 344 个不等，
其中大多数蛋白为 30 kD 以上蛋白，分布在 pH4-7
之 间。5 份 样 品 分 离 到 的 总 蛋 白 点 分 别 为 NEC ：
1 857 个 ；EC1 ：1 999 个 ；EC2 ：2 344 个 ；EC3 ：
2 285 个 ；EC4 ：2 205 个。胚性愈伤组织及发育体
胚蛋白种类多于非胚性愈伤组织，球型胚蛋白种类
最为丰富（图 2）。
2.2 丽江云杉胚性、非胚性愈伤及不同发育阶段
体胚的差异蛋白
应用图像分析软件 Image master 5.0 进行非胚性
与胚性愈伤（NEC 与 EC1），胚性愈伤与球型胚（EC1
与 EC2），球型胚与鱼雷胚（EC2 与 EC3），鱼雷胚
与子叶胚（EC3 与 EC4）两两图胶间蛋白点的匹配
和差异分析，得到两两样品间差异蛋白情况，即两
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011年第12期120
两样品间消失和新出现的蛋白（以下称特异蛋白）
（表 1）。表 1 显示，非胚性愈伤、胚性愈伤、球型胚、
鱼雷胚和子叶胚材料共有 44 个特异蛋白。与 NEC
比较，EC1 有特异蛋白 7 个，pI 为 4.1-6.5，分子量
为 22.74-70.43 kD（其中新增加蛋白 3 个，消失 4 个）；
与 EC1 相较，EC2 有特异蛋白 5 个，pI 为 5.4-6.5，
分 子 量 为 12.48-48.68 kD（ 其 中 新 增 加 蛋 白 3 个，
消失 2 个）；与 EC2 相较，EC3 有特异蛋白 9 个，pI
为 4.2-6.5，分子量为 16.12-39.87 kD（其中新增加
8 个，消失 1 个）；与 EC3 相较，EC4 有特异蛋白 23 个，
pI 为 4.2-6.7，分子量为 23.76-73.13 kD（其中新增
加 12 个，消失 11 个）。44 个特异蛋白分布于 pI：4-7，
分子量 ：10-70 kD 区域，其中以小于 40 kD 分子量
的蛋白居多，有 26 个，占总数的 59.1%，尤其鱼雷
胚阶段新出现的 8 个特异蛋白，全部为小于 40 kD
分析材料 蛋白总数 出现蛋白 出现蛋白数 消失蛋白 消失蛋白数
NEC
EC1
7 1721（58.44，5.4）; 2335（39.37，4.1）;
2422（37.26，5.7）
3 1229（70.43，6.5）; 1895（41.53，4.3）;
2125（36.43，4.3）; 2666（22.74，6.0）
4
EC2 5 1816（48.68，5.8）; 2477（30.94，6.0）;
3286（12.48，6.4）
3
1810（55.72，6.5）; 2968（21.78，5.4） 2
EC3 9 1806（39.87，6.0）; 2252（29.16，6.5）;
2319（26.69，5.9）; 2476（20.72，5.9）;
2528（19.18，6.0）; 2563（17.55，6.0）;
2596（16.73，6.4）; 2613（16.12，4.2）
8 2477（30.94，6.0） 1
EC4 23 1608（73.13，5.6）; 1888（59.26，6.7）;
2021（55.27，6.1）; 2049（54.08，6.4）;
2072（53.71，5.6）; 2229（48.42，6.6）;
2386（43.41，5.3）; 2480（41.38，5.3）;
2771（36.34，5.3）; 2784（36.11，4.9）;
2951（32.70，5.0）; 3060（30.84，4.3）
12 1336（55.81，6.6）; 1369（55.52，6.4）;
1379（54.81，5.0）; 1459（50.79，5.4）;
1527（48.86，5.3）; 1812（39.68，4.3）;
1872（38.21，5.0）; 2103（32.51，5.9）;
2147（31.91，4.8）; 2190（30.39，4.2）;
2401（23.76，6.7）
11
表 1 非胚性愈伤、胚性愈伤及不同发育阶段体胚的特异蛋白
括号前为蛋白编号，括号内分别为分子量（kD）和等电点（pI）
蛋白，而且其中 4 个蛋白小于 20 kD。可见，随着
体胚的发育进程，差异蛋白的数量逐渐增加（图 3），
子叶胚阶段（EC4）出现和消失的特异蛋白数量最多，
一共 23 个，占了总数的 52.3%，其次是鱼雷胚阶段
（EC3），有 9 个，而且其中 8 个为新出现的小分子
量蛋白，由此也可以推测，特异蛋白的变化与体胚
发育中后期组织和形态的建成密切相关。
2011年第12期 121
3 讨论
3.1 丽江云杉非胚性、胚性愈伤组织及不同发育
阶段体胚的蛋白质种类丰富
研究中每个样品都分离到 2 000 左右个蛋白
质，大部分蛋白组分稳定，胚性愈伤及发育体胚蛋
白种类高于非胚性愈伤，球型胚蛋白种类最为丰富。
总体上，愈伤组织及不同发育阶段体胚大部分
主要蛋白质组分没有发生变化，表明对于这一物种
来说，蛋白质组分相对稳定，同时各材料的蛋白组
分又具有各自的特异性，材料间存在蛋白组分差异，
这些差异蛋白与细胞功能和生理状态密切相关。由
于分析材料间含水量差异较大，而且难以测定，本
研究没能测定各材料的蛋白质含量变化，但从蛋白
质数量上，胚性愈伤及发育阶段体胚的蛋白质种类
皆高于非胚性愈伤组织，其中又以球型胚时期（EC2）
的蛋白种类最多（2 344 个），说明脱分化状态的非
胚性愈伤组织，基因的表达处于较低水平，而细胞
初步分化的胚性愈伤组织以及分化状态的发育阶段
体胚基因表达活跃，蛋白质代谢和积累旺盛，尤其
处于胚胎发育早期的球型胚时期，是脱分化细胞再
分化成体胚的第一步，基因表达最为活跃，这与陈
伟等对“乌叶”荔枝的研究以及梁文裕等对“乌龙岭”
龙眼的研究结果基本一致 [9,10]，即胚胎基因在发育前
期表达活跃，与胚胎所处的生理状态相一致。而安
娜等 [11] 对龙眼品种红孩子体胚发育过程各主要发育
阶段（胚性愈伤组织，球型胚，子叶胚，早期成熟
胚，中期成熟胚和晚期成熟胚）进行的双向电泳分析，
结果是胚性愈伤组织中总蛋白的种类最多，随着体
胚发生的进行，蛋白的种类逐渐减少。以上研究结
果表明，在体胚发育启动前后，胚胎发育蛋白基因
处于活跃的表达状态，产生大量的蛋白质，而这些
种类繁多的蛋白质与之后的细胞分化和形态建成不
无关系，因此深入研究这一阶段种类繁多的蛋白质
的性质和功能将对胚胎发育启动的分子调控有重要
意义。
3.2 非胚性、胚性愈伤组织及体胚发育不同阶段
的特异蛋白变化显著
愈伤组织及各发育阶段体胚有明显的特异蛋
白变化，其中以子叶胚阶段（EC4）的差异蛋白变
化最为显著，鱼雷胚阶段（EC3）新出现蛋白所占
此阶段差异蛋白的比例较大，而且大多为小分子量
蛋白。
至今，已有不少在不同植物的胚性细胞、胚性
愈伤组织、胚状体、合子胚及不同发育阶段体胚等
材料中检测到特异蛋白的报道。例如，早在 20 世纪
80 年代，人们对水稻、玉米和豌豆体胚发生特异蛋
白的研究发现，这些植物的胚性愈伤组织中都有相
对分子量 45-55 kD 的胚胎发育特异蛋白的合成 [12-14]；
对于苜蓿体胚发生过程特异蛋白的研究，结果表明
体胚发育过程中存在 50 kD 的特异蛋白，而且证明
该蛋白为膜相关蛋白 [15] ；另外，Hvoslefede 等和郑
晓锋等 [16,17] 在西洋参、香雪兰等植物体胚发育过程
皆检测到胚胎发育特异蛋白。在植物胚胎发育过程
中，处于特定状态下的组织或细胞中确实存在某些
特异蛋白，尽管对于不同植物，这些特异蛋白的数量、
相对分子量，以及出现的时间不尽相同，但它们似
乎都与组织或细胞在该状态下特定的功能和性质有
关，这些特异性蛋白可作为分子标记来鉴别潜在的
胚性培养物，跟踪胚胎发育，并为进一步探讨体胚
发生的基因调控和分子机理提供参考。
本研究检测到丽江云杉体胚发育过程的特异
蛋白共有 44 个，其中子叶胚（EC4）有 23 个，占
特异蛋白总数的一半以上（52.3%）; 其次，鱼雷胚
（EC3）占总数的 20.5%。另外一个显著的特征就是
鱼雷胚（EC3）新出现了较大比例的特异蛋白，EC3
新出现的蛋白有 8 个，占了 EC3 特异蛋白总数 9 个
的 88.9%，占所有特异蛋白 44 个的 18.2%。可见，
与球型胚相较，尽管鱼雷胚和子叶胚阶段的蛋白种
类减少了，但差异表达蛋白数量的变化却明显增大。
对变化较大的 EC3 和 EC4 差异表达蛋白进一步分析
可以看到，EC3 新出现的特异蛋白大多为相对分子
量小于 30 kD、等电点在 6.0 左右的弱酸性小分子量
蛋白，在新出现的 8 个特异蛋白中只有 1 个蛋白的
分子量大于 30 kD（ID: 1806，MW: 39.87，pI: 6.0），
而且除了 1 个蛋白（ID: 2613，MW: 16.12，pI: 4.2）
的 pI 值为 4.2 以外，其他 7 个都在 6.0 左右。EC4
阶段 23 个差异表达蛋白中新出现的 12 个蛋白中只
有 ID: 1608（73.13，6.0）分子量较大，其他 11 个
蛋白分子量皆在 30-60 kD 之间，消失的 11 个蛋白
陈少瑜等 ：丽江云杉体胚发生过程差异蛋白分析
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011年第12期122
除了 ID: 2401（23.76，6.7），其他 10 个蛋白的分子
量也皆在 30-60 kD 之间。可见，在 EC4 阶段，除了
EC3 阶段合成的大量小分子量蛋白仍在维持其生理
作用外，这一群 EC4 阶段 30-60 kD 差异表达蛋白对
于子叶胚的形成有重要作用。有不少报道在其他植
物胚胎发育晚期会新出现大量的分子量为 10-30 kD
的蛋白，被称为胚胎发生晚期大量表达蛋白，Lea
（late embryogenesis abundant）蛋白。植物胚胎发育
晚期要经历一个高渗透压下的脱水过程，而这些大
量表达的与细胞耐旱、耐盐等逆境密切相关的 Lea
蛋白在这一特殊时期起到维持细胞正常生理活动的
作用 [18,19]。可以推断，这些在体胚发育过程中差异
表达的蛋白与胚胎发育过程鱼雷胚和子叶胚的细胞
分化及形态建成密切相关，应将它们作为胚胎发育
的一种重要分子标记开展进一步的质谱鉴定及生物
功能等相关研究。
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）