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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第12期
植物的生命过程受体内外各种信号的调控。
Ca2+ 是细胞内 1 个非常重要的第二信使，它可以调
控 多 种 生 理 反 应。 钙 调 素（calmodulin，CaM） 作
为细胞内 Ca2+ 受体，绝大多数无酶活性，也无转录
因子活性，更不是结构蛋白，只有通过其下游的钙
调素结合蛋白（calmodulin-binding protein，CaMBP）
来调节细胞的生理功能［1-4］。CaMBP 与 CaM 的结合
可分为 Ca2+ 依赖、不依赖和抑制 3 种类型［3］，IQ 基
收稿日期 ：2014-05-26
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31170204），羊城学者科研项目（12A001G）
作者简介 ：黄章科，男，硕士研究生，研究方向 ：植物分子遗传学 ；E-mail ：huang.zhangke@163.com
通讯作者 ：田长恩，男，博士，教授，研究方向 ：植物分子遗传学 ；E-mail ：changentian@aliyun.com
IQ 基序突变对 AtIQM1 的钙调素结合活性的影响
黄章科  张艺能  莫忠蓁  周玉萍  黄小玲  田长恩
（广州大学生命科学学院 植物抗逆基因功能研究广州市重点实验室，广州 510006）
摘 要 ： 旨在确定 IQ 基序中关键氨基酸残基突变对 IQM1 的 CaM 结合活性的影响，利用基因体外定点突变技术将 LQ 缺
失或将 L 突变成 S，并通过酵母双杂交分析突变蛋白 iqm1 的 CaM 结合活性。结果显示，用重组质粒 pGADT7-IQM1CDS、pGADT7-
IQM1Del113-114、pGADT7-IQM1L113S 或 pGBKT7-CaM5 分别转化酵母 AH109，未出现自激活现象 ；用 pGADT7-IQM1CDS 和 pGBKT7-CaM5
共转化酵母能在选择性培养基（SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal）上形成蓝色菌落 ；而用 pGADT7-IQM1Del113-114 和 pGBKT7-CaM5
或 pGADT7-IQM1L113S 和 pGBKT7-CaM5 共转化酵母则不能在选择性培养基（SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp）上形成菌落。结果表明，IQ
基序中 LQ 或者 L 是 IQM1 与 CaM5 结合的关键氨基酸残基。
关键词 ： AtIQM1 IQ 基序突变 酵母双杂交 CaM 结合
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2014.12.021
Effects of Mutations in IQ Motif of AtIQM1 on Its Calmodulin Binding
Huang Zhangke Zhang Yi’neng Mo Zhongzhen Zhou Yuping Huang Xiaoling Tian Chang’en
（Guangzhou Key Laboratory for Functional Study on Stress-Resistant Genes in Plants，School of Life Sciences，
Guangzhou University，Guangzhou 510006）
Abstract: To confirm the effects of mutation of key amino acid residues in IQ motif of AtIQM1 on its calmodulin binding, the LQ was
deleted or L was mutated to S through the mutagenesis technology in vitro. Then calmodulin binding of the mutant protein iqm1 was analyzed via
yeast two-hybrid assay. The self-activation was not observed when the recombinant plasmid pGADT7-IQM1CDS, pGADT7-IQM1Del113-114, pGBKT7-
CaM5 or pGADT7-IQM1L113S was transformed into the yeast AH109 strain, respectively. Blue colonies were achieved on the selective agar plates
（SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal）when pGADT7-IQM1CDS and pGBKT7-CaM5 were co-transformed into AH109 yeast strain. However, the
yeasts which were co-transformed with pGADT7-IQM1Del113-114 and pGBKT7-CaM5 or pGADT7-IQM1L113S and pGBKT7-CaM5 were not able to
grow on the selective medium（SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp）. The results suggest that the LQ or L in IQ motif is required for AtIQM1 to combine
with CaM5.
Key words: AtIQM1 Mutantion in IQ motif Yeast two hybrid Calmodulin binding
序是第一个被发现的 Ca2+ 不依赖性 CaM 结合结构域
（calmodulin-binding domain，CaMBD）， 其 氨 基 酸 序
列为 IQXXXRGXXXR，其中的 I 可变为 L、V 或 M，
第 6 位和 11 位的 R 可变为 K 或 H，第 7 位的 G 同
样缺乏保守性，因此，IQ 基序的完整序列可概括为
［I，L，V］QXXXRXXXX［R，K］［5］。但是，个别
含 IQ 基序的蛋白质与 CaM 的结合也依赖 Ca2+［6， 7］。
在植物中已经发现了 5 个含有 IQ 基序的蛋白质家
2014年第12期 129黄章科等：IQ基序突变对AtIQM1的钙调素结合活性的影响
族［8］：myosin 家族［9-11］、CAMTA 家族［12， 13］、CNGC
家 族［14， 15］、IQD 家 族［6，16，17］ 和 IQM 家 族［18-20］，
分别由 17 个、6 个、20 个、33 个和 6 个成员组成。
IQM 家族成员的 N-端与豌豆重金属诱导蛋白 6A（该
蛋白的编码基因受重金属诱导而表达，但其功能未
知）、C-端与天花粉素（一类使核糖体失活、具有
RNA 结合活性的小分子蛋白）具有较高的同源性［18］。
IQM1（IQ motif containing 1）是 IQM 家族的 1 个成
员，由 At4g33050 编码，只含 1 个 IQ 基序，通过酵
母双杂交和双分子荧光互补试验证明 IQM1 在体内、
外都能与 CaM 结合，并通过蛋白截短试验证明 IQ
基序是其钙调素结合所必需的结构域［20］。为了确证
IQM1 介导的 CaM 信号参与植物细胞生理或生长发
育的调控，需要构建 IQ 基序中关键氨基酸残基突变
的突变互补载体，转入 IQM1 基因的突变体中，观
察突变表型的恢复情况。若突变表型不能恢复，则
说明通过 IQ 基序与 CaM 的结合，即 IQM1 介导的
CaM 信号参与了相关调控 ；否则相反。当然，在构
建植物表达载体前，需要先证实 IQ 基序中关键氨基
酸残基点突变或缺失后 iqm1 的 CaM 结合活性。为此，
本研究利用基因体外定点突变技术将 IQM1 的 IQ 基
序中的关键氨基酸残基 LQ 缺失或者将 L 突变成 S，
然后利用酵母双杂交分析突变蛋白 iqm1 与 CaM 的
结合活性，旨在确定 IQ 基序中关键氨基酸残基突变
对 IQM1 的 CaM 结合活性的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
拟南芥（Arabidopsis thaliana）为 Columbia（Col）
生态型、大肠杆菌菌株为 DH5α、重组质粒 pUC19-
P35S ：eGFP ：IQM1、pUC19-P35S ：eGFP ：CaM5
为 实 验 室 构 建， 酵 母 双 杂 交 系 统（Matchmaker
Gal4 Two-Hybrid System3）由中国科学院华南植物
园 张 明 永 教 授 友 好 转 赠，Pfu DNA Polymerase 购
自 Fermentas 公 司，Carrier DNA 购 自 Sigma 公 司，
pMD18-T Simple、胶回收试剂盒、限制性内切酶、
Ex Taq DNA 聚合酶及 PCR 相关试剂均为 TaKaRa 公
司产品。
1.2 方法
1.2.1 IQM1 基因的 CDS 全长序列获取 以 pUC19-
P35S：eGFP：IQM1 为模板，利用 IQM1 基因引物（F1：
5-TACCCGGGTATGGGTCTTGAAGTTGGGTC-3， 下
划线部分为 Sma I 酶切位点 ；R1 ：5-CCATCGATTT
AACACTTTACAGCCCTAGGGC-3，下划线部分为 Cla
I 酶切位点）进行 PCR 扩增，反应程序为 ：94℃预
变性 4 min ；94℃变性 30 s，64℃退火 30 s，72℃延
伸 90 s，共 35 个循环 ；72℃再延伸 5 min。反应结
束后电泳，并用凝胶成像系统观察、拍照。
1.2.2 pGADT7-IQM1CDS 猎物载体的构建 切取目的
片段所在的凝胶，用胶回收试剂盒回收 IQM1 CDS。
将回收产物与 pMD18-T 连接，转化 E.coli DH5α，挑
取氨苄青霉素抗性菌落，进行 PCR 鉴定。取阳性克
隆摇菌，提取质粒并用 Sma I 和 Cla I 进行双酶切鉴
定后送华大基因公司测序。然后，将经测序证实的
pMD18-IQM1CDS 和 pGADT7 用 Sma I 和 Cla I 双酶切，
电泳后割胶回收目的片段并连接，转化 E.coli DH5α，
进行菌落 PCR 鉴定，并进一步提取质粒进行酶切
鉴定，得到用于酵母双杂交的猎物载体 pGADT7-
IQM1CDS。
1.2.3 IQ 基序中 LQ 缺失和 L 突变成 S 的 PCR 扩增
及其猎物载体的构建 用 Pfu DNA Polymerase，以测
序证实过的 pMD18-IQM1CDS 为模板，分别用 LQ 缺
失 引 物（F2 ：5-GATGCAGCTGCAACTACGAAGG-
TGTACAAGAGTTAC-3，Leu113 和 Gln114 缺 失 ；R2 ：
5-GTAACTCTTGTACACCTTCGTAGTTGCAGCTGC-
ATC-3，Leu113 和 Gln114 缺失）和点突变引物（F3 ：
5-TTGATGCAGCTGCAACTACGTCACAAAAGGTGT-
ACAAG-3，Leu113 突 变 成 Ser ；R3 ：5-CTTGTACA-
CCTTTTGTGACGTAGTTGCAGCTGCATCAA-3，Leu113
突变成 Ser）进行 PCR 扩增，程序为 ：95℃ 2 min ；
95℃ 30 s，62℃/65℃ 30 s，72℃ 4 min，18 个循环 ；
72℃延伸 5 min。扩增完成后用 Dpn I 消化有甲基化
修饰的模板，体外扩增产物因无甲基化修饰而不被
消化。模板消化后灭活 Dpn I，转化 E.coli DH5α，经
菌落 PCR 鉴定后摇菌提取质粒并经酶切鉴定后送
华大基因公司测序。然后用 Sma I 和 Cla I 对测序验
证过的缺失突变质粒 pMD18-IQM1Del113-114、点突变
质 粒 pMD18-IQM1L113S 及 质 粒 pGADT7， 进 行 双 酶
切，割胶回收目的片段并连接转化，经菌落 PCR 和
质粒酶切鉴定，得到酵母双杂交猎物载体 pGADT7-
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第12期130
IQM1Del113-114 和 pGADT7-IQM1L113S。
1.2.4 CaM5 的 PCR 扩增及其诱饵载体的构建 以
pUC19-P35S ：eGFP ：CaM5 为模板，用加有酶切位
点的 CaM5 基因引物（5-TTGAATTCATGGCAGATCA-
GCTCACCGATGATC-3，下划线部分为 EcoR I 酶切位
点 ；5-TGGTCGACTCACTTTGCCATCATAACTTTG-
AC-3，下划线部分为 Sal I 酶切位点）进行 PCR 扩增，
程序为 ：94℃ 4 min ；94℃ 30 s，61℃ 30 s，72℃ 30
s，共 35 个循环 ；72℃延伸 5 min。此后的载体构建
方法同 1.2.2。用卡那霉素进行筛选，EcoR I 和 Sal
I 双酶切鉴定，得到酵母双杂交诱饵载体 pGBKT7-
CaM5。
1.2.5 酵母感受态制备和转化 参考 Clontech 公司
Matchmaker Gal4 Two-Hybrid System3 的 操 作 方 法 制
备 AH109 感受态细胞，取 150 μL 分装于 1.5 mL 离
心管，加入 10 mg/mL 单链 Carrier DNA 5 μL 和各种
质粒（图 3），混匀，再加入 600 μL PEG/LiAc 溶液
（现配现用），涡旋混匀，于 30℃、220 r/min 培养 30
min，加入 70 μL DMSO，颠倒混匀，42℃水浴热激
15 min（每 5 min 轻混 1 次），冰上放置 2 min 后，室
温、12 000 r/min 离心 5 s，弃上清，用 400 μL TE 重
悬细胞，涂布于 SD/-Leu/-Trp 培养基上，30℃培养
3-5 d 至菌落形成。
1.2.6 酵母双杂交分析 从上述的 SD/-Leu/-Trp 培
养基上挑取阳性克隆，涂于 SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp
培养基上，30℃培养 3-5 d，观察菌落形成情况 ；
再 将 其 上 长 出 的 菌 落 转 涂 于 SD/-Ade/-His/-Leu/-
Trp/X-α-Gal 培养基上，30℃培养 3-5 d，观察菌落
颜色变化情况。
2 结果
2.1 相关载体的构建与鉴定
IQM1 基 因 由 AT4G33050 编 码， 本 试 验 所 用
的 CDS 为 AT4G33050.3， 全 长 1 467 bp， 其 中 IQ
基序位于第二个外显子末端（图 1）。尽管已通过
Invitrogen 的酵母双杂交系统证实，IQM1 能与 CaM
结合［20］，但因本研究采用 Clontech 的酵母双杂交
系统，所以必须在 IQM1 的 CDS 的上下游分别加
入合适的酶切位点。用分别添加 Sma I 和 Cla I 酶
切 位 点 的 引 物 F1+R1， 对 pUC19-P35S ：eGFP ：
IQM1 进 行 PCR 扩 增， 以 克 隆 IQM1 CDS， 并 将 其
构建到 pMD18-T，经过鉴定，IQM1 CDS 未发生突
变（图 2-A）。然后根据 QuikChange® XL Site-Directed
Mutagenesis Kit（Stratagene）的说明，将 IQ 基序中
的关键氨基酸残基进行突变，构建到 pMD18-T 中，
测序结果显示，点突变的 IQM1 的第 338 位碱基 T
突 变 成 C， 即 第 113 位 L（TTA） 突 变 为 S（TCA）
（ 图 2-B）；缺 失 突 变 的 IQM1 的 第 337-342 位 碱
基（TTACAA）缺失，即第 113、114 位氨基酸（L、
Q）缺失（图 2-C）。其它部分均不存在突变。最后
把 构 建 的 pMD18-IQM1CDS、pMD18-IQM1Del113-114 和
pMD18-IQM1L113S 通过 Sma I 和 Cla I 特异位点定向克
隆到 pGADT7，构建成 pGADT7-IQM1CDS、pGADT7-
IQM1Del113-114 和 pGADT7-IQM1L113S，并经 Sma I 和 Cla
I 双酶切鉴定。同时，先将 PCR 扩增的 CaM5 CDS
克隆到 pMD18-T，测序证实后再通过 EcoR I 和 Sal I
定向插入 pGBKT7，得到 pGBKT7-CaM5，并经 EcoR
I 和 Sal I 双酶切鉴定。
200 bp R2 exon intron IQ Motif
R1
TAA
F3
F2
F1
ATG
R3
5 -˃UTR5 /˃3 -˃UTR
箭头所指为引物方向
图 1 IQM1 基因的结构及扩增引物示意图
A
B
C
C C C C C C C
CCC CCC
C C C C C CAAAAAAAAAA
A A A A A A A A A A A
A A AAAAAAAAAT T T T T T
TTTTT
T T T T T TGGGGGGG
G G G G G G
G
wild type
mutation
deletion
YSKYVKTTA
T T S Q K V Y K
KYVKQLTT
112 113 114 115
A
A
GGGGG
112 113 114 115
112 115
图 2 IQ 基序中关键氨基酸残基点突变或缺失
2014年第12期 131黄章科等：IQ基序突变对AtIQM1的钙调素结合活性的影响
2.2 关键氨基酸突变对相互作用的影响分析
分别用图 3 所示的 1-9 号质粒组合共转化酵母
AH109，涂布于培养基 SD/-Trp/-Lue，30℃培养 4 d，
长出菌落（图 3-A），说明质粒共转化成功。将所得
转化子分别转涂于 SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade 培养基
培养，只有 1 号（阳性对照）和 2 号（IQM1×CaM5）
组合的转化子长出菌落，其他组合的转化子均没有
生长（图 3-B）；进而将 1 号、2 号菌落转移到 SD/-
Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-Gal 培养基培养，二者均能
生长且显蓝色（图 3-C）。以上结果说明，IQM1 和
CaM5 能在酵母细胞内结合，使转录因子 GAL4 的功
能恢复，激活报告基因表达 ；而 3 号、4 号组合的
转化子不能在 SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade 培养基上生
长，说明 IQ 基序中 LQ 缺失或 L 突变成 S 后的突变
蛋白 iqm1 不能与 CaM5 结合，从而证实了 IQ 基序
的 LQ 或 L 是 IQM1 与 CaM5 结合的关键氨基酸残基，
且 L 更为重要。
Invitrogen［20］和 Clontech 的酵母双杂交系统所证实。
并通过蛋白截短试验证明 IQ 基序是其 CaM 结合所
必需的结构域［20］；通过基因体外定点突变技术将
其中的 LQ 缺失或 L 突变为 S 后所获得的突变蛋白
iqm1 都不能与 CaM 结合。这说明 IQ 基序是 IQM1
和 CaM 结合的关键结构域，其中的 LQ 尤其是 L 是
决定结合活性的关键氨基酸残基。本研究结果为构
建 IQ 基序中关键氨基酸残基点突变或缺失的突变互
补载体，转入 iqm1 突变体，观察突变体表型恢复情
况，以确证 IQM1 介导的 CaM 信号是否参与有关的
生理或生长发育调控提供了支撑。相关思路可资其
它 CaMBP 的功能研究者借鉴。
4 结论
利用酵母双杂交系统分析了 IQ 基序中 LQ 缺失
和 L 突变成 S 对于 IQM1 与 CaM5 结合活性的影响，
试验结果说明了无论是 LQ 缺失或 L 突变成 S 后，
突变蛋白 IQM1 都不能与 CaM5 相互结合，从而确定
了 IQ 基序的 LQ 或 L 是 IQM1 与 CaM5 结合的关键
氨基酸残基。
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1
A
B
C
2 3 4 5 6 7 8 9
1 ：pGADT7-T + pGBKT7-53 ；2 ：pGADT7-IQM1CDS + pGBKT7-CaM5 ；
3 ：pGADT7-IQM1Del113-114 + pGBKT7-CaM5 ；4 ：pGADT7-IQM1L113S + pGBKT7-
CaM5 ；5 ：pGADT7-IQM1CDS + pGBKT7 ；6 ：pGADT7-IQM1Del113-114 + pGBKT7 ；
7 ：pGADT7-IQM1L113S + pGBKT7 ；8 ：pGADT7 + pGBKT7-CaM5 ；9 ：pGADT7
+ pGBKT7。A ：SD/-Trp/-Lue ；B ：SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade ；C ：SD/-Trp/-
Leu/-His/-Ade /X-α-Gal
图 3 酵母双杂交分析
3 讨论
CaM 作 为 细 胞 的 Ca2+ 受 体， 在 Ca2+/CaM 信 号
转导中需通过其靶标——CaMBP 发挥作用。当前，
研究蛋白质之间相互作用的技术方法主要有酵母双
杂交、免疫共沉淀、pull-down、双分子荧光互补以
及串联亲和纯化等方法［21］。Fields 和 Song［22］首先
发明酵母双杂交技术，由最初研究蛋白间的相互
作用扩展到研究蛋白和 DNA、RNA 及其他小分子
配体间的相互作用，现已衍生出许多试验系统［23］。
IQM1 与 CaM 的结合活性已被本研究组先后利用
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第12期132
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（责任编辑 马鑫）