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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(2):129-134
机体内氧气含量较低是绝大多数疾病尤其是脑
疾病最主要的诱发因子之一 ；高原脑水肿是高原反
应中最常见、最重要的临床症状之一。水通道蛋白
4（Aquaporin，AQP4）是脑中表达最多、最重要的
水通道蛋白，其不仅参与正常脑细胞间隙体积变化、
神经细胞迁移、脑脊液循环、细胞代谢产物清除等
生理过程，而且在脑水肿的发生与清除中发挥着重
要的作用［1-5］。1994 年，Hasegawa 等［6］首次从大鼠
肺中克隆出一种特异性的对汞不敏感的水通道蛋白
（Mercury insensitive water channel，MIWC）， 并 将 其
命名为 AQP4（aquaporin-4）；同年，又从大鼠脑中
分离出 AQP4 的 cDNA ［7］。大量研究表明，AQP4 在
收稿日期 ： 2014-07-03
基金项目 ：国家自然科学基金青年科学基金项目（31000190），兰州大学中央高校基本科研业务费专项
作者简介 ：刘健锋，男，硕士研究生，研究方向 ：分子生物学 ；E-mail ：andyandhope@gmail.com
通讯作者 ：邵宝平，男，博士，副教授，硕士生导师 ；研究方向 ：高原动物适应性机理 ；E-mail ：shaobp@lzu.edu.cn
牦牛 AQP4 基因 CDS 序列的克隆及其生物信息学
特征分析
刘健锋1  丁艳平2  侯博儒3  王建林1  邵宝平1
（1. 兰州大学生命科学学院 动物学与发育生物学研究所，兰州 730000 ；2. 西北师范大学生命科学学院，兰州 730070 ；
3. 兰州大学第二临床医学院，兰州 730030）
摘 要 ： 为了研究高原动物对青藏高原高寒、低氧等极端生境的适应机理，进一步探讨高原动物对高原反应——高原脑水
肿抗性的分子机理，运用基因克隆与生物信息学相关技术和方法，对牦牛脑 AQP4（水通道蛋白 4，AQP4）基因 CDS 全长序列进
行克隆、基因序列比对及其生物信息学特征分析。结果表明，牦牛 AQP4 的 CDS 含有一个 966 bp 的开放阅读框，编码 322 个氨基酸；
牦牛 AQP4 基因编码蛋白分子量 34.69 kD，理论等电点（pI）7.59，其编码蛋白含有 6 次跨膜结构，属于疏水性蛋白 ；二级结构主
要由 α-螺旋、延伸及无规则卷曲构成 ；AQP4 基因编码产物氨基酸同源性及系统进化分析发现，牦牛 AQP4 基因编码氨基酸序列与
黄牛、绵羊等物种间同源性较高，系统进化情况与其亲缘关系远近一致。
关键词 ： 牦牛 ；AQP4 ；基因 ；CDS 区 ；分子克隆 ；生物信息学
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.02.019
Cloning and Bioinformatics Analysis of the CDS of Yak AQP4 Gene
Liu Jianfeng1 Ding Yanping2 Hou Boru3 Wang Jianlin1 Shao Baoping1
（1. School of Life Science，Lanzhou University，Lanzhou 730000 ；2. College of Life Sciences of Northwest Normal University，
Lanzhou 730070 ；3. The Second Clinical Medical College of Lanzhou University，Lanzhou 730030）
Abstract ： A coding region sequence of yak AQP4 was cloned by molecular cloning technique. Some characters of the AQP4 gene and
encoded protein sequences were predicted and analyzed by the methods of bioinformatics in the following aspects as the general physical and
chemical properties, hydrophobicity, transmembrane structure and secondary structure. Results showed that the full-length of yak AQP4 contains
a complete ORF（966 bp） encoding 322 amino acid. The putative molecular weight and theory isoelectric point of AQP4 gene in yak were 34.69
kD and 7.59, respectively. The protein encoded by yak AQP4 contains six transmembrane α-helices, and it is a hydrophobic protein. The second
structures are mainly composed of α-helix, extended strand and random coil. Deduced amino acid sequences of AQP4 gene between yak and Bos
Taurus, Ovis aries, Susscrofa and other species were high on homology and the phylogenetic distance consistent with their genetic relationship.
Key words ： yak ；Aquaporin 4（AQP4）；gene ；CDS region ；molecular cloning ；bioinformatics
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.2130
绝大多数脑疾病尤其是脑水肿的发生、发展及其消
除过程中发挥着非常重要的作用。
牦牛是世界最具显著特征的物种之一，是遍布
青藏高原最大的哺乳动物，其对高寒、低氧极端生
境的适应早已引起国内外广大学者的关注［8，9］。但是，
到目前为止，在国内外还尚未见到有关牦牛脑 AQP4
基因 CDS 全长序列及其相关生物信息学特征的研究
报道。为了明晰高原动物对青藏高原高寒、低氧等
极端环境的适应机理，进一步探讨高原动物对高原
反应——高原脑水肿抗性的分子机理，而为人类脑
疾病的研究提供基础资料，本研究运用基因克隆与
生物信息学分析等技术和方法，对牦牛脑 AQP4 基
因 CDS 全长序列进行了克隆、基因序列比对及生物
信息学特征分析。
1 材料与方法
1.1 材料
试验动物为甘肃省甘南州玛曲县屠宰场的健康
成年（3-4 岁）牦牛，屠宰后立即取其头部，沿矢
状面开颅取脑，用无菌生理盐水将组织样迅速冲洗
干净后剪成 1 cm×1 cm×0.5 cm 小块后迅速放入液
氮中，带回实验室后转移至 -80℃冰箱保存。
Trizol 试 剂、TaKaRa 反 转 录 试 剂 盒、TaKaRa
PrimeSTAR HS DNA 聚 合 酶、DL2000 DNA marker、
DNA 凝 胶 回 收 试 剂 盒、 限 制 性 内 切 酶 Hind Ⅲ、
Sma Ⅰ及质粒提取试剂盒购自宝生物工程（大连）
有限公司；DNase I 和 DEPC 购自 Sigma 公司（美国），
IPTG 及 X-Gal 购自 Promega 公司（美国），pMD19-T
克隆载体和 E.coli DH5ɑ 感受态细胞购自北京全式
金生物技术有限公司。
1.2 方法
1.2.1 牦牛大脑皮质总 RNA 的提取 称取 100 mg
牦牛大脑皮质后加入液氮研磨，将研好的组织转移
至事先加入 Trizol 裂解液的离心管中，离心 10 min ；
加入氯仿抽提 5 min 后离心 ；加入氯丙醇沉淀 15
min 后离心 ；再分别用无水乙醇和 75% 酒精洗涤后
离心 ；DNase I 去除基因组中残留的 DNA，1.5% 琼
脂糖凝胶电泳及紫外分光光度计检测总 RNA 的质
量，-70℃保存备用。
1.2.2 引物设计与合成 参考 GenBank 中黄牛 AQP4
基因 cDNA 序列（GeneID ：516762）设计特异性引
物 P1 和 P2， 即 P1 ：5-CCCAAGCTTATGAGTGACA
GACCCGCAG-3 ；P2 ：5-TCCCCCGGGTCATACTGAA
GACAACAC-3，横线部分分别为 Hind Ⅲ，Sma Ⅰ内
切酶酶切位点序列。扩增引物由宝生物工程（大连）
有限公司合成。
1.2.3 RT-PCR 扩增 以牦牛大脑皮质总 RNA 为模
板进行逆转录反应，总反应体系 10 μL ：5×PrimeSc-
ript Buffer 2 μL，RNase free dH2O 7 μL，500 ng/ μL 总
RNA 1 μL，混匀后，37℃ 15 min，85℃ 5 s 条件下进
行逆转录反应，将产物 4℃保存。以逆转录产物为
模版，P1、P2 为引物，扩增 AQP4 基因。PCR 反应
体系 25 μL ：5×Prime Star Buffer 5 μL，dNTP Mixture
2 μL，上下游引物各 0.5 μL，TaKaRa PrimeSTAR HS
0.25 μL，cDNA 模 板 1 μL，RNase-Free dH2O 15.75
μL。PCR 反应条件 ：98℃预变性 2 min ；98℃变性
30 s，60℃ 退 火 30 s，72℃ 延 伸 1 min， 共 30 个 循
环 ；72℃延伸 5 min，4℃保存。用 1% 的琼脂糖凝
胶电泳检测 PCR 产物后，用 DNA 片段回收试剂盒
对 PCR 产物回收。
1.2.4 AQP4 基因的克隆 回收的 PCR 产物在 T4 连
接酶的作用下与 pMD19-T 克隆载体进行连接过夜
（12-16 h）。将连接产物转化至感受态 E.coli DH2α
中，37℃，100 r/min 培养 1 h，涂于含有 Amp、X-gal、
IPTG 的 LB 固 体 培 养 基 上，37℃ 培 养 12 h。 挑 取
阳性单克隆接种于含有 Amp 的 LB 液体培养基中，
37℃，180 r/min 过夜培养。用“质粒提取试剂盒”
提取质粒后进行用 Hind Ⅲ，Sma Ⅰ内切酶进行双酶
切鉴定。鉴定成功后将质粒送往上海生工公司进行
测序。
1.2.5 生 物 信 息 学 分 析 AQP4 基 因 开 放 阅 读 框
（ORF） 采 用 NCBI 的 ORF Finder 程 序 分 析， 序 列
比对及同源性分析使用 DNAMAN 软件及在线 NCBI
网站（http ：//www.ncbi.nlm.nih.gov）；蛋白质特性预
测 使 用 Bioedit 及 Lasergene7.1 软 件 包 中 的 Protean
软件 ；亲水性疏水性预测采用 Epasy 服务器上的
protscale 程序（http ：//web.expasy.org/protscale/）；蛋
白质二级结构预测采用法国里昂 CNRS 的 SOPMA 软
件（http ：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?
page=npsa_sopma.html）， 并 利 用 SWISS-MODEL 软
2015,31(2) 131刘健锋等 ：牦牛 AQP4 基因 CDS 序列的克隆及其生物信息学特征分析
件（http ：//swiss-model.expasy.org/）进行三级结构预
测 ；使用 MEGA 4.0 软件构建系统进化树，置信度
用 Boot-strap 检验（重复次数为 1 000）。
2 结果
2.1 牦牛AQP4基因的PCR扩增
牦牛大脑皮层总 RNA 用 1.5% 琼脂糖凝胶电泳
检 测 到 28S、18S 和 5S 3 条 带（ 图 1），OD260/OD280
平均为 1.95，表明 RNA 完整性较好，没有蛋白质
或 DNA 污染且纯度和浓度适合 RT-PCR。牦牛 RT-
PCR 扩增产物通过 1% 琼脂糖凝胶电泳检测（图 2），
DNA 片段在 1 000 bp 左右，可能还含有编码区两侧
序列，与预期 DNA 片段（966 bp）大小基本一致，
条带清晰且特异性良好，可以进行切胶回收进一步
做克隆。
CBI 上进行同源性搜索，所得到的目的基因为含牦
牛 AQP4 编码区的序列。应用 NCBI 的 ORF Finder
程序对牦牛 AQP4 基因序列开放阅读框分析，得知
AQP4 基因含有一个长度为 966 bp 的开放阅读框，
编码 322 个氨基酸，起始密码子为 ATG，终止密码
子为 TGA（图 4）。
图 1 牦牛皮质总 RNA 的提取
图 4 牦牛 AQP4 基因和编码蛋白的序列
2.2 牦牛AQP4基因克隆及重组子的鉴定
提 取 菌 液 的 质 粒 并 用 Hind Ⅲ，Sma Ⅰ 内 切
酶双酶切鉴定重组质粒，得到一条约 3 000 bp 的
pMD19-T 线性片段和约 1 000 bp 的插入片段（图 3），
与预期的结果完全相同。
2.3 牦牛AQP4基因的序列测定及分析
将双酶切鉴定正确的阳性重组质粒送往上海
生工公司测序。测序结果表明，克隆得到的序列在
2000
bp
M 1
1000
750
500
200
100
M: DNA 分子质量标准 ；1: PCR 扩增产物
图 2 AQP4 基因 PCR 扩增产物的电泳图谱
M: DNA 分子质量标准 ；1: 重组质粒的双酶切片段
图 3 重组质粒的双酶切鉴定
1
1
61
21
121
41
181
61
241
81
301
101
361
121
421
141
481
161
541
181
601
201
661
221
721
241
781
261
841
281
901
301
961
320
2.4 牦牛AQP4蛋白的生物信息学分析
2.4.1 牦牛 AQP4 蛋白的理化性质 利用 Protparam
工具预测牦牛 AQP4 基因编码蛋白质的基本理化性
质，发现该蛋白分子量约为 34.69 kD，理论等电点
为 7.59。含有 20 种基本氨基酸，其中含量最高的是
Gly（10.5%），含量最低的分别是 Gln（2.2% ）、Trp
（2.2% ）和 Cys（2.2%）；含有带负电荷的残基 18 个，
带正电荷的残基 33 个，其 280 nm 的摩尔消光系数
200
bp
M 1
100
75
50
20
10
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.2132
为 49 430 mol/cm，该蛋白的平均亲水系数为 0.433。
此 外， 牦 牛 AQP4 基 因 编 码 蛋 白 中 含 有 8 个 Cys
（图 4）。
2.4.2 牦 牛 AQP4 蛋 白 的 亲 水 性 / 疏 水 性 运 用
ProtScale 工具对牦牛 AQP4 进行亲水性和疏水性分
析。依据氨基酸分值越低亲水性越强和分值越高疏
水性越强的规律可知，牦牛 AQP4 基因编码蛋白多
肽链第 136 位 Ala 具有最低的分值 -3.156 和最强的
亲水性 ；第 14 位 Leu 具有最高的分值 1.978 和最强
的疏水性。多肽链整体表现为疏水性（图 5），此结
果与 DNAMAN 软件分析结果基本一致。
4
3
2
1
0
Sc
or
e
-1
-2
-3
-4
50 100 150 200 250
Position
图 5 牦牛 AQP4 蛋白疏水性分析
位氨基酸为胞内部分，38-60 氨基酸为第 1 个跨膜
螺旋，61-69 氨基酸在胞外，70-92 氨基酸为第 2 个
跨膜螺旋，93-111 为胞内部分，112-134 为第 3 个
跨膜螺旋，135-153 为胞外部分，154-176 为第 4 个
跨膜螺旋，177-188 为胞内部分，189-211 为第 5 个
跨膜螺旋，212-230 为胞外部分，231-253 为第 6 个
跨膜螺旋，254-332 为胞内部分。
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
pr
ob
ab
ili
ty
0
50
transmembrane inside outside
100 200 300250150
图 6 牦牛 AQP4 蛋白跨膜区域分析
50 100 200 250150
2.4.4 牦 牛 AQP4 蛋 白 的 高 级 结 构 预 测 采 用
SWISS-MODEL 对牦牛 AQP4 蛋白同源建模获得三级
结构模型，该结果表明牦牛 AQP4 蛋白主要由 α-螺
旋、延伸和无规则卷曲构成，这与二级结构预测结
果（图 7，图 8）一致。此外还发现牦牛 AQP4 由相
同的 4 个亚基组成的同源四聚体，每个亚基均由完
全相同的 322 个氨基酸组成。
长竖线区（h）：α 螺旋 ；中竖线区（e）：延伸链 ；次中竖线区（t）：β 转角 ；短线区（e）：无规则卷曲
图 7 牦牛 AQP4 蛋白的二级结构预测
2.4.5 牦牛 AQP4 蛋白同源性及系统发育分析 通
过 NCBI 数据库中收集下载 6 个物种 AQP4 蛋白的
序列，采用 MegAlign 软件进行同源性分析，发现牦
牛 AQP4 蛋白与其它物种 AQP4 蛋白具有较高的同
源性，均在 90% 以上，牦牛与黄牛 AQP4 氨基酸序
列间同源性最高（表 1），为 98.8%。与绵羊、野猪、
人、 狼 犬、 小 家 鼠 分 别 为 97.9%、96.1%、94.6%、
92.5%、92.0%。用 NJ 法构建了 7 个物种的 AQP4 基
因系统发育树（图 9）。结果表明，牦牛与黄牛、绵
羊在系统发育树中距离最近，这与动物学分类结果
蓝色 ：α-螺旋 ；红色 ：延伸链 ；绿色 ：β-转角 ；橙色 ：无规则
卷曲（颜色标识见电子版）
图 8 牦牛 AQP4 蛋白三级结构预测
2.4.3 牦牛 AQP4 蛋白的跨膜区分析 如图 6 所示，
牦牛的 AQP4 为 6 个跨膜螺旋结构蛋白。其中，1-37
2015,31(2) 133刘健锋等 ：牦牛 AQP4 基因 CDS 序列的克隆及其生物信息学特征分析
基本一致。
3 讨论
近年的研究表明，脑水肿是缺血缺氧性损伤最
常见的病理现象。了解水分子在细胞内外或跨血脑
屏障运输的机制对于研究脑水肿具有重要意义。水
通道蛋白被认为是对脑中水运动提供关键路径的主
要水通道［10-13］，其中 AQP4 是在水通道蛋白家族中
在脑中表达最为丰富的一个亚型，也被认为是产生
Bos grunniens
Bos taurus
Ovis aries
Sus scrofa
Canis lupus
Mus musculus
Homo sapiens
65
98
0.0000.0050.0100.0150.020
图 9 NJ 法构建的 AQP4 基因系统发生树
表 1 牦牛与 6 个物种 AQP4 蛋白氨基酸序列同源性（%）比较
物种 牦牛 黄牛 绵羊 野猪 人 狼犬 小家鼠
牦牛（Bos grunniens） 100
黄牛（Bos taurus） 98.8 100
绵羊（Ovis aries） 97.9 98.5 100
野猪（Sus scrofa） 96.1 96.3 95.7 100
人（Homo sapiens） 94.6 94.2 93.9 93.5 100
狼犬（Canis lupus） 92.5 93.9 92.8 94.4 91.6 100
小家鼠（Mus musculus） 92.0 91.8 91.0 92.6 91.3 89.1 100
细胞水肿的“最后共同通道”。根据 AQP4 敲除鼠试
验病理模型研究表明 AQP4 在脑水肿的形成与去除
的作用是双方面的［14］。在低氧处理大鼠星形胶质细
胞模拟低氧脑缺血的模型中，相比于 AQP4 敲除型
星形胶质细胞，野生型细胞会更快速的肿胀，肿胀
后细胞体积比 AQP4 敲除细胞更大，提示 AQP4 在
促进水分进入星形胶质细胞中起着重要作用［15］。另
外，复氧后发现野生型星形胶质细胞的肿胀程度仍
然是 AQP4 敲除型的 1.3 倍，表明 AQP4 可以加速低
氧处理后星形胶质细胞水肿的清除［15］。
本研究克隆得到的牦牛 AQP4 基因编码区序列
具有特异的起始密码子（ATG）和终止密码子（TGA），
是牦牛 AQP4 基因编码区全长序列，编码 AQP4 蛋
白。牦牛 AQP4 基因含有一个长度为 966 bp 的开放
阅读框，编码 322 个氨基酸，整条多肽链表现为疏
水性。由此推测，牦牛的该区域适益于水分子包裹
的环境中。通过对牦牛 AQP4 基因编码氨基酸序列
跨膜结构进行分析表明，牦牛 AQP4 蛋白为 6 次跨
膜螺旋结构蛋白，且这些跨膜区富含 α-螺旋，缺少
β-折叠结构，这与水通道蛋白家族其它成员结构相
似［16］。该蛋白具有水通道蛋白家族保守的序列特征，
其二级结构主要由 α-螺旋、延伸和无规则卷曲构成，
这与其它 AQPs 结构相似［16］。此外，我们还发现牦
牛 AQP4 基因编码氨基酸序列中含有两个天冬酰胺 -
脯 氨 酸 - 丙 氨 酸（Asn-Pro-Ala，NPA） 结 构，NPA
为 AQP 家族共有的特征结构。这与 Preston 等［16］发
现的结果相一致，且这两个 NPA 序列在空间上围
绕通道中轴呈点对称分布。该蛋白序列中存在 8 个
Cys。根据徐国恒等［17］研究结果推测 Cys 残基的巯
基基团发生氧化可形成二硫键，而疏水性氨基酸残
基围绕着二硫键可形成局部疏水中心从而阻止水分
子进行肽的内部破坏氢键，该结构特征对于维持其
结构稳定及功能行使具有重要意义。同源建模结果
表明牦牛 AQP4 蛋白高级结构是由相同的 4 个亚基
组成的同源四聚体，这与鼠中 AQP4 蛋白高级结构
类似［18］。每个四聚体都含有 4 个向外伸长围绕中心
孔隙排列的结构域，分别代表 4 个水孔，具有独立
的水通透活性。该四聚体在膜上的组装是维持 AQP
稳定性及正常功能所必需的。此外，序列同源性在
一定程度上反映物种间亲缘关系的远近。通过序列
比对和系统进化分析发现，牦牛 AQP4 蛋白与其它
物种 AQP4 蛋白具有较高的同源性，这与物种进化
的结果相一致，表明 AQP4 基因可能是由同一个祖
先基因进化而来，同时也反映了 AQP4 蛋白在不同
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.2134
物种结构上的稳定性对生物体的功能重要性。我们
还发现牦牛和黄牛 AQP4 基因编码氨基酸序列间同
源性最高，说明牦牛 AQP4 基因与黄牛该基因功能
也极为相似，同时也提示了牦牛在适应高原低氧极
端环境的过程中，AQP4 基因在牦牛和黄牛体内的表
达量可能存在着一定差异。
4 结论
本研究利用分子克隆手段获得牦牛 AQP4 基因
的编码区序列，并首次通过生物信息学相关技术和
方法发现该蛋白含有 6 次跨膜结构，属于疏水性蛋
白 ；二级结构由 α-螺旋、延伸、β-折叠及无规则卷
曲构成 ；牦牛 AQP4 蛋白与黄牛、绵羊等物种间同
源性较高。
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）