全 文 ：·技术与方法·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第2期
苦瓜（Momordica charantia L.，2n = 2x = 22）为
葫芦科（Cucurbitaceae）苦瓜属（Momordica L.）一
年生草本植物，因果实具有特殊的苦味，故名苦瓜。
苦瓜营养价值很高，富含维生素 C、维生素 E、氨
基酸及矿物质。此外，苦瓜所含的药理活性成分具
有降血糖［1］、抗肿瘤［2］和降低胆固醇［3］等功效。
海南省属于华南地区北运瓜菜产业带，对保障全国
菜篮子工程建设具有不可替代性。苦瓜是海南主要
冬种瓜菜种类之一，栽培面积逐年扩大。
作物杂交种纯度显著影响作物的产量和品质。
开展种子纯度检测对保证种子质量和发挥优良品种
的增产潜力具有重要意义。传统田间形态鉴定所需
时间较长，易受环境条件影响，不能完全满足杂交
种生产经营的需要［4］。DNA 分子标记技术的发展为
收稿日期 ：2013-09-06
基金项目 ： 海南省自然科学基金项目（312025），
中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金资助项目（1630032012007，1630032012002）
作者简介 ：刘子记，男，博士，助理研究员，研究方向 ：蔬菜分子生物学及遗传育种 ；E-mail ：liuziji1982@gmail.com
通讯作者 ：杨衍，男，博士，副研究员，研究方向 ：瓜菜遗传育种 ；E-mail ：catasvegetable@gmail.com
利用 SSR 标记鉴定热研二号油绿苦瓜杂交种纯度
刘子记  詹园凤  杨衍
（中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所 农业部华南作物基因资源与种质创制重点开放实验室，儋州 571737）
摘 要 ： 利用 SSR 分子标记技术对热研二号油绿苦瓜进行杂交种纯度检测技术研究。研究结果表明，5 对 SSR 标记在热研
二号亲本间表现明显的多态性，其中 4 对为共显性标记，1 对为显性标记。为确保鉴定结果的准确性和可靠性，利用 4 对共显性
的 SSR 标记对热研二号进行纯度鉴定，杂交种纯度为 98.82%，与田间形态学鉴定结果完全一致。该研究表明利用 SSR 标记对热研
二号油绿苦瓜进行纯度鉴定是切实可行的。
关键词 ： 苦瓜 SSR 热研二号 纯度鉴定
Hybrid Purity Identification of Reyan No. 2 Using SSR Markers
Liu Ziji Zhan Yuanfeng Yang Yan
（Tropical Crops Genetic Resources Institute，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Key Laboratory of Crop Gene Resources and
Germplasm Enhancement in Southern China，Ministry of Agriculture，Danzhou 571737）
Abstract:  The purity identification of Reyan No.2 was performed by using SSR marker technique. The results showed that 5 SSR markers
were polymorphic between the parents of Reyan No.2, among which 4 were co-dominant markers, one was dominant marker. To ensure the
accuracy and reliability, 4 co-dominant SSR markers were used for purity identification of Reyan No.2. The hybrid purity was 98.82%, which was
completely consistent with field identification. It is feasible to conduct purity identification of Reyan No.2 using SSR markers.
Key words:  Bitter gourd SSR Reyan No.2 Purity identification
作物品种鉴定与纯度分析提供了更为准确、可靠、
方便的方法。SSR 标记具有快速、准确、多态性丰富、
呈共显性遗传、操作简单、结果稳定可靠等特点［5］，
符合作物品种鉴别的 4 个基本准则 ：环境的稳定性、
品种间变异的可识别性、最小的品种内变异和实验
结果的可靠性。可以快速、准确、有效地检测生物
体中的遗传变异，被广泛用于黄瓜［6，7］、甜瓜［8］、
西瓜［9］等瓜类作物品种纯度检验。与黄瓜、西瓜和
甜瓜相比，苦瓜基因组研究进展比较缓慢，公开发
表的基因组序列资源和 SSR 标记数目非常有限，目
前国内外尚无利用 SSR 标记鉴定苦瓜杂交种纯度的
研究报道。本研究拟以热研二号油绿苦瓜杂交种及
其亲本为材料，旨在利用 SSR 标记建立苦瓜杂交种
纯度鉴定技术体系。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第2期76
1 材料与方法
1.1 材料
热研二号属油绿型杂交苦瓜品种，由中国热带
农业科学院热带作物品种资源研究所选育而成，适
合在华南地区的海南、广东、广西苦瓜主产区推广
种植。母本材料 02-20-4-9 由来自日本冲绳省的一个
栽培品种经过连续 8 代自交选育出的强雌性系，表
现丰产、中熟、强雌性、高抗白粉病。父本 MC009
是来自云南玉溪的一个优良自交系，该自交系抗病
性强，早熟。将热研二号、母本及父本材料播种于
营养钵中，待植株长至 5-6 片真叶时利用改良的
CTAB 法［10］ 提取 02-20-4-9、MC009 和热研二号单
株叶片的基因组 DNA，贮于-20℃冰箱备用。
1.2 方法
1.2.1 多态性标记筛选 利用已开发的苦瓜 SSR 标
记［11，12］，以母本材料 02-20-4-9 和父本材料 MC009
基因组 DNA 为模板进行扩增，筛选多态性的 SSR 标
记。
PCR 反 应 体 系 为 10 μL， 其 中 包 括 10 mmol/L
Tris-HCl（pH8.0），50 mmol/L KCl，1.5 mmol/L
MgCl2，0.15 mmol/ L dNTPs，50 ng 引 物，0.6 U Taq
DNA 聚 合 酶 和 60-100 ng 模 板 DNA。 扩 增 程 序 为
94℃预变性 3 min ；94℃变性 40 s，50-60℃（根据
具体引物的退火温度而定）退火 40 s，72℃延伸 1.5
min，35 个 循 环 ；72 ℃ 终 延 伸 6 min。PCR 产 物 保
存于 4℃。4 μL 扩增产物与 2 μL 上样缓冲液混合经
12% 非变性聚丙烯酰胺（丙烯酰胺∶甲叉双丙烯酰
胺 =39∶1）凝胶电泳，银染显色进行带型统计。
1.2.2 热研二号杂交种纯度鉴定 利用在亲本材料
间表现多态性的 SSR 标记，以热研二号油绿苦瓜单
株 DNA 为模板进行扩增，根据特异谱带的扩增结果
检测杂交种的纯度。将取材后的苦瓜幼苗按照顺序
移栽到中国热带农业科学院热带作物品种资源研究
所蔬菜试验基地，在结果期依据品种的果皮颜色及
果实特征特性逐株进行鉴定，将 SSR 标记鉴定结果
与田间形态鉴定结果进行比较分析。
2 结果
2.1 材料DNA提取
在研磨苦瓜叶片时添加少量 PVP 能有效去除
糖类物质，利用 0.8% 的琼脂糖凝胶电泳检测提取
的 DNA 纯度和浓度，样品检测结果（图 1）表明，
DNA 呈现一条清晰整齐的主带，无明显降解现象，
符合 SSR 标记分析对 DNA 模板质量的要求。
1 kb
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
700 bp
M ：DL1000 DNA Marker ；1-19 ：苦瓜材料基因组 DNA
图 1 部分苦瓜材料基因组 DNA 的检测结果
2.2 多态性标记筛选
以母本材料 02-20-4-9 和父本材料 MC009 为模
板筛选 26 对苦瓜 SSR 引物，其中 15 对引物能扩增
出清晰可辨的条带，扩增效率为 57.69%，5 对引物
在亲本间能扩增出明显的多态性（表 1，图 2），多
态 性 比 率 为 19.23%，BSSR3、BSSR7、BSSR9 和
BSSR14 为 共 显 性 标 记， 扩 增 出 的 特 异 谱 带 能 够
将杂交种与母本自交种、父本自交种区分开来 ；
BSSR16 为偏父本型的显性标记，杂交种扩增出的
谱带与父本材料一致 ；多态性片段大小 150-480 bp
（图 2）。
表 1 亲本材料间表现多态性的 SSR 标记
引物编号 正向引物序列 反向引物序列 多态性片段大小（bp）
BSSR3 GGGAATTCTCAAAGAGCCAGA TGGCACACTCTGCATGAAAT 150-160
BSSR7 TTCCCATTCACAGATCACTCC CCACCAAATTCAAGAACCCAC 340-480
BSSR9 TTGGTTGTGGTGCTGAGTTC GATGTAGGGGTTGGGTTGAT 270-280
BSSR14 GAACGCCCTGTGACTTTAGC TTTCGTCTTCCAATGAGCC 190-200
BSSR16 ATTTAGTGGGGCGGGTAGT TGGATGAGCATGTTAGGGATC 280
2014年第2期 77刘子记等 ：利用 SSR 标记鉴定热研二号油绿苦瓜杂交种纯度
2.3 利用SSR标记对热研二号杂交种纯度进行鉴
定
共显性标记可以有效区分杂交种、母本自交种
和父本自交种。本研究选用在亲本材料间表现共显
性的标记 BSSR3、BSSR7、BSSR9 和 BSSR14 对 170
株热研二号油绿苦瓜进行扩增，扩增结果（图 3）
表明，168 个热研二号单株具有双亲特异谱带，属
于真实的杂交种，15 号和 26 号单株缺少父本特异
带，与母本扩增图谱一致，说明 15 号和 26 号单株
为母本自交株，这可能由于雄花摘除不彻底导致母
本自交结实致使杂交种中混有少量母本自交种，4
对 SSR 标记的鉴定结果一致，热研二号杂交种纯度
为 98.82%。从分子标记鉴定结果来看，母本自交是
降低杂交种纯度的主要原因。母本材料 02-20-4-9 来
自日本冲绳省，表现强雌性，果实长圆锥形，浅绿色，
父本材料 MC009 来自云南玉溪，条瘤粗直均匀，深
绿色。
在田间鉴定中，通过观察果皮颜色和性别类型
鉴定热研二号纯度。15 号和 26 号单株果皮颜色为
浅绿色，表现为强雌性系，其余植株均具有热研二
号油绿苦瓜典型特征，植株生长旺盛，分枝性较强，
果实长圆锥形，皮色深绿有光泽，瓜形美观，田间
鉴定结果表明 15 号和 26 号单株属母本自交株，标
记鉴定结果与田间鉴定结果完全一致。该研究结果
表明 SSR 技术可用于热研二号油绿苦瓜杂交种纯度
快速检测。
3 讨论
作物杂交种纯度田间种植形态鉴定所需周期较
长，耗费大量人力、物力和财力，易受栽培措施及
环境因素影响，另外鉴定者的观察经验也制约着鉴
定的准确性。理想的鉴定技术不但要准确可靠，还
要简单、快速和经济，这是品种纯度鉴定技术的发
展趋势［13］。DNA 分子标记技术的出现，为作物品
种纯度鉴定提供了更为准确、可靠、方便的方法。
近年来，AFLP、RAPD 和 SSR 等分子标记技术被广
泛用于作物杂交种纯度鉴定。张菊平等［14］和林珲
等［15］利用 RAPD 分子标记分别对‘碧绿 3 号’和
‘闽研 2 号’苦瓜杂交种进行纯度鉴定，标记鉴定结
果与田间鉴定结果完全一致，但 RAPD 标记的稳定
性和重复性较差。SSR 标记技术不仅具有 RFLP 技
术的稳定性和共显性的优点，而且操作简单和重复
性较好，能够将真正的杂交种和自交株、混杂株区
分开，是进行作物杂交种纯度鉴定的首选标记类型，
已在多种农作物杂交种纯度鉴定中得到应用。高海
娜等［16］和苗明军等［17］成功利用 SSR 标记对甘蓝
杂交种‘秦甘 50’和‘西园 4 号’进行纯度鉴定。
SSR 分子标记鉴定与田间形态鉴定相比，准确性更
高，速度更快，能大大提高检测效率，具有相当高
的理论和应用价值。由于苦瓜基因组研究相对滞后，
基因组序列资源非常有限，目前国内外关于利用
500
bp
BSSR3
BSSR7
BSSR9
BSSR14
BSSR16
M 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2
400
300
200
M ：DL1000 DNA Marker ；1 ：MC009 ；2 ：02-20-4-9
图 2 多态性 SSR 标记的扩增结果
M
200
3a bp 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1213 1415*1617 181920 21 222324 25 26*
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1213 14 15*16171819 20 21 22 232425 26*
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 131415*16171819 20 21 22 232425 26*
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 131415*1617 1819 20 212223 2425 26*
500
3b bp
400
300
3c bp
200
3d bp
M ：DL1000 DNA Marker ；1 ：MC009 ；2 ：02-20-4-9 ；3~26 ：热研二号单株 ；
15* 和 26* ：母本自交株
图 3 SSR 标记 BSSR3（3a）、BSSR7（3b）、BSSR9（3c）
和 BSSR14（3d）在部分热研二号单株及亲本中的扩增结果
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第2期78
SSR 标记鉴定苦瓜杂交种纯度的研究报道甚少。本
研究以苦瓜杂种一代热研二号及其父、母本为材料，
建立了利用 SSR 分子标记技术进行苦瓜杂交种纯度
鉴定的技术体系。通过对两种纯度鉴定结果比较分
析发现，田间形态学鉴定与标记鉴定结果一致，热
研二号种子纯度为 98.82%。该结果说明本试验建立
的 SSR 技术体系可用于苦瓜杂交种纯度的快速检测。
单对标记不易区分因隔离不严产生的生物混杂，
因此利用单对标记鉴定杂交种纯度具有一定的局限
性。为确保鉴定结果的准确性和可靠性，本研究选
取 4 对共显性的 SSR 标记对热研二号的多个遗传位
点进行检测，4 对标记的检测结果一致，杂交种中
仅混杂了母本自交种，该研究结果表明母本自交是
降低热研二号油绿苦瓜杂交种纯度的主要原因。
4 结论
建立了快速、稳定的检测热研二号油绿苦瓜杂
交种纯度的 SSR 分子标记技术体系，分子标记鉴定
结果与田间形态学鉴定结果完全一致，为热研二号
油绿苦瓜良种的安全使用提供了科学依据。
参 考 文 献
［1］ Hazarika R, Parida P, Neog B, et al. Binding energy calculation of
GSK-3 protein of human against some anti-diabetic compounds of
Momordica charantia linn（bitter melon）［J］. Bioinformation,
2012, 8（6）：251-254.
［2］ Zhang J, Huang Y, Kikuchi T, et al. Cucurbitane triterpenoids from
the leaves of Momordica charantia, and their cancer chemopreventive
effects and cytotoxicities［J］. Chem Biodivers, 2012, 9（2）：428-
440.
［3］ Senanayake GVK, Fukuda N, Nshizono S, et al. Mechanisms
underlying decreased hepatic triacylglycerol and cholesterol by
dietary bitter melon extract in the rat［J］. Lipids, 2012, 47（5）：
495-503.
［4］ 卢锐 , 叶永亮 , 冯国军 . EST-SSR 标记在黄瓜 F1 种子纯度鉴定
中的应用［J］. 北方园艺 , 2010, （18）：136-138.
［5］ 盖树鹏 , 盖伟玲 , 王日新 . 6 个玉米杂交种种子纯度的 SSR 鉴
定［J］. 种子 , 2010, 29（7）：44-47.
［6］ 杨瑞环 , 崔兴华 , 李鹏宇 , 等 . SSR 技术检测‘津优 48’种子
纯度试验［J］. 北方园艺 , 2012（16）：108-109.
［7］ 张桂华 , 李家旺 , 张文珠 , 等 . 利用 SSR 技术对黄瓜新品种津优
35 号进行种子纯度鉴定［J］. 北方园艺 , 2010（10）：184-185.
［8］ 艾呈祥 , 陆璐 , 马国斌 , 等 . SSR 标记技术在甜瓜杂交种纯度检
验中的应用［J］. 园艺学报 , 2005, 32（5）：902-904.
［9］ 艾成祥 , 余贤美 , 刘庆忠 , 等 . 利用 SSR 标记鉴定西瓜杂交种
纯度的研究［J］. 西北植物学报 , 2006, 26（10）：2006-2010.
［10］ 刘子记 , 梁永 , 朱婕 , 等 . 小麦抗叶锈病基因 Lr9 的分子标记
及其检测［J］. 麦类作物学报 , 2013, 33（2）：236-242.
［11］ Wang SZ, Pan L, Hu K, et al. Development and characterization
of polymorphic microsatellite markers in Momordica charantia
（Cucurbitaceae）［J］. Am J Bot, 2010, 97（8）：75-78.
［12］ Guo DL, Zhang JP, Xue YM, et al. Isolation and characterization of
10 SSR markers of Momordica charantia（Cucurbitaceae）［J］.
Am J Bot, 2012, 99（5）：182-183.
［13］ 柳剑丽 , 周寿春 , 宋晓华 , 等 . 利用 SSR 标记鉴定甜瓜杂交种
的种子纯度［J］. 分子植物育种 , 2006, 4（6S）：23-26.
［14］ 张菊平 , 张兴志 , 张长远 . 碧绿 3 号苦瓜种子纯度的 RAPD 检
测研究［J］. 种子 , 2004, 23（1）：25-26.
［15］ 林珲 , 李永平 , 朱海生 , 等 . 应用 RAPD 标记鉴定苦瓜杂种纯
度［J］. 福建农业学报 , 2011, 26（6）：977-980.
［16］ 高海娜 , 张恩慧 , 李殿荣 , 等 . 甘蓝一代杂种纯度 SSR 鉴定与
田间鉴定的一致性研究［J］. 西北农林科技大学学报 , 2012,
40（5）：117-122.
［17］ 苗明军 , 李成琼 , 司军 , 等 . 结球甘蓝西园 4 号种子纯度的
SSR 鉴定［J］. 中国蔬菜 , 2011（2）：53-55.
（责任编辑 李楠）