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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第9期
枯草芽孢杆菌是革兰氏阳性细菌，细胞壁不含
内毒素，是一些重要工业酶制剂的生产菌。作为表
达系统，枯草芽孢杆菌因其不含内毒素、高效的分
泌能力、易于高密度发酵等优势被广泛研究。枯草
杆菌表达载体 pWB980 是 Wu 等［1］于 1999 年基于
pUB110 改造构建而得，该质粒具有 P43 强组成型启
动子和改造了的果聚糖蔗糖酶信号肽，在枯草杆菌
中复制赋予宿主卡那霉素抗性，该载体自构建后被
成功应用于多种功能基因的分泌表达［2-4］。pWB980
没有大肠杆菌复制子，因而外源基因克隆操作只能
在枯草杆菌中进行。而枯草杆菌的转化步骤繁琐，
且转化效率相对较低，构建大肠杆菌-枯草杆菌的穿
收稿日期 ：2013-03-22
基金项目 ：国家“973”计划项目（2010CB833804），国家“863”计划项目（2012AA092104），海洋公益性行业科研专项（201305018）
作者简介 ：杨键，男，博士研究生，研究方向 ：海洋微生物酶工程 ；E-mail ：yangjian@scsio.ac.cn
通讯作者 ：张偲，男，研究员，博士生导师，研究方向 ：海洋生物学 ；E-mail ：zhsmid@scsio.ac.cn
大肠杆菌-枯草杆菌穿梭载体的构建及其在蛋白酶基因
表达中的应用
杨键1，2  游志庆1，2  麦志茂1，2  李洁1  田新朋1  张偲1，2
（1. 中国科学院南海海洋研究所 中国科学院海洋生物资源可持续利用重点实验室，广州 510301 ；
2. 中国科学院研究生院，北京 100049）
摘 要： 利用基因重组技术，以枯草杆菌表达载体 pWB980 为骨架，插入大肠杆菌的克隆载体 pUC18 中的抗性基因和复制子，
构建穿梭质粒 pY980coli。将海洋细菌蛋白酶基因 hspa 插入 pY980coli 载体 P43 启动子下游，导入枯草杆菌 WB600 中，可实现活性表达。
关键词 ： 穿梭载体 P43 启动子 枯草芽孢杆菌表达系统 蛋白酶 分泌表达
Construction of a Versatile Escherichia coli-Bacillus subtilis Shuttle
Vector and Its Application in Protease Gene Expression
Yang Jian1，2 You Zhiqing 1，2 Mai Zhimao1，2 Li Jie1 Tian Xinpeng1 Zhang Si1，2
（1. Key Laboratory of Marine Bio-resources Sustainable Utilization，South China Sea Institute of Oceanology，Chinese Academy of Sciences，
Guangzhou 510301 ；2. Graduate University of the Chinese Academy of Sciences，Beijing 100049）
Abstract:  A versatile Escherichia coli-Bacillus subtilis shuttle vector pY980coli was constructed by genetic recombination. Resistance
gene and replicon of pUC18, a cloning vector for Escherichia coli, were integtated into the Bacillus subtilis expression plasmid pWB980. Protease
gene hspa from a marine bacterium was then inserted under P43 promoter of pY980coli, and the recombinant vector was transformed into Bacillus
subtilis WB600. Protease activity was detected in the fermentation broth.
Key words:  Shuttle vector P43 promoter Bacillus subtilis expression system Protease Secretory expression
梭载体会使其更易于操作。
蛋白酶 HSPA 是来自海洋细菌 Halobacillus sp.
SCSIO 20089 的 Thermolysin 家 族 的 金 属 蛋 白 酶，
HSPA 具有与所在家族其他成员相区别的适冷特
性［5］。本课题组前期成功获得编码该酶的全长基因
（GenBank 登录号 JX235368），并将其导入大肠杆菌
中表达，但无法获得有活性的蛋白。考虑到大肠杆
菌与 Halobacillus 属进化距离较远，可能无法提供
HSPA 蛋白加工成熟的内环境，因而本研究尝试将
该基因导入亲缘关系较近的枯草芽孢杆菌中，期望
能实现活性表达。
2013年第9期 147杨键等 ：大肠杆菌 - 枯草杆菌穿梭载体的构建及其在蛋白酶基因表达中的应用
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株与质粒 Halobacillus sp. SCSIO 20089 为
本实验室筛选自南海北部沉积物并保藏 ；枯草杆菌
表达载体 pWB980 及 Bacillus subtilis WB600 由广西
科学院王成华博士馈赠 ；大肠杆菌质粒 pUC18 购自
TaKaRa 公司；Escherichia coli JM109 为本实验室保存。
1.1.2 酶和试剂 PrimeStar DNA 聚合酶，限制性内
切酶，T4 DNA 连接酶及 λDNA/Hind Ⅲ DNA marker
均购自 TaKaRa 公司
1.1.3 培养基 LB 培养基（L）：蛋白胨 10 g，酵母
粉 5 g，NaCl 10 g，调 pH 至 7.0 ；培养基中卡那霉素
终浓度为 50 μg/mL，氨苄青霉素终浓度为 100 μg/mL。
1.2 方法
1.2.1 大肠杆菌抗性基因及复制子的克隆 根据公
布的 pUC18 的序列及图谱，设计一对引物扩增该质
粒中的大肠杆菌氨苄青霉素抗性基因表达元件及其
复制子（pMB1）。引物序列为上游引物 pUC18-AflII：
5-GAGCCTTAAGCCACACAACATACGAGCCGG-3 ；
下游引物 pUC18-MluI ：5-CGCGACGCGTGACGAAA-
GGGCCTCGTGATA-3，下划线分别为 Afl II 和 Mlu I
酶切位点，便于后续的连接反应。PCR 反应的退火
温度为 55℃，延伸时间为 2 min。
1.2.2 大肠杆菌-枯草杆菌杆菌穿梭载体的构建 构
建策略如图 1 所示。将大肠杆菌的复制子以及抗性
基因插入枯草芽孢杆菌表达质粒 pWB980 中，使得
到的新的载体能同时在大肠杆菌和枯草杆菌中复
制。在大肠杆菌中的抗性为氨苄青霉素，在枯草杆
菌中的抗性为卡那霉素。将经 Afl II 和 Mlu I 酶切的
来源于 pUC18 的抗性 + 复制子基因与经同样酶切的
pWB980 线性片段连接。连接产物转化至 Escherichia
coli JM109。氨苄抗性筛选重组子，重组质粒经酶切
测序验证后，用于枯草杆菌的表达。
PCR
blepwB980
Kan
AfI II
ble
P43 promoter
polylinker
rep Kan
Mlu l
AfI II
Ampr reppMB1
Ligation
oolylinker
P43 promoter
rep
ble
pY980coli
Kan
Ampr
reppMB1
Mlu l
PCR
Ampr
lacZ
pUC18
reppMB1
rep
polylinker
P43 promoter
图 1 大肠杆菌-枯草杆菌穿梭载体构建策略
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第9期148
1.2.3 蛋 白 酶 基 因 hspa 的 克 隆 Halobacillus sp.
SCSIO 20089 基因组 DNA 的提取参考 TaKaRa 细菌
基因组 DNA 提取试剂盒说明书。设计一对引物扩增
编码蛋白酶 HSPA 的前导肽 + 成熟肽基因，在上下
游引物的 5 端分别添加 Xho Ⅰ和 Pst Ⅰ酶切位点（下
划线部分）。上游引物 hspa-sense-Xho Ⅰ ：5-GCGC-
CTCGAGGGAAAAAGGAACAGATGTCCAAAAG-3 ；
下游引物 hspa-antisense-Pst Ⅰ ：5-GCGCCTGCAGA-
TATACTCCTACATTATCCCAA-3。PCR 反应程序为：
95℃ 5 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 2 min，30 个
循环 ；72℃ 10 min。获得的基因片段双酶切回收后
与经相同酶切的载体 pY980coli 连接。重组载体经双
酶切及测序验证后用于枯草杆菌的转化。
1.2.4 异源基因在枯草芽孢杆菌的转化及表达 重
组质粒的转化参考 Spizizen 等［6］的方法。转化后涂
布于含 1% 脱脂奶粉的 LB 平板上，50 μg/mL 卡那
霉素进行抗性筛选。阳性克隆可在抗性平板上生长，
且产生水解圈。接种重组子至 LB 液体培养基中，
28℃，180 r/min 摇床培养 48 h，每隔 4 h 检测发酵
液中的蛋白酶活力。
1.2.5 蛋白酶活力的检测 采用福林酚法，具体操
作参考国标蛋白酶制剂国标 GB/T 23527-2009。
2 结果
2.1 pWB980载体的线性化及大肠杆菌复制元件的
克隆
以枯草芽孢杆菌表达载体 pWB980 为模板，进
行反向 PCR，使其线性化，结果（图 2 第 1-3 泳道）
显示，pWB980 质粒由 3 787 个核苷酸组成，线性化
后在约 3.7 kb 处出现条带，证明成功将该质粒线性
化。线性化的 pWB980 末端分别添加了 Afl II 和 Mlu
I 酶切位点，便于后续连接反应。以大肠杆菌复制质
粒 pUC18 为模板扩增其氨苄抗性基因及复制子，如
图 2 中第 4 泳道在约 2.2 kb 处出现条带，与预期基
因片段大小一致，将其命名为 pUC18-coli。
2.2 穿梭质粒的构建与验证
将 2.1 获 得 的 两 段 基 因 用 Afl II 和 Mlu I 双 酶
切后进行连接，连接产物转化至大肠杆菌 JM109
中，挑选克隆提取质粒进行酶切验证。重组子中的
质粒应同时含有 pUC18 及 pWB980 的 序 列， 即 经
过 Afl II、Mlu I 双酶切后得到 3.7 kb 和 2.2 kb 的两
条带。如图 3 所示，证明构建的质粒同时具备在大
肠杆菌和芽孢杆菌的复制能力，命名为 pY980coli。
pY980coli 的启动子仍仅适用枯草杆菌，因而使用该
质粒表达外源基因时可在大肠杆菌中构建，将重组
质粒再转化至枯草杆菌中进行表达试验。
M 1 2 3 4
4.3
kb
2.3
2.0
pWB980
pUC18-coli
M ：λDNA/Hind Ⅲ DNA 分 子 量 标 准 ；1-3 ：质 粒 pWB980 线 性 化 产 物 ；
4 ：大肠杆菌质粒 pUC18 复制元件的扩增产物
图 2 大肠杆菌复制元件的克隆及 pWB980 载体的线性化
M1 M2 1
pWB980
pUC18-coli
M1 ：DL2000 DNA 分子量标准 ；M2 ：λDNA/Hind Ⅲ DNA 分子量标准 ；
1 ：穿梭载体 pY980coli 经 Afl II 和 Mlu I 酶切产物
图 3 穿梭载体的酶切验证
2.3 蛋白酶基因hspa的克隆及重组表达载体的构建
以 Halobacillus sp. SCSIO 20089 菌 株 的 基 因 组
DNA 为 模 板，hspa-sense-Xho Ⅰ 和 hspa-sense-Pst Ⅰ
为引物，PCR 扩增蛋白酶前导肽 + 成熟肽基因 hspa，
在约 1.5 kb 处出现明显条带，与预期大小一致（图
4-A）。PCR 产物经 Xho Ⅰ和 Pst Ⅰ双酶切后与经相
同酶切的穿梭载体 pY980coli 连接，重组质粒经酶切
验证（图 4-B）后委托华大基因进行测序以确认读
码框正确，命名为 pY980coli-hspa。使用穿梭质粒后，
表达载体构建过程在大肠杆菌内完成，转化及质粒
提取更方便高效。将验证无误的重组质粒化学转化
至 Bacillus sutilis WB600 中。
2013年第9期 149杨键等 ：大肠杆菌 - 枯草杆菌穿梭载体的构建及其在蛋白酶基因表达中的应用
构建在大肠杆菌中的穿梭载体，如抗辐射菌属-大肠
杆菌穿梭载体 pZT17［7］，苏云金杆菌-大肠杆菌穿
梭载体 pHV-1［8］，也有枯草杆菌-大肠杆菌的报道，
如刘成君等［9］以 pREP9 为出发质粒构建 pSUGV4，
梁晓梅等［10］以 pBE2 为骨架采用启动子嫁接成功构
建了 pBE2R。本研究首次以枯草芽孢杆菌的表达质
粒 pWB980 为骨架，插入 pUC18 的复制子和抗性基
因，在大肠杆菌和枯草杆菌中均能稳定地复制，提
高了使用枯草杆菌表达系统的效率。
与大部分 Thermolysin 家族的蛋白酶类似，蛋白
酶 HSPA 的成熟肽前有 199 个氨基酸组成的前导肽，
前导肽与成熟肽共同组成酶原，蛋白酶原无蛋白酶
活性。在蛋白酶自成熟的过程中前导肽会被切割加
工成为有活性的成熟酶。前导肽对于蛋白酶的成熟
不可或缺，扮演分子内伴侣的作用［11］。本研究前
期在大肠杆菌中获得可溶性的前导肽 + 成熟肽的蛋
白，但该蛋白无法自加工为有活性的成熟酶，有研
究报道在大肠杆菌的周质空间可检测到重组蛋白酶
活性［12］，提示酶原的分泌可能对其成熟有帮助，而
HSPA 的酶原蛋白又无法分泌至大肠杆菌周质空间。
因此本研究尝试利用分泌能力较强的枯草杆菌对蛋
白酶 HSPA 的基因进行表达，并获成功，为进一步
对研究蛋白酶 HSPA 的结构功能关系提供技术基础。
4 结论
成功构建大肠杆菌-枯草杆菌穿梭载体 pY980-
coli，该载体的应用提高了使用枯草杆菌表达系统的
效率。利用 pY980coli 质粒成功表达了一条在大肠杆
菌中不能得到活性表达的蛋白酶基因，在枯草杆菌
WB600 中实现了活性表达。
参 考 文 献
［1］ Wu SC, Wong SL. Development of improved pUB110-based vectors
for expression and secretion studies in Bacillus subtilis［J］. Journal
of Biotechnology, 1999, 72（3）：185-195.
［2］ 赵洪坤 , 刘兴旺 , 邱强 , 等 . 青霉素酶基因在枯草芽孢杆菌中的
高效表达［J］. 中国生物工程杂志 , 2007, 27（12）：31-35.
［3］ 刘逸寒 , 路福平 , 王建玲 , 等 . 中温 α-淀粉酶基因的克隆及在
枯草芽孢杆菌中的高效表达［J］. 天津科技大学学报 , 2011,
26（4）：1-5.
1.0
2.0
kb
M1 1 M2 2
4.3
2.3
2.0
6.5
kb
A B
hspa
pY980coli
hspa
M1 ：DL2000 DNA 分子量标准 ；1 ：蛋白酶基因 hspa 的扩增产物 ；
M2 ：λDNA/Hind Ⅲ DNA 分子量标记 ；2 ：重组载体 pY980coli-hspa
的 Xho Ⅰ和 Pst Ⅰ酶切验证
图 4 重组表达质粒 pY980coli-hspa 的构建
2.4 蛋白酶基因在枯草杆菌中的表达
载体 pY980coli 中的启动子是枯草杆菌 P43 启
动子，该启动子为组成型，因而阳性克隆无需添加
诱导剂即可在含脱脂牛奶的平板上形成活性透明圈，
而阴性对照的空 pY980coli 转化的枯草杆菌菌落周围
无水解圈（图 5），证明蛋白酶基因 hspa 成功在 B.
subtilis WB600 中得以表达。重组菌体在含 50 μg/mL
的 LB 培养基中发酵 30 h 达到产酶高峰为（48±8）
U/mL。
pY980coli-hspa
B. subtilis WB600
pY980coli
B. subtilis WB600
图 5 重组表达载体在枯草杆菌表达的活性平板
3 讨论
穿梭质粒具有两套来源于不同生物的复制子及
选择标记元件，可以克服亲缘关系较远的两种生物
在遗传上的障碍，实现同一质粒同时在不同生物体
内的复制。由于大肠杆菌遗传操作简便成熟，其质
粒拷贝数高，重组质粒易于大量制备，研究者偏爱
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第9期150
［4］ Liu YH, Lu FP, Chen GQ, et al. High-level expression, purification
and characterization of a recombinant medium-temperature alpha-
amylase from Bacillus subtilis［J］. Biotechnology Letters, 2010, 32
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（责任编辑 马鑫）