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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(5):153-157
杆菌肽是由地衣芽孢杆菌（Bacillus lichnifari-
mis）或枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）发酵产生的
一种多肽类广谱抗菌素，具有抗菌谱广、不产生耐
药性、安全性评估良好等优良特性。并且，杆菌肽
在动物保健中具有促进动物生长、提高机体免疫力
的作用，是一种在畜牧养殖业广泛应用的饲料添加
剂［1］。从分子结构而言，杆菌肽为一类多肽复合体，
包括杆菌肽 A、A1、B、C、D、E、F1、F2 等多种组分，
其中杆菌肽 A 为主要成分，且生物活性最高［2］。
美国雅来药厂（2011 年已经并入美国辉瑞公司）
是世界上杆菌肽最大的生产企业，目前国内生产企
业主要有浦城绿康生化有限公司、华北制药集团华
胜公司和天津新星兽药厂。随着我国畜牧业及水产
养殖业的迅猛发展，杆菌肽的需求与日俱增，杆菌
肽的发酵生产研究得到广泛关注。胡尚勤等［3］通过
细胞融合技术得到一株杆菌肽生产菌，使用柠檬酸
为碳源发酵，杆菌肽产量可以高达 985 U/mL。徐加
兵等［4］以一株地衣芽孢杆菌（B. licheniformis SIN-
669-3）为出发菌株，经过复合诱变选育和发酵培养
基优化，杆菌肽产量优化前提高 14.5%。有报道［5］
收稿日期 ：2014-09-19
基金项目 ：河北省教育厅计划（z2012206），保定市科技局计划（12ZN012）
作者简介 ：张玉明，博士，讲师，研究方向 ：发酵工程、生物化工 ；E-mail ：zhangyuming@hbu.edu.cn
杆菌肽产生菌的分离鉴定及其发酵条件初步研究
张玉明1  倪志华1  李宝库2
（1. 河北大学生命科学学院，保定 071002 ；2. 河北大学药学院，保定 071002）
摘 要 ： 杆菌肽在畜牧养殖业中应用广泛，开展菌种筛选工作十分必要。以低浓度杆菌肽为筛选方法，分离得到一株杆菌
肽产生菌，鉴定并命名为地衣芽孢杆菌 Y822（Bacillus licheninformis Y822）。该菌株发酵生产杆菌肽时，最适 pH 为 7.0，溶氧能够
促进产物肽积累。将 B. licheninformis Y822 传代 5 次，分别进行发酵试验，可得到（783.51±7.34）U/mL 杆菌肽，其中 A 组分占
（75.04±0.83）%。B. licheniformis Y822 杆菌肽产量较高，生产能力稳定，并且产物中杆菌肽 A 组分含量高，具有较高的工业应用
价值。
关键词 ： 地衣芽孢杆菌 ；杆菌肽 ；分离 ；鉴定
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.024
Isolation，Identification and Fermentation Characterization of a
Bacitracin Producing Bacteria
Zhang Yuming1 Ni Zhihua1 Li Baoku2
（1. College of Life Science，Hebei University，Baoding 071002 ；2. College of Pharmaceutical Science，Hebei University，Baoding 071002）
Abstract: Bacitracin has been widely utilized in livestock breeding and cultivation, and it is necessary to screen strains for improving
bacitracin production. In this study, low concentration of bacitracin was used to screen bacitracin producer, and one strain was isolated and
identified as Bacillus licheninformis strain Y822. The optimal culture condition for the strain was pH7.0, and the improvement of oxygen supply
was favorable to the production of bacitracin. B. licheninformis Y822 was sub-cultured for 5 generations. Each generation of the strain was
used to produce bacitracin using the optimized fermentation condition. The average value of the produced bacitracin from 5 generations of B.
licheninformis Y822 was （783.51±7.34）U/mL, and the percentage of bacitracin A was about（75.04±0.83）%. The production of bacitracin
by B. licheniformis Y822 was stable and efficient. Therefore, B. licheniformis Y822 was a potential candidate for producing bacitracin in industry.
Key words: Bacillus licheninformis ；bacitracin ；isolation ；identification
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.5154
使用固态发酵工艺生产杆菌肽，降低发酵产物中水
分，得到了高浓度杆菌肽产品。目前，关于杆菌肽
的研究报道多集中于菌种诱变及发酵条件优化方面。
而发酵生产时，菌种是技术关键。开展菌种筛选工作，
可丰富杆菌肽生产菌种资源，有助于杆菌肽的工业
生产，具有重要理论意义和巨大经济效益前景。
本研究首次以低浓度杆菌肽为筛选手段，从自
然界中分离杆菌肽抗性菌株，并从中筛选杆菌肽生
产菌种，重点选育杆菌肽 A 组分高产菌株源。对分
离得到的优良菌株进行发酵条件初步优化，旨在为
其工业开发利用提供必要的技术支持。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株 藤黄微球菌（Micrococcus luteus）为本
实验室保存，地衣芽孢杆菌（B. licheniformis）Y822
为本实验室分离得到。
1.1.2 主要仪器与试剂 722 型可见分光光度计（上
海菁华科技仪器有限公司）；恒温培养振荡器（哈尔
滨东联电子技术开发有限公司）；北京创通 P3000 型
高效液相色谱仪 ；Sigma 3K30 型高速离心机 ；KL-
UP-UV-10 型纯水机（成都康宁实验专用纯水设备
厂）；杆菌肽锌标准品（华北制药华胜有限公司）；
扫描电子显微镜（Hitachi SU8010 型）。
1.1.3 培养基 藤黄微球菌培养基 ：牛肉膏 0.15%，
蛋白胨 0.6%，酵母膏 0.6%，葡萄糖 0.1%，pH7.0。
Luria-Bertani（LB）培养基：蛋白胨 1%，酵母粉 0.5%，
NaCl 1%，pH7.0。杆菌肽筛选培养基 ：将杆菌肽锌
标准品使用 0.01 mol/L 盐酸溶液溶解，添加到灭菌
后 LB 固体培养基内，使杆菌肽锌终浓度为 10 U/mL，
培养基倾倒平板备用。
1.2 方法
1.2.1 发酵方法 杆菌肽发酵方法采用徐加兵等［4］
描述的培养基。种子培养基 ：黄豆饼粉 2.2%，淀粉
0.8%，碳酸钙 0.5%。发酵培养基 ：淀粉 2.5% ；豆
粕粉 7.0%，硫酸铵 0.06%，碳酸钙 0.6%。上述培养
基均在 121℃灭菌 30 min。种子培养条件为 ：37℃、
150 r/min、pH 自然，发酵培养温度为 37℃。
1.2.2 杆菌肽含量的测定 以藤黄微球菌为敏感菌
株，使用双碟法［3］测定发酵液中杆菌肽效价。使用
高效液相色谱法测定发酵液中杆菌肽 A 的含量［6］。
1.2.3 杆菌肽产生菌的分离筛选 将果园土样、活
性污泥、畜牧场周边土样和泡菜汁等样品 90℃处理
15 min，冷却至室温，取 0.2 mL 涂布于杆菌肽筛选
培养基平板，37℃恒温培养。培养 24 h 后，挑取在
培养基上生长大而饱满菌落斜面保存。制备藤黄微
球菌平板，将筛选得到的菌株接种于藤黄微球菌平
板，37℃培养 24 h，测量抑菌圈直径（H）和菌落
直径（C），选取 H/C 比值大的菌株保存斜面，以备
复筛。然后，将上述筛选得到菌株接种于发酵培养
基中，37℃ 200 r/min 振荡培养 48 h，测定发酵液中
杆菌肽含量。
1.2.4 菌种的鉴定 将筛选得到的杆菌肽产生菌进
行生理生化鉴定，并对其 16S rRNA 序列扩增测序，
测序结果比对分析，并提交至 GenBank 数据库。
1.2.5 发酵条件的初步研究 使用 1.2.1 描述的杆菌
肽种子培养基和发酵培养基，分别考察种子培养条
件（种龄、接种量）和发酵培养条件（pH、装液量）
对生产杆菌肽的影响。
2 结果
2.1 杆菌肽产生菌的分离、筛选及鉴定
经平板初筛、藤黄微球菌抑菌试验和发酵培养
复筛，共筛选到 12 株杆菌肽产生菌。其中一株产
芽孢细菌 Y822，不仅具有较高的杆菌肽生产能力，
且杆菌肽产物中 A 组分含量高。因此，选此菌株进
行深入研究。菌株 Y822 在 LB 培养基上菌落呈圆
形，边缘不齐，较薄，表面粗糙，不透明，显灰白
色。显微镜镜检发现，该菌呈杆状，有中生芽孢，
菌体长 1.5-3.0 μm，宽 0.6-0.8 μm。菌株 Y822 革兰
氏染色呈阳性，其生理生化试验结果如表 1 所示。
进而对菌株 Y822 的 16S rRNA 进行测序，测序结果
提交 GenBank（登录号 HQ005269）。根据生理生化
试验结果和 16S rRNA 测序分析结果，菌株 Y822 鉴
定为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis），命名为
Bacillus licheniformis Y822，图 1 为其扫描电镜图。
2.2 种子培养条件对发酵生产杆菌肽的影响
将斜面培养的 B. licheniformis Y822 接种入液体
种子培养基，选择 6 个时间点（图 2-A）的种子培
养液接种发酵（接种量 5%），考察种子液种龄对发
2015,31(5) 155张玉明等：杆菌肽产生菌的分离鉴定及其发酵条件初步研究
酵的影响。发酵培养条件设定为 37℃、pH6.0，500
mL 三角瓶装液量 100 mL，摇床转速 200 r/min，发
酵 48 h 后测定杆菌肽含量。
图 2-A 显示，种子培养 10 h 后接种发酵，得到
268.44 U/mL 的杆菌肽。随着种子培养时间的延长，
杆菌肽产量不断提高。当种子培养 25 h 时接种发酵，
可以得到最大杆菌肽产量 524.54 U/mL。图 2-B 为接
种量对发酵生产杆菌肽的影响，此时，种子培养时
间固定为 25 h，发酵培养条件同上，发酵 48 h 后测
定杆菌肽产量。本试验共考察了 6 个不同的接种体
积（3%-13%），试验显示 9% 接种量为最佳值，发
酵可得到 624.55 U/mL 杆菌肽。
2.3 发酵条件对生产杆菌肽的影响
将发酵培养基 pH 分别调整为 6.0、6.5、7.0、7.5
和 8.0，培养基灭菌后，接种种子培养液进行杆菌肽
发酵试验，接种量 9%。发酵液置于 500 mL 三角瓶
装中，装液量 100 mL，37℃恒温震荡（200 r/min）
培养 48 h 后测定杆菌肽产量。如图 3-A 所示，培养
基初始 pH 为 6.0 时，得到杆菌肽 620.56 U/mL。当
pH 值由 6.0 上升至 7.0 时，杆菌肽产量逐渐上升。
发酵液中杆菌肽浓度在培养基初始 pH7.0 时达到最
大值（712.36 U/mL）。发酵培养基 pH 高于 7.0 后，
杆菌肽产量反而呈现下降趋势。结果表明，中性环
境更适宜菌株 B. licheniformis Y822 积累杆菌肽。
进一步考察通气量对发酵生产杆菌肽的影响。
摇床震荡培养时，在相同转速下装液量的大小直接
表 1 菌株 Y822 的生理生化特征
鉴定项目 结果 鉴定项目 结果 鉴定项目 结果
过氧化氢酶 ＋ D- 葡萄糖 ＋ 酪素水解 ＋
接触酶 ＋ L- 阿拉伯糖 ＋ 明胶水解 ＋
V.P 反应 ＋ D- 木糖 ＋ 淀粉水解 ＋
V.P 终培养 pH 值 5.8 D- 甘露醇 ＋ pH5.7 生长 ＋
吲哚试验 － 丙酸盐利用 ＋ 2% NaCl ＋
厌氧生长 ＋ 柠檬酸盐利用 ＋ 5% NaCl ＋
甲基红反应 ＋ 尿素利用 － 7% NaCl ＋
酪氨酸水解 - 硝酸盐利用 ＋ 最高生长温度 55℃
注 ：＋ ：阳性 ；－ ：阴性
图 1 B. licheniformis Y822 的扫描电镜图
600A
500
400
300
200
100
0
5 10 15 25 35 403020ษޫᰦ䰤hᵶ㧼ӗ䟿/U·mL-1 
600
B
500
400
300
200
100
0
3 7 11 1395 ᧕⿽䟿ᵶ㧼ӗ䟿/U·mL-1 
图 2 培养条件对 B. licheniformis Y822 生产杆菌肽的影响
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.5156
3 讨论
从自然界样品中分离筛选菌种时，选择合适的
筛选方式十分重要。有研究报道［7，8］，杆菌肽在细
胞内合成后，需要通过位于细胞膜上的转运蛋白将
其分泌到胞外。如果胞外杆菌肽浓度超过一定限度，
位于细胞膜上的信号蛋白会阻止杆菌肽合成，从而
避免杆菌肽产生自身毒害。一般而言，对杆菌肽耐
受能力越强的菌株，其自身越有可能具备强大的杆
菌肽合成能力。
杆菌肽生产菌株大多分布于芽孢杆菌属［3］，本
研究对样品 90℃处理 15 min，目的是为了杀死样品
中杂菌（不产芽孢细菌和霉菌）。随后，以低浓度杆
菌肽为筛选手段进一步优选杆菌肽生产菌株。本试
验共筛选得到了 12 株杆菌肽产生菌，经过初步鉴定，
分 别 属 于 地 衣 芽 孢 杆 菌（Bacillus licheninformis）、
枯 草 芽 孢 杆 菌（Bacillus subtilis） 和 蜡 状 芽 孢 杆
菌（Bacillus cereus）。其中，分离并鉴定得到的 B.
licheniformis Y822 生长速度快，对指示菌（藤黄微
球菌）抑菌效果最佳，因此主要对其进行深入研究。
发酵前进行种子培养可以达到活化菌种、获得
高浓度细胞的目的。并且，种子培养还可诱导微生
物产生适用于发酵生产的多种酶类，可提高后续发
酵效率。试验发现，当接种培养 10 h 后，种子培养
基开始出现明显液化，即黄豆饼粉和淀粉被酶解利
用。因此，从 10 h 开始考察种子培养基培养时间对
发酵生产杆菌肽的影响。种子液培养时间低于 25 h
时，菌体虽然开始产生淀粉酶和蛋白酶液化培养基，
但是还仅限于细胞增殖，与杆菌肽合成相关酶系没
有得到诱导表达。此时接种发酵，会导致菌体利用
发酵培养基中碳源和氮源大量增殖，导致后期合成
杆菌肽时营养不足。种子液培养 25 h 时，菌体正处
于对数生长末期，此时菌体已经开始合成杆菌肽。
接种发酵后，菌体利用发酵培养基继续合成杆菌肽，
达到了最高产量。种子培养超过 25 h 后，由于种子
培养基中营养匮乏和杆菌肽积累，微生物镜检发现
菌体开始产生芽孢，不利于继续接种发酵培养基。
工业发酵生产过程中，发酵接种量一般控制在 5%-
10% 之间。接种量过低，发酵培养时没有足够的菌
体细胞，会导致延滞期过长，降低发酵产率。接种
600
700
800A
500
400
300
200
100
0
6.0 7.0 8.07.56.5
pH
ᵶ㧼㛭ӗ䟿/U·mL-1 
600
700
800B
500
400
300
200
100
0
60 100 1208040 㻵⏢䟿/mLᵶ㧼㛭ӗ䟿/U·mL-1 
图 3 发酵条件对 B. licheniformis Y822 生产杆菌肽的影响
关系到发酵时的通气量。本研究在 500 mL 三角瓶中
分别装入 40、60、80、100 和 120 mL 发酵培养基，
37℃，摇床 200 r/min 振荡培养 48 h 后测定杆菌肽产
量，结果（图 3-B）显示，当培养基装液量为 40 mL
时，B. licheniformis Y822 发酵得到的杆菌肽浓度最
高（779.54 U/mL）。
2.4 发酵生产杆菌肽稳定性试验
将斜面培养的 B. licheniformis Y822 菌株连续传
代培养，共传 5 代。将每一传代得到的菌株进行杆
菌肽发酵试验，以验证菌株的发酵产量和稳定性。
结果（表 2）显示，B. licheniformis Y822 传代 5 次的
平均产量为（783.51±7.34）U/mL，其中杆菌肽 A
占（75.04±0.83）%。
表 2 B. licheniformis Y822 发酵生产杆菌肽的稳定性试验
传代次数 杆菌肽含量 /（U·mL-1） 杆菌肽 A 组分比例 /%
1 782.68 74.67
2 779.35 75.97
3 780.46 74.58
4 778.69 74.10
5 796.36 75.86
注 ：试验数值为 3 次平行试验的平均值
2015,31(5) 157张玉明等：杆菌肽产生菌的分离鉴定及其发酵条件初步研究
量过高会导致引入发酵培养基的细胞过多，过度消
耗培养基中营养，不利于发酵产物积累。本研究中，
过高的接种量还会导致 B. licheniformis Y822 在种子
培养液中积累的杆菌肽引入发酵培养基中，不利于
后续发酵过程，因此最佳接种量为 9%。
培养条件是发酵过程中的关键因素，本研究考
察培养基 pH 和通气量（装液量）对发酵生产杆菌
肽的影响。研究显示，B. licheniformis Y822 在中性
条件下生产杆菌肽能力最强。雷波［9］研究了 pH 对
B. licheniformis 的影响，结果显示 7.0 和 7.4 是菌体
最佳生长 pH 和最优抑菌条件，其结果与本研究相
一致。本研究中，菌株 B. licheniformis Y822 发酵产
生的杆菌肽浓度与通气量密切相关。邓坤等［10］详
细研究了利用地衣芽孢杆菌发酵生产杆菌肽时，培
养基中溶氧对产物积累的影响。其研究表明，发酵
液中溶氧提高，会显著提高菌体活力，强化菌体的
糖酵解和三羧酸循环代谢。并且，高溶氧还会提高
培养基中溶解氨基酸浓度，有利于合成杆菌肽［11］。
从自然界筛选得到菌株在多次传代培养过程中
容易产生遗传性状退化，影响其工业化应用价值。
本研究将 B. licheniformis Y822 传代 5 次，菌种生产
杆菌肽的能力未发现明显衰减，并且杆菌肽 A 含量
始终保持在 75% 左右。杆菌肽是一类多肽混合物，
其中 A 组分含量决定着其生物活性高低，筛选高产
杆菌肽 A 组分的菌种更具应用价值［12］。本研究分离
筛选得到杆菌肽生产菌（B. licheniformis Y822），菌
株遗传性好，产量稳定，并且产物中 A 组分含量高，
具有较好的工业应用潜力。如果进一步对该菌进行
深入研究（如优化培养基组分，使用发酵罐培养以
提高溶解氧等），相信 B. licheniformis Y822 会有更好
的发酵表现。
4 结论
本研究利用杆菌肽生产菌具备抗自身代谢产
物抑制特点，使用低浓度杆菌肽为筛选手段，成
功分离得到杆菌肽产生菌 B. licheniformis Y822。B.
licheniformis Y822 发酵生产杆菌肽能力稳定，可得
到生产（783.51±7.34）U/mL 杆菌肽，其中杆菌肽
A 占（75.04±0.83）%。
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（责任编辑 马鑫）