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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第4期
在我国沿海地区，由于具有重要的医用、食用
价值，海参人工养殖已发展成一项前景广阔的经济
产业。但近几年，随着养殖密度的增大，常见的病
害严重制约了海参养殖业的发展，同时，抗生素类
药物的大量使用增加残留，也引起了相应的食品安
收稿日期 ： 2014-01-02
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31072224），辽宁省高等学校重大科技平台专项（LT2011008）
作者简介 ：李丹，女，硕士研究生，研究方向 ：海洋生物技术 ；E-mail ：804484017@qq.com
通讯作者 ：丛丽娜，女，教授，研究方向 ：海洋生物活性物质的研究和开发 ；E-mail ：linacong@163.com
海参溶菌酶基因在枯草芽孢杆菌 WB600 中的
整合及表达
李丹  李成  孙璐  邹丹  刘志文  丛丽娜
（大连工业大学生物工程学院，大连 116034）
摘 要： 采用枯草芽孢杆菌 WB600（Bacillus subtilis WB600）在体外表达海刺参溶菌酶（Stichopus japonicus lysozyme，SjLys）蛋白。
通过构建克隆质粒 pMD18-P43-SjLys，将 B. subtilis 自身强启动子 P43 序列和已分离得到的 SjLys 基因（GenBank 登录号 EF036468）
连接（P43-SjLys）。经 BamH I/EcoR I 酶切，将 P43-SjLys 片段连接到 B. subtilis 整合载体 pDG1730 上，构建整合重组质粒 pDG-P43-
SjLys。经 Xho I 酶切处理，线性化的 pDG-P43-SjLys 质粒转化 B. subtilis WB600 细胞。P43-SjLys 片段通过同源双交换重组整合到 B.
subtilis WB600 染色体上，成功得到具有稳定遗传的基因工程菌 B. subtilis WB600/P43-SjLys。经 SDS-PAGE 和抑菌试验分析表明，
培养 60 h 后，B. subtilis WB600/P43-SjLys 能够表达可溶的，对常见的海洋细菌溶壁微球菌和金黄色葡萄球菌具有较强的抑菌活性
的 SjLys 蛋白。首次在 B. subtilis 表达系统中得到可溶且具有酶活功能的 SjLys 蛋白，为 SjLys 的生产提出了一种具有可行性的和潜
力的新方法。
关键词 ： 海参溶菌酶 枯草芽孢杆菌 启动子 P43 同源重组 整合表达
Integrative Expression of Stichopus japonicus Lysozyme Gene in
Bacillus subtilis
Li Dan Li Cheng Sun Lu Zou Dan Liu Zhiwen Cong Lina
（School of Biology Engineering，Dalian Polytechnic University，Dalian 116034）
Abstract:  In this study, we cloned promoter P43 of B. subtilis in the front of Lysozyme from Stichopus japonicus（SjLys） gene by
constructing the recombinant plasmid pMD18-P43-SjLys. Then we obtained the integration plasmid pDG-P43-SjLys of B. subtilis by subcloning
the P43-SjLys fragment into the plasmid of pDG1730. We transformed the linear integration plasmid digested by Xho I into B. subtilis WB600,
and selected the re-combinant strain by Spc resistance screening and amylase activity negative screening. After incubation at 37℃, 220 r/min in
LB medium, the cellular lysate of this strain was detected by the SDS-PAGE assay. The results demonstrated that B. subtilis WB600/P43-SjLys
successfully expressed soluble SjLys after incubated for 60 h. The cellular lysate of B. subtilis WB600/P43-SjLys displayed inhibitive effect on
the growth of the Micrococcus lysodeikticus and Staphylococcus aureus. In this study, we expressed SjLys gene integratedly in B. subtilis for the
first time, and proposed a potentially new way of producing SjLys protein.
Key words:  Lysozyme of Stichopus japonicus Bacillus subtilis Promoter 43 Homologous recombination Integrative expression
全问题。随着深入地研究发现，海参溶菌酶（Stich-
opus japonicus lysozyme，SjLys）作为一种具有糖苷酶
活性和广谱、非酶抑菌活性的 i 型溶菌酶，是海参
机体先天免疫系统中的重要防御因子，具有广泛的
抗菌谱。在人工养殖中，海参溶菌酶作为抗生素重
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第4期140
要的替代品，对通常引起水产动物严重病害的病原
菌弧菌和假单胞菌具有明显的抗菌效果，也能有效
解决抗生素残留问题，在绿色水产养殖中已经引起
国内外研究人员的高度重视［1-5］。
采用大肠杆菌系统成功表达 SjLys 蛋白已有报
道［5-7］。但是，其中存在一些不可忽视的问题。一
方面，因为单独表达的全长 SjLys 蛋白主要以包涵
体状态存在，所以目前原核 E. coli 系统得到的可溶
的，具有抑菌活性的 SjLys 蛋白及其部分截断片段
主要以融合蛋白 Trx-His-SjLys 形式存在［6，7］，这不
利于后续蛋白理化性质的深入研究。另一方面，宿
主 E. coli 会产生内毒素、细胞毒素和肠毒素等对人
体有害的物质 ；同时，为了保持质粒的稳定性，重
组 E. coli 培养过程中需要使用抗生素，增加抗生素
类物质的残留，这些都存在食品安全问题。
作为食品安全级别的原核表达宿主，枯草芽孢
杆菌（B. subtilis）具有表达可溶的、非融合蛋白的
能力。B. subtilis 也具备 E. coli 没有的一些优良特性，
如不产内毒素和致热敏蛋白质，非致病性，且没有
明显的密码子偏好性［8，9］。迄今为止，在枯草芽孢
杆菌及其近缘种中已经克隆和表达了大量的原核和
真核基因，其中有的已应用于工业化生产［10，11］。
本试验将选取 B. subtilis WB600 作为 SjLys 内源
表达宿主。通过构建克隆质粒 pMD18-P43-SjLys，利
用基因工程手段，构建带有强启动子 P43 的整合载
体 pDG-P43-SjLys。载体线性化后，转化到已敲除
6 种蛋白酶基因的 B. subtilis WB600 中，通过同源
双交换重组将 SjLys 表达元件整合进枯草芽孢杆菌
基因组染色体中，并对海参溶菌酶在宿主 B. subtilis
WB600/P43-SjLys 中的表达进行初步研究，旨在为
SjLys 的生产提出一种具有可行性和潜力的新方法。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种与质粒 试验涉及的菌株、质粒及其相
关性质、来源详见表 1。
表 1 供试菌株和质粒
菌株与质粒 基因型、表型的描述 来源
E. coli DH5α 菌株 supE44，hsdR17，recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1 本实验室保存
B. subtilis 168 菌株 trpC2 上海 Genemy BioTech Co. 公司
B. subtilis WB600 菌株 apr，nprA，epr，bpf，mpr，nprB，trpC2 上海 Genemy BioTech Co. 公司
pMD18-T 质粒 大肠杆菌 T 克隆载体，Ampr，lacZ，MCS 日本 TaKaRa 公司
pMD18-SjLys 质粒 带有 SjLys 编码序列的 pMD18 克隆载体，Ampr 本实验室保存
pMD18-P43 质粒 带有启动子 p43 编码序列的 pMD18 克隆载体，Ampr 本试验构建
pMD18-P43-SjLys 质粒 带有启动子 p43 和 SjLys 编码序列的 pMD18 克隆载体，Ampr 本试验构建
pDG1730 质粒 枯草芽孢杆菌整合质粒 pDG1730，amyE’....’amyE，ermr，blar，spcr 孙明教授（华中农业大学）给予
pDG-P43-SjLys 质粒 带有启动子 p43 和 SjLys 编码序列的枯草芽孢杆菌整合质粒 本试验构建
1.1.2 试剂和培养基 限制性核酸内切酶，Taq DNA
聚 合 酶 和 DNA ladder marker 购 自 TaKaRa（ 大 连 ）
公司 ；质粒提取和琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒购自
天根生化科技（北京）有限公司 ；细菌基因组 DNA
提取试剂盒购自北京艾来德生物科技有限公司 ；引
物为华大基因科技股份有限公司（北京）合成 ；其
它常用试剂为国产分析纯。
LB 培 养 基 组 分 ：10 g/L NaCl，10 g/L 蛋 白 胨，
5 g/L 酵母粉。固体 LB 培养基添加 1.5%（W/V）琼
脂粉。大肠杆菌转化子筛选采用 100 μg/mL 氨苄青
霉素（Ampr）抗性，枯草芽孢杆菌转化子筛选采用
100 μg/mL 壮观霉素（Spcr）抗性，枯草芽孢杆菌感
受态细胞的制备参照文献［12］。
1.2 方法
DNA 的纯化和浓缩、大肠杆菌感受态细胞的制
备及转化、质粒提取、DNA 片段的酶切和连接等操
作均参考相应产品 / 试剂盒说明书进行。
1.2.1 启动子 P43 基因序列的扩增 参照细菌基因
组 DNA 提取试剂盒的说明提取 B. subtilis 168 基因组
DNA。以 B. subtilis 强启动子 P43 基因序列为模板，
设 计 上、 下 游 引 物，P43-1 ：5-GATTCTTCGGATC-
CTTCGTGCATGCA-3（下划线为 BamH I 酶切位点）
2014年第4期 141李丹等 ：海参溶菌酶基因在枯草芽孢杆菌 WB600 中的整合及表达
和 P43-2 ：5-TTCCTCCCATGGCTATAATGGTACCG-
C-3（下划线为 Nco I 酶切位点）。
用 Taq DNA 聚 合 酶 PCR 扩 增 P43 序 列，PCR
反应条件 ：94℃ 5 min ；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃
40 s，30 循环 ；72℃ 10 min。PCR 反应结束后，琼
脂糖凝胶电泳检测结果。
1.2.2 重组质粒 pMD18-P43、pMD18-P43-SjLys 和 pD-
G-P43-SjLys 的构建 将“1.2.1”中用 Taq 酶扩增的 3
末端带突出碱基“核苷酸 A”的 PCR 产物（启动子
P43）与线性载体 pMD18-T 进行 TA 连接。在 16℃
条件下，过夜连接，构建重组克隆质粒 pMD18-P43。
重组质粒 pMD18-P43 和 pMD18-SjLys（实验室
保存）分别用 BamH I/Nco I 双酶切 3 h。凝胶电泳鉴
定后，纯化、回收目的片段。在 16℃条件下，将上
述酶切回收的 P43 启动子片段和线性载体 pMD18-
SjLys 过夜连接，构建克隆载体 pMD18-P43-SjLys。
质粒 pMD18-P43-SjLys 和整合载体 pDG1730 用
BamH I/EcoR I 双酶切 3 h。凝胶电泳鉴定后，回收
目的片段。在 16℃条件下，将 P43-SjLys 片段和线
性整合载体 pDG1730 过夜连接，构建枯草芽孢杆菌
的整合载体 pDG-P43-SjLys。
1.2.3 质 粒 与 B. subtilis WB600 的 整 合 B. subtilis
WB600 感 受 态 细 胞 的 制 备 及 转 化 方 法 参 考 文
献［12］。经 Xho I 线性化处理后，重组质粒 pDG-
P43-SjLys 电转化至 WB600 感受态细胞，并筛选阳
性同源重组细胞 B. subtilis WB600/P43-SjLys。
1.2.4 SjLys 蛋白在 B. subtilis WB600 中的表达 菌
体 B. subtilis WB600/P43-SjLys 细 胞， 过 夜 活 化 后，
按 1% 的接种量转接至 LB 液体培养基，200 r/min，
37℃培养，每隔一段时间取 50 mL 发酵液，离心收
集菌体。培养不同时间的菌体经冻融处理后，超声
破碎（功率 ：150 W ；破碎 / 间隔 ：5 s/5 s ；15 min）。
低温离心（4℃，12 000 r/min，30 min），收集上清液，
弃沉淀。
用 60% 的（NH4）2SO4 处理上清液，低温高速
离心，收集沉淀。沉淀样品用 1×PBS（pH7.4）溶解，
再于 7 kD 的透析袋中透析除盐。15% 的 SDS-PAGE
电泳检测 SjLys 蛋白在 B. subtilis WB600 中的表达情
况。银染显色检测 SDS-PAGE 中的蛋白条带［13］。试
验选取 B. subtilis WB600 空宿主进行上述处理，作为
阴性对照。
1.2.5 SjLys 蛋白抑菌活性的检测 抑菌试验与之前
的研究方法类似［6，7］，用滤纸片法测定抑菌圈大小。
试验以溶壁微球菌和金黄色葡萄球菌作为指示菌。
取 50 μL 的指示菌液（OD600 ≈ 0.05），均匀涂抹在
LB 固体培养基上，再放入灭菌的滤纸片。将“1.2.4”
中培养了 60 h 的，经过处理的样品，取 20 μL 加到
灭菌的滤纸片上，30℃过夜培养，测量抑菌圈；以空宿
主细胞破碎、离心后的上清液作为阴性对照。做 3
组平行试验。
2 结果
2.1 重组质粒的构建及筛选
2.1.1 重组质粒 pMD18-P43 的构建及筛选鉴定 根
据图 1-A 的试验方案，构建含 B. subtilis 自身强启动
子 P43 序列的克隆载体 pMD18-P43。启动子 P43 是
B. subtilis 的组成型强启动子，含有约 430 bp 的核苷
酸（图 1-B）。
PCR 反应以 B. subtilis 168 基因组总 DNA 为模
板，P43-1/P43-2 为引物，在 Taq 酶作用下，扩增启
动子 P43 片段。经 1.5% 的琼脂糖凝胶电泳（图 1-C，
lane 2）分析显示，在约 430 bp 处有一特异扩增条带，
与预计的启动子 P43 片段大小相符，这表明 PCR 扩
增成功。将 3 端带有核苷酸“A”的 P43 扩增片段
与线性化 T 载体 pMD18 进行 TA 连接，构建质粒
pMD18-P43（图 1-A）。挑取单菌落扩大培养并提取
质粒，将质粒用 BamH I/Nco I 酶切，1.5% 琼脂糖凝
胶电泳鉴定检测。如果是重组质粒 pMD-P43，酶切
后应得到大小两条带，2 692 bp 附近的 pMD18 空载
体和 430 bp 左右的启动子 P43 ；反之，如果是空质
粒 pMD18，则只能得到一条带。电泳结果（图 1-C，
lane 3）显示，质粒酶切后得到 2 条带，分别处在
400-500 bp 和 2-3 kb 之间，与理论大小一致，表明
试验成功构建了重组质粒 pMD18-P43。
2.1.2 重组质粒 pMD18-P43-SjLys 的构建及筛选鉴
定 根据试验方案图 2-A，将 B. subtilis 启动子 P43
连 接 至 克 隆 载 体 pMD18-SjLys 中， 构 建 重 组 质 粒
pMD18-P43-SjLys。产物转化E. coli DH5α感受态细胞，
蓝白斑筛选挑取转化子，进行菌落 PCR。产物经琼
脂糖凝胶电泳分析显示，在 450 bp 左右扩增得到一
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第4期142
条带，与 P43 大小一致（图 2-B，lane 2）。单菌落扩
大培养后提取质粒，用 BamH I/Nco I 酶切鉴定。琼
脂糖凝胶电泳（图 2-B，lane 3）显示，质粒酶切后
得到两条带，分别约为 400 bp 和 3.0 kb，分别与启
动子 P43 和质粒载体 pMD-SjLys 大小一致，表明质
粒 pMD18-P43-SjLys 重组成功。
Amp
pMD18-P43 Vector
P43 promoter
ori
Nco I
BamH I
T4 Ligase
P43 promoter
BamH I
T clone siteLacZ
Amp
A
B
C
bp 1 2 3 4 bp
pMD18-T Vector
ori
PCR Taq DNA polymerase
P43 promoter：
σA -35
σB -35 σB
RBS
-10
σA -10
Nco I
1500
1000
2000
3000
4000
10000
1000
900
800
700
600
500
400
300
200
100
（C） 1 ：100 bp DNA ladder ；2 ：启动子 P43 序列 ；3 ：pMD18-P43/BamH I+Nco I ；4 ：1 kb DNA ladder
图 1 重组质粒 pMD18-P43（A），P43 启动子核酸序列（B）和琼脂糖凝胶电泳检测（C）
Amp
pMD18-P43 Vector
P43 promoter
Nco I
BamH I
Nco I
BamH I
EcoR I
P43
A
ori
BamH I/Eco I
P43BamH I NcoI
T4 Ligase
Xho I pMD18-SjLys
SjLys
Amp
pMD-P43-SjLys
SjLys
EcoR I
Nco I
BamH I
BamH I/Nco I
amyE˃
P43
ori
a˃myE
ori
Amp
bla
B
1500
1000
2000
3000
4000
10000
bpbp
1 2 3 4
1000
900
800
700
600
500
400
300
200
100
5000
（B）1 ：100 bp DNA ladder ；2 ：启动子 P43 序列 ；3 ：pMD18-P43-SjLys/BamH I+Nco I ；4 ：1 kb DNA ladder
图 2 重组质粒 pMD18-P43-SjLys 的构建（A）和琼脂糖凝胶电泳检测（B）
2.1.3 整合载体 pDG-P43-SjLys 的构建及筛选 根
据试验方案图 3-A，经 BamH I/EcoR I 酶切后，将目
的片段 P43-SjLys 插入 pDG1730，构建重组整合质粒
pDG-P43-SjLys。转化 E. coli DH5α 感受态细胞，通
过壮观霉素（Spc）抗性（100 μg/mL）筛选转化子。
菌 落 PCR 的 产 物 经 DNA 凝 胶 电 泳 分 析 显 示， 在
2014年第4期 143李丹等 ：海参溶菌酶基因在枯草芽孢杆菌 WB600 中的整合及表达
450 bp 左右得到一条扩增带，与 P43 大小一致（图
3-B，lane 2）。提取质粒，经 BamH I/EcoR I 酶切鉴定。
琼脂糖凝胶电泳显示，质粒酶切后得到两条带，分
别为 400 bp 及 8.0 kb 左右（图 3-B，lane 3），分别
与启动子 P43 和整合空载体 pDG1730 大小一致，这
表明质粒 pDG-P43-SjLys 重组成功。
Amp
pMD18-P43-SjLys
SjLys
EcoRI
NcoI
BamHI
BamHI
HindIII
EcoRI
P43
A B
ori
BamHI/EcoRI
P43-SjLysBamHI EcoRI
XhoI pDG1730
1500
1000
2000
3000
4000
10000
bpbp
1 2 3 4
1000
900
800
700
600
500
450
350
400
300
250
200
150
100
50
Xho I
pMD-P43-SjLys
SjLys EcoRI
BamHI
BamHI/EcoRI
spc
bla
amyE˃
amyE˃
a˃myE
P43
erm
a˃myE
erm
spc
bla
（B）1 ：50 bp DNA ladder ；2 ：启动子 P43 序列 ；3 ：pDG-P43-SjLys/BamH I+EcoR I ；4 ：1 kb DNA ladder
图 3 重组质粒 pDG-P43-SjLys 的构建（A）和琼脂糖凝胶电泳检测（B）
2.2 重组质粒的转化及筛选
经 Xho I 酶 切 线 性 化 处 理 后， 重 组 整 合 质 粒
pDG-P43-SjLys 电转化至 B. subtilis WB600。P43-Sj-Lys
处于 pDG1730 上与 B. subtilis α-淀粉酶基因同源的两
段序列 amyE’和’amyE 之间，并与 Spc 基因相连
（图 4-A）。整合质粒 pDG-P43-SjLys 通过同源重组可
将 P43-SjLys 和 Spc 基因整合到 B. subtilis 基因组中
的 α-淀粉酶位点上（图 4-A）。试验通过 Spc 抗性平
板初筛转化子。
因为整合质粒以同源双交换方式整合，α-淀粉
B. subtilis 168
intergration-chromosome
α-amylase gene fragment α-amylase gene fragment
α-amylase gene
B
1 2
amyE˃
5˃ 3˃
a˃myEP43 SjLysSpc
P43
B. subtilis 168
chromosome
pDG-P43-SjLys
A
SjLys Spc
图 4 重组质粒 pDG-P43-SjLys 线性化后与基因组发生同源重组（A）和淀粉水解圈检测（B）
酶基因被敲除（图 4-A）。利用这一性质也可以将
同源双交换的重组菌挑选出来。将具有 Spc 抗性的
阳性菌株与未转化质粒的空白对照菌株分别点在含
0.2%（W/V）淀粉的固体平板上，通过革兰氏碘液显
色法观察对比平板上的淀粉水解圈。试验结果（图
4-B）显示，没有转化质粒的对照菌株 1 出现了明显
的淀粉水解圈，而转化了线性整合载体的菌落 2 周
围没有水解圈。上述结果均表明，整合载体通过同
源双交换重组将 P43-SjLys 整合到 B. subtilis WB600
基 因 组 DNA 上， 成 功 构 建 表 达 系 统 B. subtilis
WB600/P43-SjLys。
2.3 SjLys蛋白在B. subtilis WB600/P43-SjLys中表达
通 过 紫 外 分 光 光 度 计 检 测 菌 体 浊 度（A =
600 nm）， 分 别 绘 制 B. subtilis WB600 和 B. subtilis
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第4期144
WB600/P43-SjLys 菌 体 细 胞 的 生 长 曲 线（ 图 5-A）。
结果（图 5-A）表明，α-淀粉酶不是 B. subtilis 正常
生长的必需因子，所以敲除淀粉酶基因并不会影响 B.
subtilis 的生长和繁殖。B. subtilis WB600/P43-SjLys 的
生长曲线数据也表明，培养了 48 h 左右的菌株已经
开始进入生长平台期，继续再发酵一段时间，约 60
h 后，由于菌体活力及培养基养不充足等因素，导
致摇瓶内菌体的整体生长停滞，菌体浓度下降。
将 B. subtilis WB600/P43-SjLys 和 B. subtilis
WB600 活化培养，约 14-16 h。按 1% 的接种量将菌
种扩大培养。根据菌体的生长曲线，选取不同培养
时间 24、36 、 48 和 60 h 的发酵液，离心收集菌体。
SjLys 蛋白含有 125 个氨基酸残基，蛋白分子量约为
14.14 kD。SDS-PAGE 结果（图 5-B）显示，与对照
B. subtilis WB600 相 比，B. subtilis WB600/P43-SjLys
培养 36 h 后的样品，在 14.3 kD 附近隐约多出一条
特异性蛋白带，其分子量与 SjLys 类似，这表明 B.
subtilis WB600/P43-SjLys 已经开始表达 SjLys 蛋白（图
5-B，lane 4）。条带颜色很浅，说明 SjLys 蛋白浓度
较低。培养 48 h 后的样品，条带的颜色加深，SjLys
蛋白的表达量有所增加（图 5-B，lane 5）；至 60 h 时，
目的条带颜色明显加深，表明 SjLys 蛋白的表达量
增多（图 5-B，lane 6）。上述结果表明，SjLys 蛋白
在宿主中得到可溶表达。
2.4 检测抑菌活性
培养 60 h 菌体，超声破碎后取上清液，用滤纸
片法检测抑菌活性。结果（图 6）表明，与空宿主
B. subtilis WB600 微弱的抑菌活性相比较，B. subtilis
WB600/P43-SjLys 破碎、离心后的上清液对指示菌
金黄色葡萄球菌和溶壁微球菌均有明显的抑菌作用。
表 明 B. subtilis WB600/P43-SjLys 能 够 表 达 可 溶 的，
具有生物学功能即抑菌活性的 SjLys 蛋白。
3 讨论
3.1 SjLys表达宿主的选择
目前，体外得到的具有活性的 SjLys 蛋白，几
乎全部来自于 E. coli 表达系统［5-7］。但是，SjLys 蛋
白如果不结合融合标签（Trx），在宿主体内几乎均
以包涵体形式存在［6，7］。对于 E. coli 的部分表达系
统，若外源蛋白编码序列中含有稀有密码子，则会
造成表达量低，或者翻译提前终止。由于 SjLys 蛋
白的 cDNA 上存在 7 个稀有密码子，因此表达宿主
只能局限在 E. coli Rosetta 系列，如 Rosetta-（DE3）
pLysS 和 Rosetta-GamiB（DE3）pLysS［6］。
与大肠杆菌系统相比，新兴的 B. subtilis 表达
系统没有明显的密码子偏爱性，表达产物也不容易
形成包涵体［10，11］。选择更加合理的新宿主，对于
A
B
36
B. subtilis WB600
B. subtilis WB600/P43-SjLys
48
th 60 72 8424120
0
2
4
6
8
A
60
0
116.0
kD 1 2 4 5M 3
97.2
66.4
44.3
29.0
20.1
14.3
6.5
SjLys
M ：protein marker ；1 ：转化子 B. subtilis WB600/P43-SjLys 培养 24 h，细胞破
碎后的上清液 ；2 ：转化子培养 36 h，细胞破碎后的上清液 ；3 ：转化子培
养 48 h，细胞破碎后的上清液 ；4 ：转化子培养 60 h，细胞破碎后的上清液 ；
5 ：对照空白菌株 B. subtilis WB600 培养 60 h，细胞破碎后的上清液 .
图 5 菌株 B. subtilis WB600 和 B. subtilis WB600/P43-SjL-
ys 生长曲线（A）及 SDS-PAGE 检测蛋白表达（B）
A B
21
S. aureus M. lysodeikticus5 mm
21
A ：指示菌为金黄色葡萄球菌，1 ：对照菌 B. subtilis WB600，2 ：B. subtilis
WB600/P43-SjLys ；B ：指示菌为溶壁微球菌
图 6 转化子 B. subtilis WB600/P43-SjLys 和阴性对照
WB600 细胞破碎后的上清液抑菌活性的检测
2014年第4期 145李丹等 ：海参溶菌酶基因在枯草芽孢杆菌 WB600 中的整合及表达
SjLys 蛋白的外源可溶表达具有重要的作用，因此本
研究将选取 B. subtilis WB600 作为 SjLys 蛋白的表达
宿主。但是，作为基因工程宿主菌，B. subtilis 在滚
环复制过程中产生大量 λ 噬菌体的单链 DNA，细胞
分裂时这些单链 DNA 就会引起质粒丢失，因此很
难维持胞内质粒的稳定传代。本研究利用整合质粒
pDG1730，将 SjLys 基因通过同源双交换重组整合到
B. subtilis WB600 的染色体上。一方面，能维持外源
基因的连续传代，避免由于质粒丢失而出现蛋白表
达不稳定的情况；另一方面，也能减少抗生素的使用，
避免相应的食品安全问题［14］。
3.2 SjLys表达量的优化
从上述试验发现，SjLys 蛋白的表达量还不足以
实现海参溶菌酶的外源高效、可溶表达。后续的工
作将需要优化表达体系，提高 SjLys 蛋白的表达量。
研究已经表明，在 B. subtilis 中外源蛋白和启
动子之间存在有适配性的问题，启动子是外源基因
表达的重要元件，对蛋白的表达具有重要影响。B.
subtilis 已知的 σ 因子有 12 种，分别识别不同的启动
子序列。在以 B. subtilis WB600 作为宿主菌来表达
外源蛋白的研究中，使用较多的启动子有组成型表
达的双启动子 P43［15-19］、需要蔗糖诱导表达的果聚
糖蔗糖酶基因 SacB 的启动子［20，21］以及解淀粉芽孢
杆菌 α-淀粉酶基因的启动子［22］。本试验目前使用的
来源于枯草芽孢杆菌自身的强启动子 P43。为获得
更高的蛋白表达量，后续可以构建不同的启动子与
SjLys 的表达系统，检测启动子与 SjLys 蛋白的适配
性，比较蛋白的表达量以及抑菌活性，以期得到更
好的试验结果。但是，在 B. subtilis 中，蛋白的表达
量不仅和启动子有关，还与整合位点和整合剂量相
关，因此还需要进一步筛选、设计适合 SjLys 蛋白
与启动子之间的整合位点，尝试改变启动子与目的
序列之间的核苷酸数量以提高蛋白的表达水平。
4 结论
通过同源双交换重组，将海参溶菌酶基因整合
到 B. subtilis 基因组上，构建了海参溶菌酶蛋白的枯
草芽孢杆菌表达系统。在大肠杆菌原核表达系统之
外，首次成功地在体外获得了海参溶菌酶全长蛋白
的可溶表达，为生产海参溶菌酶后续的研究和开发
工作提供了一个新的途径。
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）