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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第5期
梨属于蔷薇科（Rosaceae），梨属（Pyrus L．）植
物［1］。全世界梨属植物约有 60 种，我国是梨属植
物的起源中心，蕴藏着丰富的种质资源，原产我国
的梨属植物现有 18 个种，7 个亚种，栽培品种约有
3 000 多个，栽培面积和总产量在国内主要水果中
均排第 3 位［2］。目前，随着我省农业产业结构的调
收稿日期 ：2012-01-10
基金项目 ：国家转基因生物新品种培育重大专项（2009ZX08003-017B），山西省财政支农项目基金项目（2011NYGX-05）
作者简介 ：毕红园，女，硕士研究生，研究方向 ：作物遗传育种 ；E-mail ：543876529@qq.com
通讯作者 : 孙毅，男，博士，研究方向 ：植物基因工程和分子生物学 ; E-mail ：sunyi692003@yahoo.com.cn
采用正交设计法优化梨 SSR-PCR 体系
毕红园1，2 王长彪2 段永红3 郭黄萍4 孙毅2，5
（1. 山西大学生物工程学院，太原 030006 ；2. 山西省农业科学院生物技术研究中心，太原 030031 ；3. 山西农业大学农学院，太谷 030801 ；
4. 山西农科院果树研究所，太谷 030815 ；5. 农业部黄土高原作物基因资源与种质创制重点实验室，太原 030031）
摘 要 : 为了建立适宜梨树 SSR-PCR 的反应体系和扩增程序，采用正交设计 L16（4
5）对影响梨树 SSR-PCR 反应体系的 5 个
因素（Taq 酶、Mg2+、模板 DNA、dNTP、引物）在 4 个水平上进行优化，PCR 结果用 DPS 数据处理软件分析，筛选出各反应因素
的最佳水平，建立了适用于梨树的 SSR 反应体系。在 10 μL 的反应体系中，模板 DNA 的用量为 50.0 ng，Taq DNA 聚合酶的用量为 1.4 U，
Mg2+ 的浓度为 2.0 mmol/L，dNTPs 浓度为 0.1 mmol/L，引物的浓度为 0.5 μmol/L。扩增程序为 ：94℃预变性 3 min ；94℃变性 1 min，
57℃（依引物不同而改变）退火 45 s，72℃ 1 min，35 个循环 ；72℃延伸 10 min。4℃保存。选用 24 个梨品种对该体系进行稳定性
验证，结果证明该体系可用于梨树 SSR 标记的研究。
关键词 : 梨 SSR 正交设计 PCR
Establishment and Optimization of the Pear SSR System of by
Orthogonal Design
Bi Hongyuan1，2 Wang Changbiao2 Duan Yonghong3 Guo Huangping4 Sun Yi2，5
（1. Biological Engineering Institute，Shanxi University，Taiyuan 030006 ；2. Biotechnology Research Center，Shanxi Academy of
Agricultural Sciences，Taiyuan 030031 ；3. College of Agronomy，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801 ；4. Pomology Institute，
Shanxi Academy of Agricultural Sciences，Taigu 030815 ；5. Key Laboratory of Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement on Loess
Plateau，Ministry of Agriculture，P.R.China，Taiyuan 030031）
Abstract: In order to establish and optimize the SSR-PCR amplification system for pear total DNA, an orthogonal design experiment
of 5 elements （Taq enzyme, Mg2+, template DNA, dNTP, primers）with 4 levels L16（4
5） was conducted. The PCR result was analyzed by the
software DPS to select the best levels of responsive factors and established the optimal SSR reaction system. The optimal SSR-PCR system of 10
μL volumes consists of template DNA 30.0 ng, Taq DNA polymerase 1.0 U, each primer 0.2 μmol/L, Mg2+ 2.0 mmol/L, and dNTPs 0.4 mmol/L.
PCR amplification procedures was ：pre-denaturation for 4 min at 94℃ , followed by 30 cycles of denaturation for 45 s at 94℃, anneal for 30 s
at 48℃, extension for 30 s at 72℃, the amplification was completed after extension for 10 min at 72℃, then stored at 4℃. Total DNA of 24 pear
varieties was tested to amplify SSR markers, which verified the robustness of the system.
Key words: Pear SSR Orthogonal design PCR
整，出现了一批自有知识产权的梨树新品种和新材
料，但由于市场混乱，现有的新品种得不到有效的
保护和鉴定，极大地损害了相关单位和个人的利益，
同时也阻碍了我省农业经济的大力发展。为此，进
行梨树品种间鉴定，保证品种的真实性和纯度，维
护生产者与育种者的利益就显得尤为重要。近年来，
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第5期112
迅速发展的 DNA 分子标记技术为优良品种的引进，
品种快速准确的鉴定和伪劣苗木的早期识别提供了
有效的手段。
已有学者选用不同的分子标记技术对梨开展了
研究。其中，SSR 标记（Simple Sequence Repeat）是
一种新兴的分子标记技术，可应用于遗传图谱的构
建、基因定位、亲缘关系分析和指纹图谱构建等领
域［3］。由于该标记分布于整个基因组，具有数量
丰富，等位变异高，共显性，检测简单，结果稳定
可靠等优点［4］，在品种鉴定等方面已到了广泛应
用［5-10］。虽然已有对梨品种进行分子标记研究的报
道，但尚未见报道关于梨 SSR-PCR 体系优化的研究，
并且由于不同的梨品种所要求的体系并不完全相同，
因而无法建立一个完整统一的模式。本次试验采用
正交设计 L16（4
5）方法对梨 SSR-PCR 反应体系的 5
因素（Taq DNA 聚合酶、Mg2+、模板 DNA、dNTPs、
引物的浓度）在 4 水平上进行优化，并对结果用
DPS 数据处理软件进行较为详细地分析，又用梨的
24 个品种对此体系进行检测，以期建立一个较为完
整可靠的梨属 SSR-PCR 反应体系，为梨品种鉴定和
新品种保护提供依分子生物学依据。
1 材料与方法
1.1 材料
“硕丰梨”品质优良、抗寒性较强，在我省冷凉
地区有较大的种植面积，因而本试验采用“硕丰梨”
作为试材。该品种叶片取自山西省农科院果树研究
所，采回后置于 -70℃冰箱备用。引物参照 NCBI
网站中梨属的 EST 序列，经 MISA 软件分析，并用
Primer3 软件设计获得梨属 SSR 标记引物，该引物由
上海生物工程有限公司合成。
1.2 方法
1.2.1 DNA 提取及浓度纯度检测 梨树总 DNA 提
取 采 用 改 良 的 CTAB 法［11］， 在 核 酸 蛋 白 检 测 仪
（SXABRC，eppendorf-Bio-photometer） 上 测 定 DNA
样本的浓度及纯度。用琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 的
质量。将 DNA 样品置于 -20℃下保存备用。
1.2.2 PCR 反应因素水平的确定与正交表的设计
在 PCR 反应中，Taq 聚合酶、Mg2+、dNTP、引物、
DNA 模板是影响反应的 5 个主要因素。为确定它们
在 PCR 反应中的最佳水平，针对这 5 个因素，每个
因素设 4 个水平，见表 1，采用正交设计 L16（4
5）
进行试验［12，13］。设计方案见表 2，设 3 次重复，共
48 个 PCR 管，按表中的数据加样 ；另外每管还加入
表 1 PCR 反应的因素和水平
因素
水平（体系终浓度）
1 2 3 4
Taq 聚合酶（U） 0.2 0.6 1.0 1.4
Mg2+（mmol/L） 1.0 1.5 2.0 2.5
dNTP（mmol/L） 0.1 0.2 0.3 0.4
引物（μmol/L） 0.2 0.3 0.4 0.5
DNA 模板（ng） 20 30 40 50
表 2 PCR 反应因素水平 L16 （45 ）正交试验设计
编号
因素及水平
Taq 酶 （U） Mg2+ （mmol/L） dNTP （mm/L） 引物 （μmol/L） DNA 模板 （ng）
1 0.2 1.0 0.1 0.2 20
2 0.2 1.5 0.2 0.3 30
3 0.2 2.0 0.3 0.4 40
4 0.2 2.5 0.4 0.5 50
5 0.6 1.0 0.2 0.4 50
6 0.6 1.5 0.1 0.5 40
7 0.6 2.0 0.4 0.2 30
8 0.6 2.5 0.3 0.3 20
9 1.0 1.0 0.3 0.5 30
10 1.0 1.5 0.4 0.4 20
11 1.0 2.0 0.1 0.3 50
12 1.0 2.5 0.2 0.2 40
13 1.4 1.0 0.4 0.3 40
14 1.4 1.5 0.3 0.2 50
15 1.4 2.0 0.2 0.5 20
16 1.4 2.5 0.1 0.4 30
2013年第5期 113毕红园等 ：采用正交设计法优化梨 SSR-PCR 体系
1 μL 的 10×PCR Buffer（终浓度为 1×PCR Buffer），
其余用 ddH2O 补足，反应体系总体积为 10 μL。
1.2.3 PCR 扩增及其产物的检测 PCR 扩增反应在
东胜创新生物科技有限公司的 EDC-810 型基因扩增
仪上进行。反应程序为 ：94℃预变性 3 min ；94℃变
性 1 min，57℃退火 45 s，72℃延伸 1 min，35 个循环；
72℃延伸 10 min，4℃保存。以上海生物工程有限公
司的 Marker 为对照，用 6% 的非变性聚丙烯酰胺凝
胶电泳检测，在北京六一仪器厂 DYCZ-30C 型电泳
仪上于 300 V 恒压下电泳 40 min，拆板后观测并拍
照分析。参照刘明珍、何正文等［14］的方法，依扩
增条带的敏感性和特异性进行计分，分数越高，表
示扩增带的敏感性、特异性越好。
1.2.4 最佳反应体系的验证 从梨属的 SSR 引物
中，随机选择 1 对引物，对梨属 24 个品种的 DNA
进行扩增，以验证优化的梨属 SSR-PCR 反应的稳
定性。
2 结果
2.1 DNA质量检测
SSR 标记虽然对 DNA 的质量要求不高，但如果
DNA 样品不纯则会影响 PCR 反应，使试验结果不稳
定。本试验采用改良的 CTAB 法提取梨属 DNA，所
提 DNA 无色透明，可溶性好。用核酸检测仪检测
DNA 溶液纯度和浓度，经琼脂糖凝胶电泳（0.8%）
检测 DNA 的质量，观察到条带清晰且无降解，说明
提取的 DNA 质量高，完整性好，可用于 SSR 分析
（图 1）。
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
2000
bp
1000
750
500
图 1 24 个梨品种的 DNA 电泳图
2.2 PCR扩增结果直观分析
2.2.1 梨 SSR 反应体系的优化设计及扩增结果 按
照表 2 正交设计的 16 个处理组合，进行 PCR 反应
和电泳检测，结果见图 2。结果表明，5 种反应因
素浓度组合不同，其扩增的效果也不一。唯一相同
的是 16 个处理组合都没有扩增出分子量小于 100 bp
的引物二聚体。其中 2、8、14 号处理组合扩增效果
较差，条带不清晰且不易观察 ；6、15、16 号处理
组合扩增的条带目的条带多且容易观察。根据图片，
结合遗传多样性分析的要求，将 16 个处理组合分别
进行打分，即将条带数量丰富、清晰度高、背景低
的扩增产物记为 16 分，而最差的记为 1 分。由图中
1-16 处理组合可知，条带数量最丰富且清晰的是 6
号处理组合，赋值为 16，几乎无条带的 13 号处理
赋值为 1。按此方法对 16 个处理组合分别计分为 4、3、
12、13、10、16、5、2、6、7、8、9、1、11、15、
14，并对不同因素与水平的电泳评分平均值和极差
进行计算分析，结果如表 3 所示。
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
700
bp
500
400
300
200
150
图 2 正交体系凝胶电泳图
极差 R 值的大小表明各因素影响程度的高低，
R 越大，说明该因素对结果影响越大。因此，该体
系中对结果影响的大小顺序是引物、Mg2+、dNTP、
DNA 模板、Taq 聚合酶。其中，每一因素各水平均
值大小 K，反映了各因素不同水平对反应体系的影
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第5期114
响情况，均值越大说明反应水平越好。
2.2.2 各因素浓度对梨 PCR 反应结果的影响 由表
3 可看出，Taq DNA 聚合酶浓度处理组合中平均分
数最低的是水平 3，即 Taq DNA 聚合酶浓度为 1.0 U
时平均分值仅为 7.500 分 ；而平均分数最高的是水
平 4，即 Taq DNA 聚合酶浓度为 1.4 U 时平均分值
最高为 10.250 分，说明 1.4 U Taq DNA 聚合酶浓度
为梨 PCR 反应的适宜浓度。Mg2+ 处理组合中平均分
数最低的是水平 1，即 Mg2+ 浓度为 1.0 mmol/L 时平
均分值为 5.250 分 ；而分数最高的是水平 3，即 Mg2+
浓度为 2.0 mmol/L 时平均分值最高为 10.00 分，说
明 2.0 mmol/L Mg2+ 浓度为梨 PCR 反应的适宜浓度。
同理可得出 dNTP 最优浓度为 0.1 mmol/L、引物最优
浓度为 0.5 μmol/L、DNA 模板最优浓度为 50 ng。
2.3 最佳反应体系稳定性检测
应用上述正交试验所获得的最佳反应体系，用
1 对引物对梨属 24 个品种的 DNA 进行扩增，结果
如图 3 显示，每份 DNA 样品均能扩增出清晰的目的
条带。说明该体系比较稳定，适用于梨属植物遗传
多样性的 SSR 标记研究。
水平
因素
Taq 酶 （U） Mg2+ （mmol/L） dNTP （mmol/L） 引物 （μmol/L） 模板 DNA （ng）
K1 8.000 5.250 10.500 7.250 7.000
K2 8.250 9.250 9.250 3.500 7.000
K3 7.500 10.000 7.750 10.750 9.500
K4 10.250 9.500 6.500 12.500 10.500
极差 R 2.250 4.750 4.000 9.000 3.500
表 3 正交设计直观分析
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
550
bp
400
350
200
100
90
图 3 最佳体系的 24 个梨品种电泳图
3 讨论
为了对梨进行遗传多样性研究，需要获得高质
量的 DNA。而梨的叶片中也存在大量的糖、酚类等
物质，因而用传统的 CTAB 法所提取的梨 DNA 质量
效果不太好，改良后的 CTAB 法可将细胞中的多糖，
多酚去除，效果较好。
SSR 分子标记技术以其便捷可操作性高，重复
性高等优点，近年来在植物的种质鉴定、遗传多样
性检测、亲缘关系分析和遗传图谱构建等方面得到
广泛应用。但 SSR-PCR 反应体系同样受到 dNTPs、
Taq DNA 聚合酶、引物、DNA 模板用量等因素的影
响，例如，模板浓度过低会导致结果不稳定及条带
模糊 ；浓度过高时引物与 dNTPs 过早耗尽，结果也
不稳定。引物浓度偏高会引起碱基错配和非特异性
产物的产生，形成引物二聚体。而 Taq 酶的浓度过
高不仅增加试验成本，而且极易产生非特异性扩增
产物 ；浓度过低则会导致产物的合成效率下降［15］。
同 时，Taq DNA 聚 合 酶 是 Mg2+ 依 赖 性 酶， 对 Mg2+
浓度非常敏感。并且 dNTP 分子中的磷酸基团能定
量地与 Mg2+ 结合，使游离的 Mg2+ 浓度降低［16］。因
2013年第5期 115毕红园等 ：采用正交设计法优化梨 SSR-PCR 体系
而确定其最优体系，对 PCR 反应是否成功、所得的
结果是否准确，以及 PCR 的扩增效率都有重要的影
响［17］。
传统的单因素试验筛选反应体系，需要进行多
次的梯度试验，试验繁琐 ［18］，但是正交试验因在减
少试验规模的同时又不损失信息，能更加快速找到
最优组合［19］，同时也可借助于数学上的统计分析方
法对试验结果进行分析与处理，获得可靠的结论，
使分析结果更科学、完善和简便。不过不能忽视的
是该方法也有不足，对照图片进行打分法，存在一
定的主观性，因而也需要有进一步的改进。
4 结论
最终确立梨 SSR-PCR 最佳的反应体系（10 μL）
为 ：1.0 μL 10×PCR Buffer、Taq DNA 聚合酶 1.4 U、
Mg2+ 2.0 mmol/L、DNA 模板 50 ng、dNTPs 0.1 mmol/L、
引 物 0.5 μmol/L。 扩 增 程 序 ：94 ℃ 预 变 性 3 min ；
94℃变性 1 min，57℃退火 45 s，72℃延伸 1 min，
35 个循环 ；72℃延伸 10 min，4℃保存。用此反应
体系和扩增程序在 24 份梨品种材料中获得的结果清
晰稳定，重复性好。因而初步确定此反应体系可用
于梨属植物的 PCR 扩增分析。
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（责任编辑 李楠）