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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第10期
虎 杖（Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc.） 是
蓼科多年生草本植物，根或根茎入药，是重要的白
藜芦醇药源植物之一。白藜芦醇及其糖苷具有抗肿
瘤、抗衰老、保护心血管系统等广泛的生物学功
能［1-3］。 白 藜 芦 醇 合 酶（Resveratrol synthase，RS）
是白藜芦醇生物合成途径中的关键酶之一，在花生
收稿日期 ：2014-01-03
基金项目 ：长江大学博士启动基金项目（801100010122），广东省自然科学基金项目（10151001002000012）
作者简介 ：柳忠玉，女，博士，讲师，研究方向 ：生物制药 ；E-mail ：zyliu2004@126.com
通讯作者 ：赵树进，教授，博士生导师，研究方向 ：生物制药 ；E-mail ：gzzsjzhs@163.com
转 PcRS 基因拟南芥的抗炭疽病研究
柳忠玉1  赵树进2
（1. 长江大学生命科学学院，荆州 434025 ；2. 广州军区广州总医院，广州 510010）
摘 要 ： 为确定虎杖（Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc.）白藜芦醇合酶基因 PcRS（Polygonum cuspidatum resveratrol synth-
ase）提高植物抗病性的有效性，以转 PcRS 基因拟南芥为材料，对其进行了分子鉴定和抗炭疽病（Colletotrichum higginsianum）研究。
利用 Southern blot 和 Northern blot 验证了外源 PcRS 基因在转基因拟南芥基因组中的整合和表达。对经过选育得到的 T3 代纯合株系
进行离体的抗病性试验。转基因拟南芥甲醇提取物对炭疽病菌具有明显抑制作用。进一步采用点滴法接种生长 4 周的转基因拟南
芥离体叶片，与野生型植株相比，转基因植株叶片坏死斑直径和坏死斑上的孢子数目都显著减少，表明转基因拟南芥通过抑制孢
子的繁殖来限制炭疽病菌的定植，从而提高转基因植株对炭疽病的抗性。
关键词 ： 虎杖 白藜芦醇合酶 转基因拟南芥 炭疽菌 抗病性
Studies on the Resistance of Transgenic Arabidopsis Overexpressing
PcRS to Colletotrichum higginsianum
Liu Zhongyu1 Zhao Shujin2
（1. College of Life Sciences，Yangtze University，Jingzhou 434025 ；2. General Hospital of Guangzhou Military Command，
Guangzhou 510010）
Abstract: In order to reveal the effectiveness of Polygonum cuspidatum resveratrol synthase（PcRS）gene in increasing tolerance to
pathogenic microorganisms in foreign species, the PcRS transgenic Arabidopsis was used as material to identify its molecular characterization
and study its resistance to Colletotrichum higginsianum. Integration and expression of transgene in the genome of Arabidopsis was confirmed
by Southern blot and Northern blot analyses. Independent homozygous transgenic Arabidopsis lines with genetical stability were obtained after
the selection of T3 progenies and tested in vitro for disease resistance to C. higginsianum. Agar-plate bioassays were used to test the extracts
of transgenic Arabidopsis for antifungal activity against C. higginsianum. Results showed that the mycelial growth of C. higginsianum was
greatly inhibited. Then the detached leaves of 4-week-old Arabidopsis plants were used to inoculate. The lesion diameter and spore production
significantly reduced on transgenic Arabidopsis. Overexpression of PcRS in transgenic Arabidopsis could restrict colonization of C. higginsianum
by inhibition of spore production, resulting in enhanced resistance against C. higginsianum.
Key words: Polygonum cuspidatum Resveratrol synthase Transgenic Arabidopsis Colletotrichum higginsianum Disease resistance
（Arachis hypogaea L.）、 葡 萄（Vitis vinifera L.）、 大
黄（Rheum tataricum L.）、高粱（Sorghum bicolor L.）、
川鄂爬山虎（Parthenocissus henryana （Hemsl.）Diels
et Gilg）中的白藜芦醇合酶基因相继被克隆［4-7］。基
因组测序显示，葡萄中的白藜芦醇合酶基因以基因
家族的形式存在，白藜芦醇合酶基因高达 43 个，其
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第10期108
中 20 个已经被表达［8］。
现 有 的 研 究 表 明， 白 藜 芦 醇 合 酶 基 因 在 提
高植物抗病性或改良作物品质方面有良好的应用
前 景。 来 源 于 花 生 的 白 藜 芦 醇 合 酶 基 因 导 入 苜
蓿（Medicago sativa L.）， 可 提 高 苜 蓿 对 茎 点 霉 病
（Phoma medicaginis）的抗性［9］；该基因转入地黄
（Rehmannia glutinosa L.），则增强了地黄对尖孢镰刀
菌（Fusarium oxysporum）的抗性［4］。将葡萄的白藜
芦醇合酶基因导入小麦，增强了转基因小麦对叶锈
病（Puccinia recondite）和颖枯病（Septoria nodorum）
的抗性［10］；该基因导入番木瓜后，转基因的番木
瓜增强了对疫霉菌（Phytophthora palmivora）的抗
性［11］。但是，有些植物过量表达白藜芦醇合酶基
因后，虽然体内积累了白藜芦醇或白藜芦醇苷，然
而对病原菌的抗性并没有提高。例如，在转基因猕
猴桃中白藜芦醇苷含量达 182 μg/g 鲜重，但对灰霉
菌（Botrytis cinerea）的抗性没有提高［12］；转基因白
杨的白藜芦醇苷含量高达 615.2 μg/g 鲜重，但对叶
锈病（Melampsora pulcherrima）的抗性没有改变［13］。
目前，白藜芦醇合酶基因增强植物抗病性的机理尚
不清楚，白藜芦醇合酶基因家族成员的多样性使得
其作用机制更为复杂。
本实验室前期已克隆了虎杖的白藜芦醇合酶基
因 PcRS（Polygonum cuspidatum resveratrol synthase），
构建了植物表达载体 pCAMBIA1380-35S-PcRS，通
过转基因获得了表达 PcRS 的拟南芥 T1 代，研究证
实过量表达 PcRS 可促进转基因拟南芥中白藜芦醇苷
的合成［14］。但 PcRS 基因过量表达能否提高植物抗
病性尚不清楚。
本研究以转基因拟南芥 T1 为材料，连续多代种
植。对筛选得到的 T3 代纯合株系，通过体外抑菌活
性检测和离体抗病性试验进行抗炭疽病研究，旨在
为进一步剖析 PcRS 基因在防御应答炭疽病侵染过程
中的分子机制奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料 以野生型拟南芥为受体，利用重
组表达载体 pCAMBIA1380-35S-PcRS 进行转化，所
得到的转基因拟南芥 T1 代，由本实验室培育。
1.1.2 菌株 供试病原真菌炭疽病菌（Colletotrichum
higginsianum） 由 华 南 农 业 大 学 植 物 病 理 实 验 室
提供。
1.2 方法
1.2.1 转基因植株的 Southern 杂交 对经潮霉素抗
性筛选为阳性的植株进行 Southern 杂交检测。取
10 μg 基因组 DNA，经 EcoR I 酶切 DNA。以引物 P1
（5-CCGGTACCATGGCAGCTTCAACTGAAG-3）和
P2（5-CCGGATCCTTAAATGATGGGCACACTTC-3）
扩增 PcRS 基因作为探针模板，探针标记、杂交及检
测参照作者已经建立的方法［14］进行。
1.2.2 转基因植株的 Northern 杂交检测 提取拟南
芥叶片总 RNA，用甲醛变性凝胶进行电泳，之后
将凝胶中的 RNA 转移至尼龙膜上，交联 5 min 固定
RNA。以上述引物 P1 和 P2 扩增的 PcRS 基因作为
探针模板，探针标记、杂交及检测参照作者已经建
立的方法［14］进行。
1.2.3 转基因植株甲醇提取物的体外抑菌试验 生
长速率法测定植物甲醇提取物的抑菌活性，参照文
献［15］方法进行，所有器皿及试剂均无菌。选取
生长状态一致的转基因及野生植株叶片，置于电热
恒温干燥箱中以 50℃烘干并粉碎。称取一定重量
的植物材料干粉，加入 10 倍体积（V/W）的甲醇，
置于避光阴凉处，每次浸提持续 24 h，重复浸提 3
次，合并浸提液，旋转蒸发仪减压浓缩至质量浓度
为 1 g/mL。在无菌条件下，配制提取物干粉浓度为
100 mg/mL 的水溶液，用移液枪吸取 1 mL 到装有 9
mL 已融化 PDA 培养基（温度约 60℃）的三角瓶中，
充分摇匀，再倒入 90 mm 的培养皿中制成质量浓度
为 10 mg/mL 的含药培养基平板，接种炭疽菌菌饼
（Φ=5.0 mm）。每处理重复 3 次。28℃培养 7 d，再
用十字交叉法测量菌落直径，计算抑菌率。
抑菌率（%）=［（对照菌落直径-0.5）-（处理
菌落直径-0.5）］/（对照菌落直径-0.5）×100%
1.2.4 转基因拟南芥的离体抗病性鉴定 将炭疽菌
接种在 PDA 上于 28℃培养 7 d，挑取黄色孢子团悬
浮于无菌水中，制备 105-106 个孢子 / mL 的孢子悬
浮液。采用点滴法接种鉴定抗病性，将生长 4 周的
拟南芥叶片剪下，用灭菌水清洗 3 次，分别置于垫
2014年第10期 109柳忠玉等：转 PcRS基因拟南芥的抗炭疽病研究
有滤纸保湿的容器中，再滴加 10 μL 孢子悬浮液于
离体叶片上，28℃、相对湿度 95% 以上的培养箱培
养 7 d 后，测定坏死斑直径。以野生型拟南芥为对照，
重复 3 次。参照文献［16］方法测定坏死斑内孢子
的数目。结果数据用 SPSS19 进行统计分析。
2 结果
2.1 PcRS基因的整合与表达
经过潮霉素抗性筛选得到转基因拟南芥 T1 代株
系 L3、L4、L5、L6、L7、L8 和 L15。提取叶片的基
因组 DNA，经过 EcoR I 完全酶切，以 PcRS 基因特
异片段为探针，并通过 Southern blot 方法检测 PcRS
在植物基因组中的整合情况。杂交结果表明，所检
测的 7 个转基因株系中，全部都有明显的杂交信号，
而野生型拟南芥无任何杂交信号，表明外源 T-DNA
（图 1-A）已经整合到转基因拟南芥的基因组中。外
源 PcRS 基因拷贝数介于 1-7 之间，其中转基因拟南
芥株系 L4、L6 和 L15 为单拷贝整合，株系 L3、L5、
L7 和 L8 为多拷贝整合，其中株系 L8 的拷贝数最高
（图 1-B）。
为了分析外源基因 PcRS 在转基因植株中的表
达情况，分别提取拟南芥植株叶片的总 RNA，进行
Northern blot 分析。结果（图 1-C）显示，野生型拟
南芥植株无任何杂交信号 ；外源基因 PcRS 在转基
因拟南芥株系 L4、L5、L6、L7 和 L15 中均有表达，
但是高拷贝整合株系 L3、L8 无任何杂交信号，说明
外源基因 PcRS 在株系 L3 和 L8 中发生基因沉默。
选取单拷贝转基因株系 L4 和 L6 连续 2 代种植，
筛选得到稳定遗传的 T3 代纯合子株系，以 T3 代纯
合子株系为材料进行后续的抗病性试验。
2.2 转基因拟南芥甲醇提取物抑菌活性测定
为了验证 PcRS 基因的过量表达是否能提高拟
南芥对炭疽病的抗性，将炭疽病菌接种在含不同株
系甲醇提取物的 PDA 培养基上，培养 7 d 后发现，
在含野生植株甲醇提取物的 PDA 培养基上，菌落直
径较大，而在含转基因植株甲醇提取物的 PDA 培养
基上菌落直径明显减小（图 2-A）。从抑制率来看（图
2-B），在 10 mg/mL 的浓度下，两个转基因株系甲
醇提取物对炭疽病菌均有抑制作用，平均抑菌率分
别达到 55.2% 和 50.3%，二者的抑菌率无显著差异。
结果初步证明，在体外抑菌试验中过量表达 PcRS 基
因的拟南芥可以较好地抑制炭疽病菌的生长。
polyA
LB
WT L3 L4 L5 L6 L7 L8 L15
WT
PcRS
rRNA
L3 L4 L5 L6 L7 L8 L15
A
B
C
EcoR I BamH I Bgl II RB
polyA HPTII CaMV35S CaMV35S PcRS polyA
A ：载体 pCAMBIA1380-35S-PcRS 的 T-DNA 区 ；B ：Southern blot 分析转基
因拷贝数 ；C ：Northern blot 分析 PcRS 基因的表达 ；WT ：野生型拟南芥 ；
L3-L8，L15 ：转基因拟南芥
图 1 转基因拟南芥中 PcRS 基因的整合与表达鉴定
WT L4 L6
WT
20
0
ᣁࡦ⦷% 406080 a a100
L4 L6
A
B
A ：转基因拟南芥甲醇提取物对炭疽病的体外抑菌效果 ；B ：转基因拟南芥
甲醇提取物对炭疽病的抑制率；WT：野生型拟南芥；L4，L6：转基因拟南芥。
小写字母 a 为差异显著（P<0.05）
图 2 转基因植株体外抑菌试验
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第10期110
2.3 转基因拟南芥离体叶片对炭疽病的抗性
在抗病性鉴定试验中，采用点滴法接种转基因
拟南芥的离体叶片，以野生型拟南芥为对照。野生
型拟南芥离体叶片接种炭疽病菌孢子悬浮液后，第
3 天叶片开始失绿并出现坏死点，7 d 后叶片发黄并
且形成大的坏死斑。而转基因拟南芥叶片失绿不明
显，7 d 后出现较小的坏死斑。分析接种后 7 d 的叶
片坏死斑直径。结果（图 3-A，图 3-B）显示，转基
因拟南芥株系 L4 和 L6 在接种 7 d 后，坏死斑直径
的平均值显著小于野生型拟南芥，L4 和 L6 之间的
差异不显著。
进一步统计坏死斑内炭疽病菌的孢子数目，与
野生型植株相比，转基因植株叶片坏死斑上的孢子
数目显著减少（图 3-C）。这表明转基因拟南芥通过
抑制孢子的繁殖来限制炭疽病菌的定植，从而提高
转基因植株对炭疽病的抗性。说明 PcRS 基因的超表
达增强了转基因拟南芥对炭疽病菌的抗性。
3 讨论
有研究认为转基因植株中基因的整合拷贝数与
表达无明显相关性［11，12］。另一些研究则表明，外源
基因的整合拷贝数与表达呈正相关［17］。还有一些研
究认为，外源基因整合和表达呈负相关，基因的整
合拷贝数越多，基因表达量越低［18］；有时候甚至发
生基因沉默现象，例如，Giorcelli 等［13］将葡萄 StSy
基因转入白杨，高拷贝整合的白杨株系中检测不到
外源基因的表达，发生了基因沉默。本研究也得到
类似的现象，转基因拟南芥株系 L3 和 L8，外源基
因整合拷贝数分别是 5 和 7，但 Northern 分析未能
检测到 PcRS 基因的表达，表现为基因沉默。所以外
源基因整合和表达相关性的研究仍然存在争议，还
需要更深入的研究。
已有研究报道白藜芦醇合酶基因能够在外源植
物中有效表达，从而提高对病原菌的抗性［9-11］，这
些研究中所使用的白藜芦醇合酶基因多来自于葡萄
和花生。本研究首次针对来源虎杖的白藜芦醇合酶
基因 PcRS 进行了抗病性研究，通过体外抑菌活性检
测和离体抗病性试验，证明了该基因能有效地提高
转基因拟南芥炭疽病抗性，这暗示着 PcRS 基因在植
物抗病基因工程中具有潜在应用价值。有研究表明，
转基因植株接种不同种类病原菌时，表现出抗性并
不一致。例如，Serazetdinova 等［19］报道转 Vst1 基因
小麦对颖枯病的抗病率为 42%，而对叶锈病的抗病
率为 19% ；葡萄的 Vst1 基因导入番木瓜后，增强了
番木瓜对根腐病（Phytophthora palmivora）的抗病性，
但是对炭疽病（Colletotricum gloeosporiodes）的抗性
却没有提高［11］。所以后续工作还需考察转 PcRS 基
因拟南芥对其他种类病原真菌的抗性，以确定 PcRS
基因的抗性谱，以期为植物抗病基因工程提供新的
基因资源。
现已证明，多个信号组分参与了植物的诱导性
防卫过程。病原菌能成功侵染并引起植物发病就必
需绕过抗病信号途径。在植物抵御病原菌侵入的过
程中，植物防卫反应受到乙烯（Ethylene，ET）、水
杨 酸（Salicylic acid，SA）、 茉 莉 酸（Jasmonic acid，
B
C
A
a
a
b b
L6WT L4
L6WT
0
1
2
3
4
5
6
7ൿ↫ᯁⴤᖴmm
L4
0
1000
2000ൿ↫ᯁ޵ᆒᆀᮠⴞ 300040005000
b b
A ：坏死斑形态 ；B ：坏死斑直径 ；C ：坏死斑上的孢子数目 ；WT ：野生型
拟南芥 ；L4，L6 ：转基因拟南芥 ；小写字母 a 和 b 为差异显著（P<0.05）
图 3 转基因植株离体叶片对炭疽病的抗性测定
2014年第10期 111柳忠玉等：转 PcRS基因拟南芥的抗炭疽病研究
JA）等的关键信号分子的调控。例如，乙烯是植
物与病原物互作中的一个重要的信号分子，是植物
基础抗性所必需的，同时它也能诱导植物的抗病反
应。虽然植物细胞中白藜芦醇生物合成的信号调控
机制还不清楚，但相关研究表明胁迫激素，如乙
稀、水杨酸、茉莉酮酸等确实能诱导 RS mRNA 在
葡萄［20，21］或花生［22］叶片中累积。在拟南芥中防
卫反应中，受 SA 信号调控的抗性相关基因有 PR1
（Pathogenesis-related protein）、PR2（b-1.3-glucanase）
和 PR5（Thaumatin-like）等［23］。受 ET、JA 信号调
控 的 抗 性 相 关 基 因 有 PDF1.2（Plant defensin 1.2）、
PR3（basic chitinase） 和 PR4（chitinase type I and
II）［24］。我们推测转基因拟南芥增强了炭疽病抗性 ：
一方面可能是由于外源 PcRS 基因的组成型表达直接
导致抗病性增强 ；另一方面可能是外源 PcRS 基因与
拟南芥自身防御基因发生了直接或间接的互作，激
发了更强的抗病反应。所以后续试验可开展对 PR1、
PR2、PR5、PDF1.2、PR3 和 PR4 等相关基因表达分析，
探讨其协同抗病机制。
4 结论
本研究以转 PcRS 基因拟南芥为材料，对其进
行了分子鉴定和抗炭疽病研究。体外抑菌试验和离
体抗病性检测结果表明，PcRS 基因过量表达可提高
转基因拟南芥对炭疽病的抗性。
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（责任编辑 马鑫）