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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(3):161-164
纳豆作为一种日本传统食物已有上千年的历史，
是大豆经枯草芽孢杆菌发酵而来。纳豆中含有纳豆
激酶，是具有强力的纤维蛋白溶解特性一种酶类［1］。
利用其特性可以开发相关的抗血栓症药物。血栓则
是由血小板和纤维蛋白聚集形成的，有效的血栓溶
解剂能切开血栓上纤维蛋白凝块，如纤溶酶。纳豆
激酶属于枯草杆菌丝氨酸蛋白酶，其溶血栓活性是
纤溶酶的 4 倍［2］。研究显示纳豆激酶可在体外将血
栓水解，间接地将血纤维蛋白溶酶原转化为血纤维
蛋白溶酶，使纤维蛋白凝块水解，通过抑制血小板
的凝聚和血栓的形成从而改善血流［3］。Xu 等［4］使
用不同剂量的纳豆激酶处理血栓小鼠，发现纳豆激
酶对血栓还具有体内活性。
纳豆激酶不仅可以直接溶解交联状的血栓，还
可以催化血纤维蛋白溶酶原转化为有活性的血纤维
蛋白溶酶，增加体内血栓溶解因子，诸如 t-PA 的合
成，失活纤维蛋白溶酶抑制剂（PAI-1）等，在体内
具有增强的血栓溶解活性［5］；与临床药物相比，具
有纤溶活性高、无毒副作用、半衰期长、生产成本
低廉等优点［6，7］。Fadl 等［8］发现纳豆激酶对缓解阿
收稿日期 ：2014-09-05
基金项目 ：中国农业科学院科技经费项目（201211），公益性行业（农业）科研专项经费项目（201303080）
作者简介 ：赵仲麟，男，博士，副教授，研究方向 ：化学生物学、环境微生物 ；E-mail ：rayzzl@163.com
通讯作者 ：李淑英，女，博士，助研，研究方向 ：微生物生化与分子生物学 ；E-mail ：lishuying@caas. cn
纳豆激酶生产菌的筛选及发酵纳豆特性研究
赵仲麟1  李淑英2  聂莹2  李燕3  袁超1  唐选明2
（1. 河南农业大学理学院，郑州 450002 ；2. 中国农业科学院农产品加工研究所，北京 100193 ；
3. 郑州轻工业学院食品与生物工程学院，郑州 450002）
摘 要 ： 为开发具有特定生理活性的新型纳豆保健品，从发酵豆制品中分离筛选得到一株纳豆激酶高产菌株。利用该菌株
以及市售的 3 种纳豆中的纳豆菌进行纳豆发酵，比较了 4 株纳豆菌发酵纳豆的特性，并对纳豆激酶活性进行分析。结果表明 5 号
菌株发酵生产纳豆周期短，颜色金黄，具有酱香味，拉丝长度最佳。同时，对产纳豆激酶的最佳发酵时间进行研究，结果表明发
酵至 17 h 纳豆激酶活性达到最大值。
关键词 ： 纳豆激酶 ；筛选 ；酶活 ；特性
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.04.023
Screening of Nattokinase Producing Strain and Characterazation of
Nattokinase
Zhao Zhonglin1 Li Shuying2 Nie Ying2 Li Yan3 Yuan Chao1 Tang Xuanming2
（1. College of Sciences，Henan Agricultural University，Zhengzhou 450002 ；2. Institute of Agro-products Processing Science and Technology，
Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193 ；3. School of Food and Biological Engineering，Zhengzhou University of Light
Industry，Zhengzhou 450002）
Abstract: To develop new kinds of natto health care products with specific physiological activity, a nattokinase high-yield strain was
isolated and used for natto production. The characteristics and nattokinase activities of the isolated strain were compared with other 3 kinds of
natto strains. Results showed that the natto products of munber 5 strain have golden color and soy sauce flavor, and have the best length of natto
wire drawing. The result of fermentation time showed that nattokinase content reached the maximum value at 17 h.
Key words: nattokinase ；screen ；enzyme activity ；characteristic
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.3162
尔茨海默病也有一定帮助。因此，纳豆是一种潜在
的、可以开发为一种预防和治疗心脑血管疾病的功
能食品［9］。本研究对纳豆激酶生产菌进行了分离筛
选，并将得到的高产菌株到与其他 3 种市售纳豆菌
进行纳豆发酵，对产品的感官和纳豆激酶酶活进行
比较，以期为纳豆激酶生产菌株的生产应用及潜在
的市场应用价值进行评估。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样品 市售及民间豆酱、豆豉等各种发酵豆
制品，均购买于超市。
1.1.2 试剂 纤维蛋白原（牛血，批号 ：140626-
201009）、尿激酶标准品（1280 U/ 支）和凝血酶（560
U/ 支）均购于中国药品生物制品检定所 ；LB Broth
Ultrapure（USB），胰蛋白胨（OXOID），酪蛋白（Sigma），
其余试剂均为国产分析纯。
1.1.3 培养基 筛选培养基为酪蛋白平板培养基，
具体配方：酪蛋白 1%、酵母提取物 0.5%、NaCl 0.9%、
琼脂 2%，pH7.2-7.4，121℃灭菌 20 min，现配现用。
种子和液体发酵培养基 ：LB 培养基，酪蛋白 1%、
酵 母 提 取 物 0.5%、NaCl 1%，pH7.0，121℃ 灭 菌
20 min。
1.2 方法
1.2.1 纳豆激酶生产菌株筛选 取 5 g 发酵豆制品，
放入装有 20 mL 无菌生理盐水和 10 余颗玻璃珠的
三角瓶中，每隔 10 min 振荡 1 次，室温下浸提 1 h，
3 000 r/min 离心 5 min，制得菌悬液 ；85℃热处理 30
min，生理盐水倍比稀释后，取 100 μL 涂布酪蛋白
平板，30℃培养 18 h。复筛时，观察酪蛋白平板上
的单菌落，挑选溶解圈大的菌株用无菌牙签点酪蛋
白平板，30℃培养 12 h，选取溶解圈较大的菌株，
反复筛选 5 次后，接种 LB 单菌落平板，4℃保存
备用。
1.2.2 纳豆制备及粗酶液的提取 将筛选菌株接种
到 3 mL LB 液体培养基，37℃过夜培养活化菌株；2%
的接菌量转接到 50 mL LB 液体培养基，37℃培养 4
h，4 000 r/min 离心 10 min 收集菌株，生理盐水洗 3
次，称取菌株湿重，加入生理盐水，配置成相同菌
液浓度的菌悬液（菌落数约为 107/mL）备用。大豆
原料洗净，浸泡后分装成 200 g 每瓶，蒸煮，放凉（约
50℃左右），将 1 mL 菌悬液加入灭菌的黄豆中，发
酵至表面产生白膜后停止发酵，4℃后熟 12 h 得纳
豆成品。
取从各种豆制品中分离纯化得到的高活力菌株，
按照以上工艺生产纳豆，以拉丝长度评价纳豆品质。
拉丝长度测定 ：用筷子挑起，20 cm 为一单位，从
中间部位再拉 20 cm，重复进行，直至拉断。
取适量发酵好的纳豆放入烧杯，加入 5 倍体积
的生理盐水，于 4℃下以磁力搅拌器搅拌 2 h，以 6
层纱布过滤除豆渣，取纳豆液，12 000×g、4℃离
心 5 min，所得上清液，即为纳豆激酶粗提液。
1.2.3 纳豆激酶酶活分析 纤维蛋白平板法测纳豆
激酶活力，为改进的 Astrup 法［10］，具体如下 ：0.1 g
琼脂糖加到 10 mL 10 mmol/L PBS（pH7.2），微波炉
加热溶解，50℃恒温水浴 10 min ；0.01 g 纤维蛋白
原加到 10 mL 10 mmol/L PBS（pH7.2），玻璃棒搅匀，
50℃恒温水浴 10 min ；将 10 μL 凝血酶（0.1 IU/μL）
加到琼脂糖溶液中，混匀 ；再将纤维蛋白原溶液加
入琼脂糖溶液中，迅速混匀并倒于 9×9 cm 平皿中，
室温放置 90 min，使其充分凝固。5 mm 打孔器打孔，
上样，室温放置 10 min，于 37℃恒温 18 h，游标卡
尺测量溶解圈的两个垂直直径，计算溶解圈的面积，
根据尿激酶标准曲线计算酶的活力单位。尿激酶标
准曲线的制作参考马明等［11］的方法。
1.2.4 最适发酵时间分析 将筛选菌株活化后，按
方法 1.2.2 和 1.2.3 进行纳豆的发酵，于 13 h 起每隔
1 h 取 5 g 纳豆，连续取 5 h，分别提取纳豆激酶粗
酶液进行酶活分析。
2 结果
2.1 纳豆菌的筛选
以从日本纳豆中筛选的菌株为阳性对照，从多
家超市购买纳豆、豆酱、豆豉及民间自酿豆酱等发
酵豆制品中筛选纳豆激酶产生菌。通过酪蛋白平板
法检测菌落蛋白酶水解活性，最终获得具有较明显
溶解圈的菌株 8 株，其中 5 号菌落水解圈最大。通
过纳豆激酶活性测定，结果显示 5 号菌落具有最好
的酶活性（图 1-A），纳豆激酶活性分析显示 5 号菌
产的激酶活性最高（图 1-B）。
2015,31(3) 163赵仲麟等：纳豆激酶生产菌的筛选及发酵纳豆特性研究
2.3 纳豆激酶活性分析
从 5 号菌株和其他市售的 3 种纳豆分离出的纳
豆菌发酵得到的纳豆中提取粗酶液，进行活性分析，
结果如表 1 所示。S2 纳豆菌和 S1 纳豆菌所产的纳
豆激酶活性最高，约为 131 FU/g，5 号纳豆的纳豆
激酶活性次之，为 121.538 FU/g，S3 纳豆中纳豆激
酶活性为 100 FU/g。虽然 5 号菌株发酵纳豆的纳豆
激酶活性居中，但是该菌株实现了较快的发酵速度，
发酵形成白膜的时间较其他菌株早大约 2 h，且产生
白膜的厚度和黏度明显强于其他菌株，这也可能是
其拉丝长度强于其他菌株的原因。
表 1 纳豆激酶酶活分析
纳豆品种
活性分析
FU FU/g
5 号纳豆 2.431 121.538
S1 纳豆 2.633 131.580
S2 纳豆 2.611 130.556
S3 纳豆 2.000 100.000
2.4 最适发酵时间分析
为研究 5 号菌株发酵纳豆的特性，找到最佳发
酵时间，将 5 号菌株活化后进行纳豆发酵，从 13 h
开始每隔 1 h 取样，提取粗酶液，纤维蛋白法测定
粗酶液活性，并绘制 5 号菌株纳豆发酵过程中纳豆
激酶活性曲线（图 3）。结果表明，随着发酵时间的
延长，5 号菌株发酵纳豆产生的纳豆激酶呈缓慢递
增的趋势，17-18 h 趋于平缓，17 h 时的纳豆激酶活
性最高，为 92.278 FU/g。
1 2
3 4 5 6
8UK7 CK-
1
0
20
40
60
80
100⴨ሩ⍫ᙗ%
2 3 4 5 6 7 8 UK CK
B
A
菌溶编号
图 1 菌落蛋白酶水解活性试验
2.2 纳豆的感官评价
利用 5 号菌株以及从市售的 3 种纳豆（S1，S2，
S3）中分离到的纳豆菌进行纳豆发酵，对大豆发酵
后制得纳豆进行感官评价。4 种发酵纳豆产品均为
亮黄色，具有纳豆特有的酱香气味，纳豆丝里含纳
豆激酶，拉丝长度测定结果，如图 2。5 号菌株发酵
所得纳豆拉丝长度最好，为 75 cm ；其次为 S2 纳豆
菌发酵所得纳豆，拉丝长度 60 cm ；S1 纳豆和 S3 纳
豆相对较短，拉丝长度分别为 54 cm 和 45 cm。
80
70
60
50
40᣹э䮯ᓖcm 30
20
10
0
5ਧ S1 S2 S3
图 2 纳豆产品的拉丝长度比较
95
90
80
85
75
70
13 14 15 16 17 18ਁ䞥ᰦ䰤hFU·g-1
图 3 5 号菌株纳豆激酶活性曲线
3 讨论
本试验对分离筛选的纳豆激酶生产菌与其他 3
种市售纳豆菌进行了纳豆发酵，对产品和纳豆激酶
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.3164
酶活性进行了比较。5 号菌发酵得到的产品口感佳、
气味好，虽然酶活相对居中，但具有最高的拉丝长
度。此外，5 号菌株发酵纳豆产生的纳豆激酶呈缓
慢递增的趋势，17 h 的纳豆激酶活性最高，相比其
他 3 株纳豆菌发酵时间略短。菌株的发酵条件对产
品中纳豆激酶含量的影响较大，可以通过酶活优化
培养基组成和发酵工艺提高芽孢杆菌的纳豆激酶产
量［12］，通过采用单因素和正交试验对筛选菌株的纳
豆激酶的液体发酵条件进行研究，也可通过分子生
物学的手段对纳豆激酶基因进行改造［13］，以期提高
纳豆激酶产量，为该酶的进一步扩大培养奠定基础。
目前已商业化应用的纳豆激酶热稳定性较差，
温度到达 60℃时，纳豆激酶瞬间失活，在制备胶囊
和长期运输的过程中会丧失大部分活力，影响其实
际使用效果。通过增加酶量，且在低温储运来缓解
纳豆激酶的活性损失，不利用工业大规模生产及推
广。另外，纳豆激酶在酸性环境下也容易失活，在
胃液环境中将完全失去活性。因此，未来的研究主
要集中在纳豆激酶基因的筛选及产品包被胶囊化等
方面［14，15］，以期得到性能优良、可商品化的纳豆激酶。
我们后期的研究主要是克隆该纳豆激酶的基因，并
对其进行突变改造，以期提高其酶活性及热稳定性。
4 结论
本研究筛选到了一株纳豆激酶生产菌，利用该
菌株以及市售的 3 种纳豆中的纳豆菌进行纳豆发酵
试验，筛选到的 5 号菌株发酵生产纳豆的周期较短，
得到的纳豆产品颜色金黄，具有酱香味，拉丝长度
极佳。表明发酵至 17 h 纳豆激酶活性达到最大值，
该菌株可作为潜在的纳豆生产菌株。
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（责任编辑 李楠）