全 文 ：·综述与专论· 2013年第2期
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
纤维素是一种长链糖类，主要由结晶和非结晶
两种形式构成，是自然界中较为丰富的可再生生物
资源，若对其合理广泛应用，可在一定程度上减轻
全球普遍存在的能源危机问题。因此，自 1906 年纤
维素酶从蜗牛消化液中被发掘出来之后，全球开始
了对纤维素酶的广泛研究。虽然自然界中很多生物
可以产生纤维素酶，但是面对能源压力和市场化的
需求，如何进一步提高纤维素酶的产量和生产水平，
是迫在眉睫的问题。而对纤维素酶基因的研究为此
开辟了一条新的可行途径。
1 纤维素酶与生物能源
由于目前全球性的能源压力，使很多科研机构
和企业尝试寻找新的可再生能源来代替现有的石化
资源。专家普遍认为，缓解能源压力除了目前新兴
的以微藻为原料制备第二代生物柴油之外［1］，还可
收稿日期 ：2012-09-05
基金项目 ： 湖北省教育厅科学研究项目（D20121108），武汉大学青年科技骨干培育计划（2012XZ012），武汉科技大学绿色制造与节能减排
科技研究中心开放基金（B1013）
作者简介 ：赵燕，硕士，研究方向 ：生物化工 ；E-mail ：zhaoyan871005@163.com
通讯作者 ：杨忠华，男，教授，博士生导师，研究方向 ：生物化工 ；E-mail ：yangzh@wust.edu.cn
纤维素酶及其基因研究进展
赵燕  陈庚华  周卫  侯亚利  杨忠华
（武汉科技大学化学工程与技术学院，武汉 430081）
摘 要 ： 纤维素是广泛存在于自然界的多糖类物质，纤维素酶能有效地将纤维素物质水解成单糖进而发酵生产乙醇、氢气
以及微生物油脂等，因此对其合理利用可以缓解全球能源压力。近十几年来纤维素酶受到国内外的关注。结合纤维素酶与生物能
源的关系及市场化的需求，概括近年来国内外对纤维素酶基因的研究进展。
关键词 ： 纤维素 纤维素酶 生物能源 商业化 纤维素酶基因
Progress of Cellulase and Cellulase Gene Research
Zhao Yan Chen Genghua Zhou Wei Hou Yali Yang Zhonghua
（Wuhan University of Science and Technology，Wuhan 430081）
Abstract:  Cellulose is a kind of polysaccharides material existed widely in nature, it can hydrolyze cellulosic materials to monosaccharide
effectively, and then ferment to ethanol, H2 and microbial oils. It is useful to ease the shortage of global energy while using cellulose appropriately.
In recent decade, cellulase, the tool of cellulose hydrolysis, has been concerned by home and abroad. In this article, combining the relationship of
cellulase and bio-energy and the demand of cellulase for market-oriented, development process of cellulase gene were summarized.
Key words:  Cellulose Cellulase Bio-energy Commercialize Cellulase gene
采用酶水解碳水化合物形成糖类，并进一步发酵生
成乙醇。甘蔗中含有大量的蔗糖等糖分，其逐渐成
为生产生物乙醇的主要原料。而甘蔗制备蔗糖后剩
下的甘蔗渣可用于燃烧，提供蒸汽带动机器运作。
但是这种做法并不能使蔗渣得到充分的利用，且燃
烧蔗渣等秸秆废物产生的 CO2 等气体，是温室效应
的主要原因。鉴于环境问题和对燃料乙醇产量的需
求，在对甘蔗的利用方面，其除产生蔗糖之外，逐
渐转变成酶解提取蔗糖后的废弃蔗渣（大部分为纤
维素），从而得到更多的糖分制备乙醇等能源［2］。
纤维素酶水解纤维素制备生物能源，不仅能解决工
业生产废弃纤维素堆积造成的空间污染问题，而且
可将废弃纤维素更合理充分的利用于生产生活以及
农畜业。
因此，纤维素作为全球普遍大量存在的可再生
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第2期36
多糖资源，应用前景非常广阔。纤维素生物质可以
通过水解发酵分离（SHF）法，采用单一的水解酶
将其水解为糖类物质，随后用另一种酶发酵为液体
燃料 ；也可以通过厌氧菌的水解 - 发酵耦合方式转
化为燃料乙醇［3］。近年来对于纤维素酶的研究应用
主要采用物理或者化学的方法调控植物体内纤维素、
半纤维素以及木质素的形成，从而改变纤维素的纤
维组成［4］。纤维素酶水解利用生活、森林和农业废
弃纤维素制备生物燃料，具有广阔的前景，故受到
全球关注。大部分的生产工艺为生产乙醇的工艺流
程，而 Wilson 等［5］曾用纤维素酶和纤维素制备可
掺杂在汽油里的丁醇，供汽车使用，不但汽油和丁
醇的溶合性很好，而且汽车行驶路程也略有增加。
汤斌［6］，李旭东［7］等研究了纤维素酶在稀酸
的作用下对秸秆产燃料乙醇的预处理，分别以 0.8%
（W/W）或质量分数为 4 % 的稀硫酸处理，得到了最
佳效果。江丹等［8］研究发现，利用纤维素酶可处理
造纸污泥发酵产生乙醇，发酵条件优化后乙醇的发
酵率最高可达到 95.97%，具有一定的工业应用前景。
2 纤维素酶商业化趋势
作为水解纤维素制备生物能源的“工具”，市场
上对纤维素酶的质量和需求量日益增高。而由于纤
维素酶的用途广泛，其除了制备生物能源之外，还
可以制备成饲料添加剂、织物洗涤剂、造纸工业等
有关的酶制剂投入工业生产。Genencor 和 Novozyme
两家公司是目前生产生物催化转化型纤维素酶较
具代表性的公司。Genencor 公司近几年研发了酶
Accelerase® 1500，该酶由基因工程改造的里氏木霉
分泌，同最初研发的 Accelerase® 1000 相比，在制备
生物乙醇方面经济效益更高，故而被专门用于木质
纤维素的生物燃料制备工艺［9］。
Novozyme 公司生产和制备的纤维素酶较多元
化，如用在纺织业的 Cellusoft® AP 和 Cellusoft® CR，
衣 物 清 洁 剂 中 所 含 的 Carezyme® 和 Celluclean®， 低
温清洗石料中用到的 Denimax® 等针对性的酶制剂。
2009 年，Novozyme 公司声明其生产的纤维素酶制剂
在生物质水解方面具有可应用性。虽然产品的相关
信息和市场实用性尚不清楚，但对于纤维素酶的发
展有着一定的意义。表 1［9］中列举的是目前世界上
生产出售纤维素酶的主要公司以及制备酶的菌种，
其中大部分菌种都是经过改造的基因工程菌。
3 纤维素酶工程
纤维素酶在能源方面的优势及其商业化趋势使
其在生活和生产中的需求量逐渐增加。虽然自然界
中很多丝状真菌可以生产分泌纤维素酶，但是其产
酶水平、酶量和酶的性能并不能满足市场化商业化
的需求。Öhgren 等［10］曾试图将纤维素酶糖基化与
发酵工艺相偶联，但仍不能体现纤维素的最佳应用
效果。影响纤维素应用的主要问题是天然纤维素酶
在对纤维素水解的实际应用中没有可行性或者可行
性很低［11］。近 10 年来，对纤维素酶的研究逐渐转
移到基因方面。过去的研究结果显示，纤维素酶水
解纤维素主要是 3 个组分的协同作用，各个酶组分
之间互相创造合适的结合位点，并解决产物对酶的
抑制作用［12，13］，目前国内外都试图采用基因调控的
手段提高产业化纤维素酶各组分的产量和酶学性质。
3.1 纤维素酶结构域功能
3.1.1 真菌纤维素酶结构研究 很多丝状真菌可以
分泌纤维素酶，但目前研究较为深入的是 T.reesei 纤
维素酶体系，已鉴定出其分泌的 8 种主要纤维素酶，
并通过克隆技术成功制备 2 种葡萄糖苷酶［14］。
1988 年，Stahlberg 等［15］通过试验证明，丝状
真菌 T. reesei 产纤维素酶具有很大的开发潜力，并
猜想纤维素酶催化区含有纤维素结合域（CBD），其
功能主要是可以自主的结合和脱离结晶纤维素。随
后科研试验对纤维素酶的研究更多着重于 T.reesei 及
其基因方向。Saloheimo 等［16］于 1988 年发现，自然
界中 T. reesei 内切葡聚糖酶（EG）III 的 C-末端与纤
维素结合域（CBD）之间存在一个由 21 个氨基酸组
成的信号序列。因此推断，内切葡聚糖酶纤维素结
合域（CBDED III）编码区的第一个密码子不是起始密
码子 AUG，而编码区的最后一个密码子也并不是终
止密码子 UAG。该发现对随后 CBDED III 基因重组以
及在宿主中的表达研究有着重要意义。
随着对纤维素酶基因的研究，1996 年，Linder
和 Teeri［17］证实，大多数 T. reesei 都可以产生非催
化性质的 CBD，而 T. reesei 的 EG III 基因重组后对
纤维素的亲和性是完全可逆的。而 Kleman-leyer［18］
2013年第2期 37赵燕等 ：纤维素酶及其基因研究进展
和 GAO 等［19］曾先后发现重组纤维素酶对纤维素纤
维的解聚去纤能力同天然纤维素酶相比有显著的提
高。2001 年山东大学试验得出，CBDED III 对结晶纤
维素的作用主要是破坏多糖链间和链内的氢键［20］。
3.1.2 细菌纤维素酶结构 大多数细菌的纤维素酶
为内切葡聚糖酶，有些细菌含有一些特殊的编码基
因，如葡萄糖苷酶基因，以及与纤维磷酸化相关的
酶基因［21］。侯爱华等［22］2002 年对细菌纤维素酶研
究认为，一些细菌产生分泌的纤维素酶常聚合形成
纤酶小体结构的多酶复合体。细菌生产分泌纤维素
酶虽然量少，大多无法作用于结晶纤维素且不是胞
外酶，但很多产纤维素酶细菌的 CBD 区含有的氨基
酸大多不带电荷，羟基氨基酸为主要成分，肽链末
端半胱氨基酸的位置基本相同［23］。细菌中的纤维素
酶小体成簇无规律的分散于细菌细胞内，目前研究
较多的是 C. thermocellum，其大多数的纤维素酶小
体都聚集在 cel 簇上。2005 年时，cip C-cel 48F 等 12
个基因已完全被鉴定出来，并且证实转录从 cip C 起
始［24］。Demain［25］ 研 究 发 现，C. thermocellum 的 纤
维素酶基因中存在纤维素酶小体和非纤维素酶小体
两种基因。
3.2 纤维素酶基因的研究
早在 20 世纪 80 年代，DNA 重组技术已用来克
隆和鉴定微生物体内的纤维素酶基因，研究最多的
为编码 Eng 和 Exg 的胞外纤维素酶基因［26］。香港
科技大学自 1988 年开始研究纤维素酶产生菌，目前
克隆过 Cellulomonas fimi 中编码 Eng 和 Exg 的基因 ：
cenA 和 cex，并成功将其导入多种宿主中［26］。由于
Cellulomonas biazotea 分泌 Cel 能力较高，并且与 C.
fimi 具有一定的相关性［27］，该实验室目前主要研究
Cellulomonas biazotea 中 Cel 同 Eng 和 Exg 的协同作用。
Kim 等［28］将耐热菌 Aquifex aeolicus VF5 中编码
耐热内切葡聚糖酶的基因（Cel8Y）克隆转导入 E. coli
XL1-Blue 中。通过表达和检测，该内切葡聚糖酶在
80℃时有最大酶活，在 100 ℃时酶活可持续 2 h。
Hakamada 等［29］纯化并研究了 Bacilluis circulans
表 1 商业化纤维素酶生产公司及其产酶菌种［9］
酶样 供应商 产酶菌种
Cellubrix（Celluclast） Novozyme，Denmark 长枝木霉和黑曲霉
Novozymes 188 Novozyme 黑曲霉
Cellulase 2000L Rhodia -Danisco（Vinay，France） 长枝木霉 / 里氏木霉
Rohament CL Rohm-AB Enzymes（Rajamaki，Finland） 长枝木霉 / 里氏木霉
Viscostar 150L Dyadic（Jupiter，USA） 长枝木霉 / 里氏木霉
Multifect CL Genencor Intl.（S. San Francisco，CA） 里氏木霉
Bio-feed beta L Novozyme 长枝木霉 / 里氏木霉
Energex L Novozyme 长枝木霉 / 里氏木霉
Ultraflo L Novozyme 长枝木霉 / 里氏木霉
Viscozyme L Novozyme 长枝木霉 / 里氏木霉
Cellulyve 50L Lyven（Colombelles，France） 长枝木霉 / 里氏木霉
GC 440 Genencor-Danisco（Rochester，USA） 长枝木霉 / 里氏木霉
GC 880 Genencor 长枝木霉 / 里氏木霉
Spezyme CP Genencor 长枝木霉 / 里氏木霉
GC 220 Genencor 长枝木霉 / 里氏木霉
Accelerase 1500 Genencor 里氏木霉
Cellulase AP30K Amano Enzyme 黑曲霉
Cellulase TRL Solvay Enzymes（Elkhart，IN） 长枝木霉 / 里氏木霉
Econase CE Alko-EDC（New York，NY） 长枝木霉 / 里氏木霉
Cellulase TAP106 Amano Enzyme（Troy，VA） 绿色木霉
Biocellulase TRI Quest Intl.（Sarasota，FL） 长枝木霉 / 里氏木霉
Biocellulase A Quest Intl. 黑曲霉
Ultra-low microbial（ULM） Iogen（Ottawa，Canada） 长枝木霉 / 里氏木霉
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第2期38
高等电点碱性葡聚糖内切酶，采用盒式连接对其基
因进行 PCR，得到的结构基因含有一个单一的开放
阅读框，编码 407 个氨基酸，其中包括一条大约有
30 个氨基酸的信号肽。
蔡勇等［30］利用大肠杆菌作为宿主细胞，从芽
孢杆菌 CY1-3 中克隆表达出具有纤维素酶活性的
CelC 蛋白。2009 年，Rahman 等［31］ 在研究纤维素
酶与木糖酶的同源重组性时，提出理想情况下，可
以用 T. reesei 的 cbh1 启动子和终止子构建表达载体
来制备同源和异源性蛋白质。而通过荧光蛋白标记，
对 cbh1 启动子的转录活性测定可达到细胞水平［32］。
Kitagawa 等［33］ 将 Clostridium thermocellum 的内
切葡聚糖酶基因（Ctcel8A）与质粒相连后转入酵母
二倍体细胞，得到的缺失菌株与野生型菌株相比，
内切葡聚糖酶的活力有所提高。在对缺失菌株分类
后，经试验证实 vps3Δ 和 vps16Δ 菌株异源性表达
产生的 β-葡糖苷酶活性很高。
华东理工大学［34］2011 年构建了随机整合型
pWEF 31 和定点整合型 pWEF 32 基因表达载体。这
两种基因可以通过农杆菌介导转入里氏木霉，构建
载体后通过红色标记基因［35］检测可确定构建的载
体的实用性。通过试验发现 pWEF 31 比较适合用于
随机性的重组试验，而 pWEF 32 则适用于同源性重
组。该研究对丝状真菌基因功能和表达的研究极其
有利。
Anthony 等［36］2012 年报道了一种从 Cellulomo-
nas biazotea 克隆得到的新型纤维二糖酶基因（cba3），
该基因编码的 β-葡萄糖苷酶属于糖苷水解酶家族 1
（GH 1），而以往研究和报道 C. biazotea 的 cba3 基因
编码得到 β-葡萄糖苷酶都是糖苷水解酶家族 3 的成
员，这是首次在 C. biazotea 中得到 GH 1 家族的 β-葡
萄糖苷酶。
到目前为止，以大肠杆菌或者酵母细胞为宿主
菌，很多细菌或者真菌的纤维素酶基因得到了表达。
李旺等［37］总结，在纤维素酶基因研究和克隆的早期，
若想获得纤维素酶基因较完整的信息，可通过构建
DNA 文库和 cDNA 文库的方法。而随着技术的进步，
目前可采用人工合成和选择性的从宏基因组中扩增
等方式获得纤维素酶基因。
这些研究及其成果，使人工构建的重组纤维素
酶投入广泛工业生产应用成为可能。本实验室目前
着手研究绿色木霉中内切葡聚糖酶基因在大肠杆菌
中的克隆表达，若成功构建工程菌，对纤维素酶的
工业利用有着深远意义。
4 结语
纤维素除了用于制备生物能源，还可以作为添
加剂投入工业生产，如生产可降解塑料等。由于纤
维素制备燃料乙醇仍有许多限制，其制备尚不能达
到大量工业化的水平［38］。鉴于纤维素酶的实用性和
市场前景，国内外对纤维素酶的基因研究和改造取
得了很大进展。纤酶小体的发现，使细菌纤维素酶
的研究有了很大的进展。然而工程菌的制备对表达
体系要求较高，加大了纤维素酶工程菌制备的难度。
随着生物技术的发展，对纤维素酶工程菌研究的逐
渐完善以及各级加工工艺的发展，将大大推动纤维
素酶的市场化应用。
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（责任编辑 狄艳红）