全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第3期
苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）为
革兰氏阳性菌，Bt 在芽胞的形成过程中能够产生杀
虫晶体蛋白（Insecticidal Crystal Proteins，ICPs），这
种伴胞晶体蛋白对鳞翅目、鞘翅目、双翅目、膜翅目
等多种重要的害虫都有特异性的毒杀作用。1996 年，
Estruch 等［1］ 在 Bt 发酵上清液中发现了营养期杀
虫蛋白（Vegetative Insecticidal Proteins，VIPs）。VIPs
与 Bt 在芽胞形成的过程中产生的杀虫晶体蛋白的同
源性极低。VIPs 分为 Vip1、Vip2、Vip3 和 Vip4，其
收稿日期 ：2012-08-27
基金项目 ： 植物病虫害生物学国家重点实验室开放基金项目（SKL2011P03），黑龙江省教育厅科学技术研究项目计划（12521021），
“863”计划课题（2011AA10A203）
作者简介 ：张宁，女，硕士研究生，研究方向 ：生防微生物分子生物学 ；E-mail ：zhangning_13@hotmail.com
通讯作者 ： 高继国，男，教授，博士生导师，研究方向 ：生物大分子的分离纯化，苏云金芽胞杆菌的抗性机理，生物安全性 ；
E-mail ：gaojiguo1961@hotmail.com
Vip3A 杀虫蛋白随机重组文库的构建与分析
张宁1 刘荣梅1 束长龙2 张杰2 李海涛1 高继国1
（1. 东北农业大学生命科学学院，哈尔滨 150030 ；2. 中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害
生物学国家重点实验室，北京 100193）
摘 要 ： 营养期杀虫蛋白（Vegetative Insecticidal Proteins，VIPs）作为苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）一类新
型杀虫蛋白，丰富了 Bt 的杀虫谱，是一种用于植物保护的重要杀虫蛋白。为了提高 VIPs 蛋白的杀虫活性，扩展其杀虫谱，利用
Gateway 技术对 vip3Aa39 和 vip3Aa11 基因进行同源重组突变，并克隆到入门载体 pDONR221 中，构建了重组文库。结果显示，得
到了 42 个基因型不同的重组质粒，其中有 22 个蛋白序列不同的突变体。
关键词 ： 苏云金芽胞杆菌 营养期杀虫蛋白 Gateway 技术 重组文库
Construction and Analysis of Vip3A Insecticidal Protein Random
Recombination Library
Zhang Ning1 Liu Rongmei1 Shu Changlong2 Zhang Jie2 Li Haitao1 Gao Jiguo1
（1. College of Life Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030 ；2. State Key Laboratory of Biology Chinese Academy of
Agricultural Sciences Institute of Plant Protection, Plant Diseases and Insect Pests, Beijing 100193）
Abstract: VIPs（Vegetative Insecticidal Proteins）from Bacillus thuringiensis（Bt）are a new class of insecticidal proteins, which
enrich the insecticidal spectrum of Bt, and which are important proteins for plant protection. In order to improve the insecticidal activity and
expand the insecticidal spectrum of the VIPs, the homologous recombination of vip3Aa39 and vip3Aa11 were completed by Gateway technology,
and the products were cloned into the entry vector pDONR221, constructing a mutant library. Result showed 42 recombinant plasmids of different
genotypes and 22 mutants of different protein sequences were obtained. The construction and the analysis of the random mutation library makes it
possible for getting the Vip proteins with high insecticidal activity, widely insecticidal spectrum and insecticidal specific mechanism research.
Key words: Bacillus thuringiensis VIPs Gateway technology Recombination library
中尤其 Vip3A 蛋白对鳞翅目夜蛾科害虫（如小地老
虎、草地贪夜蛾、甜菜夜蛾和棉铃虫等）具有广谱
高效的杀虫活性［2］。其中 Vip3Aa 蛋白间的氨基酸序
列同源性都在 95% 以上，但其序列间个别氨基酸的
差异也会导致对害虫毒力和杀虫谱的变化［3］。本试
验采用的 Vip3Aa39 和 Vip3Aa11 蛋白氨基酸序列间
仅存在 39 个位点的不同，但 Vip3Aa39 和 Vip3Aa11
对小地老虎、小菜蛾、棉铃虫的杀虫活性差别较
大，根据本实验室生物活性测定，Vip3Aa39 对小
2013年第3期 161张宁等 ：Vip3A 杀虫蛋白随机重组文库的构建与分析
地老虎的 50% 致死浓度（LC50）为 5.43 μg/mL，而
Vip3Aa11 的 LC50 73.62 μg/mL ；Vip3Aa39 对 小 菜 蛾
的 LC50 为 140.64 μg/mL，而 Vip3Aa11 对小菜蛾的杀
虫活性极低 ；Vip3Aa11 对棉铃虫 LC50 为 35.18 μg/mL，
而 Vip3Aa39 的 LC50 仅 为 286.99 μg/mL
［6］。 所 以
定位和分析 Vip3A 蛋白的功能特异性区域，对研
究 Vip3Aa 蛋白的杀虫活性及杀虫谱具有重要意义。
现在，人们越来越关注对已有蛋白质的基因改
造，发明了多种蛋白质突变体基因库构建方法［4］，
其中就包括同源及非同源的多种重组方法。本研究
选用了本实验室克隆的对小菜蛾等农业害虫生物活
性不同的 vip3Aa39［6］和 vip3Aa11［7］基因为目的基因，
将两个基因片段进行同源随机重组，得到一系列同
源重组产物。将不同的重组产物利用 Gateway［5］技
术克隆到供体载体（Donor vector），构建一个 Vip3A
的随机重组文库。旨在获得高毒力、具有杀虫特异
性的 Vip3A 蛋白的同时，也为进一步研究 Vip3A 类
蛋白高毒力及杀虫特异性相关功能区域奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株和质粒 转入重组质粒 pEB-Vip3Aa39 的
Rosetta（DE3）菌株和转入重组质粒 pET28a-Vip3Aa-
11 的 BL21 菌株为中国农业科学院植物保护研究所
生物技术组实验室所有。pDONR221 菌株购于 Invitr-
ogen 公司。Escherichia coli JM109 为实验室保存菌。
1.1.2 主要试剂和工具酶 Gateway BP Clonase Ⅱ E-
nzyme Mix 购自 Invitrogen 公司 ；2×Taq PCR Master-
Mix、DNA Ladder Marker 购自博迈德生物公司 ；Pri-
merSTAR Max DNA Polymerase 购 自 大 连 宝 生 物 公
司 ；质粒 DNA 小量提取试剂盒、PCR 纯化试剂盒购
自 AxyPrep 生物技术有限公司。PCR 引物合成和测
序委托上海生工生物工程有限公司。DNA marker ：
100 bp ladder plus 购自博迈德生物公司。其余试剂均
为国产分析纯以上或进口超级纯产品。
1.1.3 培养基 液体 LB ：胰蛋白胨 1%，酵母提取
物 0.5%，氯化钠 1%。固体 LB ：在液体培养基中加
1.5% 琼脂。
1.2 方法
1.2.1 质 粒 DNA 的 提 取 利 用 质 粒 DNA 小 量 提
取 试 剂 盒 提 取 大 肠 杆 菌 中 的 质 粒 pEB-Vip3Aa39、
pET28a-Vip3Aa11 和 pDONR221。
1.2.2 重组目的基因的引物设计 根据已得到的
vip3Aa39、vip3Aa11 序列和 attB1、attB2 位点序列，
设计引物。由于 attB 位点序列过长，设计两步 PCR。
各引物名称及序列如下 ：VIP3AA39-5 ：GTACAAAA-
AAGCAGGCTATGAATAAT ；VIP3AA39-3 ：TTACTT-
AATTGAGACATCGTTAAACTTTACAAGA ；VIP3AA-
11-5 ：ATGAACAAGAATAATACTAAATTAAGCACA-
AGA ；VIP3AA11-3 ：GTACAAGAAAGCTGGGTCTTA-
ATAGAGACATCGT ；attB1 ：GGGGACAAGTTTGTAC-
AAAAAAGCAGGCT ；attB2 ：GGGGACCACTTTGTAC-
AAGAAAGCTGGGT（下划线为 attB1、attB2 的部分
序列）。
1.2.3 重 组 质 粒 的 构 建 分 别 以 pEB-Vip3Aa39，
pET28a-Vip3Aa11 质 粒 为 模 板， 利 用 已 设 计 引
物 VIP3A-A39-5、VIP3AA39-3 和 VIP3AA11-5、
VIP3AA11-3 进行第一步 PCR，分别在 vip3Aa39 基
因的 5 端加上 attB1 位点的部分序列，在 vip3Aa11
基因的 3 端加上 attB2 位点的部分序列，且引物之
间的长度为整个基因的完整序列 ；再分别以第一
步 PCR 产物为模板，利用引物 attB1、VIP3AA39-3
和 VIP3AA11-5、attB2，进行第二步 PCR，分别使
vip3Aa39 基 因 的 5 端 加 上 attB1 全 位 点 序 列， 使
vip3Aa11 基因的 3 端加上 attB2 全位点序列。
提取载体 pDONR221 质粒，将第二步 PCR 反应
产 物 attB1-Vip3Aa39 和 Vip3Aa11-attB2 分 别 用 PCR
纯化试剂盒进行纯化，最后用 Gateway BP 重组试剂
盒中的 Gateway BP Clonase Ⅱ enzyme mix 2 μL 进行
25℃［8］过夜重组反应，获得重组质粒。重组反应示
意图见图 1。
1.2.4 Vip3A 随机重组文库的构建 重组质粒加入
2 μL 蛋 白 酶 K，37 ℃ 温 浴 10 min， 转 化 大 肠 杆 菌
JM109，挑取所有克隆。
1.2.5 阳性克隆的鉴定 将重组质粒进行 PCR 初步
鉴定，测序由中国农业科学院重大科学工程开放实
验室完成。根据测序结果，确定阳性克隆子。
2 结果
2.1 vip3Aa的PCR反应
以质粒 pEB-Vip3Aa39 和 pET28a-Vip3Aa11 为模
板，应用引物 VIP3AA39-5、VIP3AA39-3 和 VIP3A-
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第3期162
A11-5、VIP3AA11-3 扩 增 到 带 有 部 分 attB1 位 点
的 vip3Aa39 的 目 的 产 物 和 带 有 部 分 attB2 位 点 的
vip3Aa11 的目的产物，结果见图 2 中 1、2、3、4 泳道。
将 PCR 产物用 PCR 纯化试剂盒纯化后，结果见图 2
中 6、7 泳道。
以第一次 PCR 反应产物为模板，进行第二次
PCR，结果（图 3）显示，应用设计引物 attB1 和
VIP3AA39-3 成功得到带有 attB1 全位点的 vip3Aa39
目 的 产 物（ 图 3 中 1、2 泳 道 ）， 命 名 为 attB1-
vip3Aa39；应用设计引物 VIP3AA11-5 和 attB2 成功得
到带有 attB2 全位点的 vip3Aa11 目的产物（图 3 中 3、
4 泳道），命名为 vip3Aa11-attB2。
attB1
ATG
ATG
vip3Aa39
vip3Aa11
vip3Aa39
vip3Aa11
attB1
attB1
ccdB
attP1
pDONR
CmR
BP reaction
Recombinant Plasmid
attL1 attL2
attP2
attB2
Recombinant enzyme
attB2
attB2
STOP
STOP
图 1 Gateway 技术同源重组示意图
3000
bp
M 1 2 3 4 5 6 7
bp
2000
2300
M ：100 bp ladder plus DNA Marker ；1，2 ：Vip3Aa39 的 5 端带有部分 attB1
位点的 PCR 产物；3，4：Vip3Aa11 的 3 端带有部分 attB2 位点的 PCR 产物；5：
阴性对照 ；6 ：1、2 泳道的 PCR 产物纯化回收结果 ；7 ：3、4 泳道的 PCR
产物纯化回收结果
图 2 vip3Aa39 和 vip3Aa11 的第一步 PCR 扩增及纯化检测
3000
bp
M 1 2 3 4 5
2000
M ：100 bp ladder plus DNA Marker ；1，2 ：attB1-vip3Aa39 的 PCR 产物 ；3，4 ：
vip3Aa11-attB2 的 PCR 产物 ；5 ：阴性对照
图 3 vip3Aa39 和 vip3Aa11 的第二步 PCR 扩增检测
应用 NanoDrop ND-1000 核酸蛋白定量检测仪，
对纯化后的 PCR 产物及提取的 pDONR221 质粒进行
定量 ：attB1-vip3Aa39 浓度为 189.6 ng/L，vip3Aa11-
attB2 浓度为 193.2 ng/L，pDONR221 浓度为 76 ng/L，
结果显示，浓度能够达到 Gateway BP 重组试剂盒的
要求。
2.2 重组质粒的构建和重组文库的确定
将初步鉴定的 42 个重组质粒进行测序。将测序
结果用 NCBI 网站上的 BLAST、Informax 2003 Vector
NTI Suite 9、DNAMAN 等软件分析，获得 22 个氨基
酸序列不同的重组突变体，从而确定重组文库。
对 Vip3Aa39、Vip3Aa11 和 22 个突变体氨基酸
序列差别位点进行统计，结果（图 4）显示，有的
突变体与 Vip3Aa39 的序列 N 端区别很大，有的与
Vip3Aa11 序列的 C 端差别很多，但都与 Vip3Aa39
和 Vip3Aa11 的氨基酸序列不同，并且这些突变体在
Vip3Aa39 和 Vip3Aa11 的 39 个氨基酸差异位点上都
有体现。说明重组位点覆盖了两个材料基因的全部
差异位点，并且重组位点的数目有一个由逐渐递增
到递减的趋势，为之后研究材料基因的功能特异位
2013年第3期 163张宁等 ：Vip3A 杀虫蛋白随机重组文库的构建与分析
点奠定了很好的基础。同时将 22 个突变体氨基酸序
列到 NCBI 网站进行蛋白序列比对，得到的每个突
变体都是新序列。
将得到的 22 个突变体氨基酸序列和 vip3Aa39 和
vip3Aa11 的氨基酸序列应用 Vector NTI 软件进行聚
类分析，可看出各个突变体与 vip3Aa39 和 vip3Aa11
的氨基酸序列的远近关系，结果（图 5）显示，距
离 vip3Aa39 和 vip3Aa11 的氨基酸序列较远的突变体，
图 4 氨基酸突变位点统计分析
重组
位点 M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10 M11 M12 M13 M14 M15 M16 M17 M18 M19 M20 M21 M22
vip3
Aa11
vip3
Aa39
基因名称
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第3期164
其氨基酸序列与 vip3Aa39 和 vip3Aa11 的氨基酸序列
的差别较大，例如 M1、M20、M21 和 M22，共 4 个
M2 0.0004
Vip3Aa11 0.0008
Vip3Aa39 0.0038
M3 0.0003 M4 0.0001
M5 0.0013
M6 0.0000
M8 0.0000
M9 0.0000
M21 0.0000 M19 0.0000
M18 0.0000 M17 0.0000 M16 0.0000
M15 0.0000 M14 0.0000
M13 0.0000
M11 0.0000
M12 0.0002
M7 0.0121
M10 0.0013
M20 0.0013
M22 0.0013
M1 0.0000
突变较大的突变体，占总突变体的 18% ；反之，突
变体的氨基酸序列与 vip3Aa39 和 vip3Aa11 的氨基酸
图 5 Vip3A 突变体氨基酸序列聚类图
序列的差别较小，例如 M2 和 M12 等。
3 讨论
目 前 国 际 上 的 同 源 重 组 方 法 主 要 包 括 DNA
shuffling［9］、StEP［10］、RACHITT［11］、RETT［12］、
NExT［13］、Golden Gate Shuffling［14］。这 6 种方法中，
有的存在酶的消化条件难于控制，有的存在片段延
伸时间难于控制等问题，步骤繁琐，都制约了重组
的成功率。本研究采用 Gateway 技术及同源重组酶，
步骤简单，只需一步重组反应，且反应条件易于控
制，在 25℃条件下就可进行重组，成功率高。利用
Gateway 技术，摆脱了传统载体构建中酶切连接的局
限性。Gateway 入门载体两端的接头不同，能够很好
地解决目的基因连入的方向问题，未成功重组的载
体由于仍然具有致死基因 ccdB，而使普通大肠杆菌
无法生长从而减少了假阳性的菌株，为后期的筛选
工作节省了时间。
现在，人们主要应用 Gateway 技术的 BP、LP
反应来构建表达载体，例如 2011 年，徐品三等［15］
应用 Gateway 技术快速构建百合双价抗病毒 RNAi
表 达 载 体 ；阙 文 忠 等［16］ 利 用 Gateway 技 术 快 速
地构建同时表达 NK4 蛋白和绿色荧光的重组腺病
毒 ；李明等［17］采用 Gateway 克隆技术构建了小麦
TaWRKY46-1 基 因 可 诱 导 型 超 量 表 达 载 体 ；本 研
究利用同源重组酶对两个 2.3 kb 的全长基因进行
同源随机重组，然后再通过由 Invitrogen 公司开发
的 Gateway［5］技术将不同的同源重组片段克隆到其
供体载体上，构建突变体文库。利用此方法进行的
同源随机重组，重组位点能够覆盖全部材料基因，
重组材料及条件易于控制，操作简单 ；同时利用
Gateway 技术的 BP 重组反应将重组片段克隆到供体
载体上，省去了普通克隆时的酶切连接鉴定的繁琐
步骤，可直接将片段克隆到载体上，极大地提高克
隆效率。
本研究运用 Gateway 重组酶通过对 Vip3A 类两
个基因的随机重组获得了 22 个突变体，经氨基酸序
列比对，差异较大的序列，说明突变位点较多，这
可能会改变原有目的基因的功能 ；差异较小的序列，
为今后定向研究材料基因的功能区域提供了研究对
象。基于这些突变体在氨基酸序列上呈现的差异，
我们将对这些突变体基因在大肠杆菌中进行重组表
达，然后对每个突变体重组蛋白进行提取，并将其
对鳞翅目昆虫如甜菜夜蛾、小菜蛾、小地老虎等进
行生物活性测定，以期找到杀虫特异性强，杀虫谱
广的杀虫蛋白。为研究 Vip3A 蛋白的特异性相关区
域或氨基酸定位奠定基础，具有重要的理论意义和
实用价值。
4 结论
应用 Gateway 技术中的 BP 反应对杀虫谱存在特
异性的 vip3Aa39 和 vip3Aa11 基因进行同源重组突变，
构建重组文库。获得 42 个基因型不同的重组质粒，
2013年第3期 165张宁等 ：Vip3A 杀虫蛋白随机重组文库的构建与分析
其中有 22 个蛋白序列不同的突变体。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）