全 文 ：·研究报告· 2011年第12期
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
收稿日期 ：2011-05-18
基金项目 ：国家自然科学基金项目（30871672），中央高校基本科研业务费专项资金资助项目（2010PY017）
作者简介 ：黄凯，男，硕士研究生，研究方向 ：微生物分子生物学 ；E-mail:huangkai1692@163.com
通讯作者 ：李明顺，女，博士，副教授，研究方向 ：微生物分子生物学 ；E-mail:mshli7125@mail.hzau.edu.cn
过表达 CodY 蛋白的苏云金芽胞杆菌基因工程菌
YBT-881-L1 的构建及特性鉴定
黄凯 金鑫 梅菲 王阶平 喻子牛 李明顺
（华中农业大学 农业微生物学国家重点实验室，武汉 430070）
摘 要: 为研究革兰氏阳性菌中的全局性转录调控因子 CodY 在苏云金芽胞杆菌中的作用机制，利用苏云金芽胞杆菌野生
株 YBT-881，构建了过表达 CodY 蛋白的基因工程菌 YBT-881-L1，并对此工程菌的特性进行了研究。结果表明，YBT-881-L1 和
野生株的生长曲线以及伴胞晶体形态无明显差异。SDS-PAGE 及质谱分析发现，野生株中沉默的 cry2Ac4 基因在工程菌中被激活，
并产生大量的 Cry2Ac4 蛋白。生物测定结果表明，重组菌株 YBT-881-L1 较野生株对鳞翅目害虫棉铃虫的杀虫活性明显增强。
关键词: CodY 转录调控因子 苏云金芽胞杆菌 杀虫活性
Construction and Identification of Bacillus thuringiensis strain
YBT-881-L1 by Overexpressing CodY
Huang Kai Jin Xin Mei Fei Wang Jieping Yu Ziniu Li Mingshun
（State Key Laboratory of Agricultural Microbiology，College of Life Science and Technology，Huazhong Agricultural University，
Wuhan 430070）
Abstract: In order to reseach the regulatory mechanism of CodY in Bacillus thuringiensis， the genetically engineered strain YBT-881-L1
of Bacillus thuringiensis was constructed by overexpressing CodY and its characteristics was performed comprehensive analysis. The growth
curve and the parasporal crystal morphology of the strain YBT-881-L1 and the wild strain YBT-881 did not show significant changes. However，
the SDS-PAGE and mass spectrometry analysis indicated that the cry2Ac4 gene which silenced in the wild strain YBT-881 was induced in
YBT-881-L1， and that a large amount of Cry2Ac4 proteins were produced. The bioassay results showed that YBT-881-L1 possessed higher
insecticidal activity against Helicoverpa armigera than the wild strain.
Key words: CodY Transcription factor Bacillus thuringiensis Insecticidal activity
转录调控因子 CodY 广泛存在于 G+C 含量低的
革兰氏阳性细菌中，对稳定期早期基因和芽胞形成
相关的 200 多个基因进行全局性调控。这些基因与
大分子降解、营养物质运输、生物代谢、鞭毛形成、
抗生素合成及趋药性等有关，并大部分在指数生长
期被阻遏，营养缺乏时被诱导表达，帮助细胞适应
营养匮乏时期 [1]。
苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuring iensis，Bt）是
一种革兰氏阳性细菌，属于蜡样芽胞杆菌群（Bacillus
cereus group），在分类地位上与蜡状芽胞杆菌（Bacillus
cereus，Bc）较接近 [2-4]。Bt 在形成芽胞的同时，在
菌体内形成具蛋白质性质的多种形态的伴胞晶体，
这是杀虫的主要成份，对无脊椎动物中的 4 个门和
节肢动物门中 16 个目的 3 000 多种害虫有活性 [5]。
目前人们重点关注 Bt 中关于杀虫晶体蛋白的代谢
调控机制研究，寻找与伴胞晶体形成相关的调控因
子。转录调控因子 CodY 在枯草芽胞杆菌（Bacillus
subtilis，Bs） 中 是 一 种 GTP 结 合 蛋 白， 它 首 先 被
认为是 Bs 的二肽通透酶操纵子的阻遏物，后来发
现 , 它可以调控多种基因的转录表达，并且在碳氮
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011年第12期182
代谢中起着重要的调控作用。CodY 具有 15 bp 序列
（AATTTTCWGAAAATT 或 AATTTTGNCAAAATT）
的高效结合热点，并已在体外得到了验证 [6]。目前
在 Bt 中关于 CodY 蛋白的研究几乎是个空白，本研
究旨在探索该蛋白在 Bt 中的作用机制，利用 Bt 野
生株 YBT-881，构建了过表达 CodY 蛋白的基因工程
菌 YBT-881-L1，并对此工程菌进行了特性鉴定，试
图寻找 CodY 与伴胞晶体蛋白形成的相关性，从而
为构建整个 Bt 的代谢调控网络奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株和质粒 所用菌株和质粒见表 1。
1.1.2 LB 培养基 蛋白胨 10 g/L，酵母浸粉 5 g/L，
NaCl 10 g/L，pH 调 至 7.4， 在 121℃ 下 湿 热 灭 菌
20 min。
1.1.3 主要仪器和试剂 各种分子克隆所用的酶类、
DNA Marker、dNTPs 等购自 TaKaRa 公司 ；各种抗生
素、溶菌酶和 RNase 均购自 Sigma 公司产品 ；DNA
凝胶回收试剂盒、PCR 纯化回收试剂盒购自 Axygen
公司 ；pMD19-T 购自大连宝生物工程有限公司 ；其
他化学药品均为国药产品。
1.1.4 供试昆虫 棉铃虫（Helicoverpa armigera）由
湖北省农业科学院提供的标准化试虫。
1.2 方法
1.2.1 分子操作方法 Bt 质粒 DNA 提取参照 Narva
等 [7] 的方法进行，Bt 转化方法参见文献 [8]，大肠杆
菌 DNA 的提取、酶切、连接、电泳及转化，苏云金
芽胞杆菌伴胞晶体蛋白的诱导表达及 SDS-PAGE 检
测分析见文献 [9]。蛋白质一级质谱鉴定由中国科技
大学鉴定。
1.2.2 过表达载体的构建 根据苏云金芽胞杆菌
（subsp. kurstaki）97-27[10] 的基因组序列（GenBank 登
录号 ：AE017355）设计引物 CodY-F ：5-ATTGGATCC
ATGGAATTATTAGCAAAAAC-3 和 CodY-R ：5-CCG
CTCGAGAACACGCTTATGACACTT-3（下划线为限
制性内切酶 BamH Ⅰ和 Xho Ⅰ的识别位点），以苏云
金芽胞杆菌 YBT-881[11] 总 DNA 为模板进行 PCR 扩
增。PCR 反应体系：10×Buffer （Mg2+ 5.0 μL），F-primer
2.0 μL，R-primer 2.0 μL，dNTPs 2.0 μL， 模 板 DNA
1 μL，Taq 酶 0.5 μL，ddH2O 补至 50 μL。扩增程序：
95℃变性 5 min ；94℃ 40 s，退火 50℃ 1 min，72℃
1 min，30 个循环 ；最后 72℃延伸 10 min。将扩增
得到的 cody 基因（Gene ID：2854770）780 bp 的片段，
用 BamH Ⅰ和 Xho Ⅰ双酶切消化，然后将扩增得到
的 cody 基因片段克隆到同样用 BamH Ⅰ和 Xho Ⅰ双
酶切消化的穿梭载体 pHT1K-Plip-TS 上，其中 Plip
是芽胞杆菌属中的强启动子，TS 是终止序列，它可
以使特定基因从营养期就开始过量表达，然后用 T4
连接酶 16℃过夜连接并转化大肠杆菌 E.coli（DH5α）
后利用氨苄抗性（100 mg/mL）平板筛选阳性克隆子，
经过酶切验证后得到过表达 CodY 重组载体 pHT1K-
PlipcodyTS。
1.2.3 Cry2Ac 基因保守片段的克隆 以 YBT-881 和
YBT-881-L1 总 DNA 为模板，设计引物 Rcry2ac-F ：
5-CATTGCATTTTGCGAGGAT-3 和 Rcry2ac-R ：
5-AACGGTGTTTGTAAAGGATTGA-3，对这两株菌
是否含有 Cry2Ac 基因进行验证。PCR 反应体系 ：
10×Buffer（Mg2+ 2.5 μL），F-primer 0.5 μL，R-primer 0.5
μL，dNTPs 1.5 μL，模板 DNA 0.5 μL，高保真 Taq 酶 0.3
μL，ddH2O 补至 25 μL。扩增程序如下 ：95℃变性
5 min ；94℃ 40 s，62℃退火 2 min，72℃ 1 min，30
表 1 菌株与质粒
菌株与质粒 特征 来源
YBT-881 苏云金芽胞杆菌库斯塔克亚种（subsp. kurstaki）野生菌 本实验室
YBT-881-L1 过表达 CodY 蛋白的苏云金芽胞杆菌 YBT-881 重组菌株 本研究
DH5α supE44ΔlacU169（φ80LacZΔM15）Hsd R17 recA1 end A1 gyr A96 thi-1 relA1 本实验室
pMD18-T Ampr From TaKaRa
pHT1K-PlipTs 苏云金芽胞杆菌穿梭载体 本实验室
PHT1K-PlipcodyTS 苏云金芽胞杆菌穿梭载体 本研究
2011年第12期 183
个循环 ；最后 72℃延伸 10 min。随后得到的 PCR
产物经试剂盒纯化回收后，连接产物转化大肠杆菌
E.coli（DH5α）。最后对阳性转化子进行酶切验证而
获得过表达 CodY 的重组载体 pHT1K-PlipcodyTS。
1.2.4 序列测定及分析 挑选阳性重组子送华大
基 因 公 司 测 序， 采 用 分 子 生 物 学 软 件 BLAST 和
DNASTAR 进行序列分析。
1.2.5 晶体蛋白对棉铃虫杀虫活性的生物测定 采
集虫卵，喷洒无菌水于无菌室中孵化出幼虫，即可
作为生物测定用。按照养虫饲料配方 [12]，将黄豆粉
和酵母粉加入到一半水中充分搅拌，为组份 1。将
琼脂煮沸溶解入另一半水中，为组份 2。将组份 1
加入组份 2，充分混匀。等温度降至 75℃左右时，
加入维生素 C、苯甲酸钠、苯甲酸和 36% 乙酸，搅
拌均匀后，放入 60℃的水浴中保温备用。将 Cry 蛋
白进行 10 倍稀释至 10-5 备用。取 50 mL 的小烧杯，
写好标签，分别向每个小烧杯中加入 3 mL 对应浓度
的感染液，以无菌水作为空白对照。将其放入 60℃
水浴中预热。向每个装有感染液的小烧杯中加入
27 mL 饲料，用玻棒充分搅拌，使每个烧杯中的感
染液与饲料充分混匀，迅速将每个不同浓度的感染
饲料倒入 2 个 24 孔生测板中，冷却凝固，写好标签。
随机挑取棉铃虫初孵幼虫，盖上铺有吹塑纸垫板的
盖子，在 28℃，RH=70%，L D=14 h 10 h 的条件下，
每孔接 1 头，感染 3 d 后检查结果，用镊子触动无
反应者为死虫，记录试验结果。
2 结果
2.1 过表达CodY蛋白的载体构建及鉴定
原始穿梭载体 pHT1K-Plip-TS 大小为 5 065 bp，
cody 基 因 片 段 为 780 bp， 正 确 的 重 组 质 粒 大 小
应 为 5 845 bp。 利 用 限 制 性 内 切 酶 BamH Ⅰ 和
Xho Ⅰ双酶切验证重组质粒，然后用 1% 的琼脂糖
电泳检测，结果（图 1）显示已将目的片段切下，
表明成功构建了含有目的片段的重组载体 pHT1K-
PlipcodyTS。
2.2 苏云金芽胞杆菌YBT-881及YBT-881-L1的质粒
验证
提取原始菌株 YBT-881 和重组菌株 YBT-881-L1
的质粒并用 1% 的琼脂糖凝胶进行电泳分离。如图
2-A 所示，两菌株的质粒条带基本相同，而 YBT-
881-L1 多出了 1 个条带。进一步用 BamH 和 EcoR
进行单酶切验证，从图 2-B 可以看出，经过 BamH
和 EcoR 单酶切后，重组菌株 YBT-881-L1 的质粒
图 谱 中 多 出 了 一 条 6 kb 左 右 的 条 带， 与 pHT1K-
PlipcodyTS 的 大 小 一 致。 以 上 结 果 表 明， 过 表 达
CodY 重组菌株构建成功。
2.3 苏云金芽胞杆菌YBT-881及YBT-881-L1晶体蛋
白SDS-PAGE分析
提取两株菌株的晶体蛋白进行 SDS-PAGE 检测，
从图 3 可以看出，与原始菌株 YBT-881 相比，重组
菌株 YBT-881-L1 表达的 65 kD 左右的晶体蛋白明显
比 YBT-881 多。 随 后 将 YBT-881 和 YBT-881-L1 经
过 SDS-PAGE 分 离 的 130 kD 和 65 kD 左 右 的 条 带
进行一级质谱鉴定，结果（表 2）表明，YBT-881
和 YBT-881-L1 的 130 kD 左右的条带均为 Cry1F 和
Cry1G（ 相 似 率 为 99% 以 上 ）；而 YBT-881-L1 的
65 kD 晶体蛋白是 Cry2Ac（与 Cry2Ac 蛋白家族中
Cry2Ac4 相似率为 99%）。
2.4 苏云金芽胞杆菌YBT-881及YBT-881-L1中
Cry2Ac基因的验证
以 YBT-881-L1 与 YBT-881 总 DNA 为 模 板 分
别 扩 增 Cry2Ac 基 因 保 守 序 列（ 图 4）， 可 见 两 株
菌均扩出目的条带，然后将纯化的 PCR 产物连接
到 pMD19-T 载体上测序（图 5）可知，两株菌株中
Cry2Ac 基因同源性为 99% 以上。
黄凯等 ：过表达 CodY 蛋白的苏云金芽胞杆菌基因工程菌 YBT-881-L1 的构建及特性鉴定
M.1 kb Marker ；1.pHT1K-Plip-TS 质粒 BamH 单酶切验证 ；2.pHT1K-
PlipcodyTS 质粒 BamH 和 Xho 双酶切验证 ；3.pHT1K-PlipcodyTS 质粒
BamH 单酶切验证
图 1 过表达载体验证图谱
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011年第12期184
蛋白质类型 Mscot 分值 分子量（kD） NCBI 登录号
YBT-881-L1 65 kD insecticidal crystal protein Cry2Ac8 [Bacillus thuringiensis] 390.43 69.6714 219940342
insecticidal crystal protein Cry2Ac9 [Bacillus thuringiensis] 388.43 69.7044 219940344
Cry2Ac [Bacillus thuringiensis] 388.43 69.6704 66734543
crystal delta-endotoxin cry2Ac [Bacillus thuringiensis] 378.43 69.6745 85717890
Cry2Ac12 protein [Bacillus thuringiensis] 378.37 69.6805 219942274
insecticidal crystal protein Cry2Ac [Bacillus thuringiensis serovar wuha] 348.43 69.6704 85700968
YBT-881 130 kD Cry1F [Bacillus thuringiensis] 526.35 133.1400 40271
delta-endotoxin CryIG protoxin [Bacillus thuringiensis] 526.33 129.6465 27436034
AF336114_1 crystal delta-endotoxin [Bacillus thuringiensis] 518.35 133.2681 48880
crystal protein [Bacillus thuringiensis] 516.33 129.0602 295866
AF288683_1 delta-endotoxin Cry1 [Bacillus thuringiensis] 478.32 132.9081 188484664
Cry1F [Bacillus thuringiensis] 458.35 132.1114 6650206
YBT-881-L1 130 kD delta-endotoxin CryIG protoxin [Bacillus thuringiensis] 596.39 129.6465 40271
AF336114_1 crystal delta-endotoxin [Bacillus thuringiensis] 416.38 133.2681 27436034
crystal protein [Bacillus thuringiensis] 406.38 133.2681 295866
Cry1F [Bacillus thuringiensis] 394.38 133.1400 188484666
CryINA67-1 [Bacillus thuringiensis] 388.38 132.2567 2982744
Cry1F [Bacillus thuringiensis] 336.38 132.2035 6650206
表 2 质谱结果
2.5 苏云金芽胞杆菌YBT-881和YBT-881-L1生长曲
线及相差显微镜镜检
为了进一步研究 YBT-881-L1 与 YBT-881 的生
长性状，分别绘制了两株菌株的生长曲线（图 6）。
从图中可以看出两株菌株生长基本一致，均在大约
培养 13 h 时进入稳定期。同时在稳定期取样进行相
差显微镜镜检（图 7-A，B），可见两株菌株芽胞，
伴胞晶体形态无明显变化。
2011年第12期 185
2.6 晶体蛋白的对棉铃虫的毒杀活性
提取苏云金芽胞杆菌晶体蛋白（蛋白原液浓度
为 4.3 mg/mL），以鳞翅目害虫棉铃虫为供试虫种进
行生物测定。结果（表 3）显示，其中 CK 为无毒
饲料对照，将提取的晶体蛋白按照 Cry1 类蛋白相对
定量，使两个样品中含 Cry1 类蛋白量相同，这样重
组菌株 YBT-881-L1 晶体蛋白样品中除了含有 Cry1
类蛋白外，还含有 Cry2 类蛋白。随后将蛋白原液
进行一系列 10 倍梯度稀释至 10-5，生物测定结果 ：
当稀释到 10-1 时，原始 YBT-881 的样品致死率为
70%，过表达重组菌株 YBT-881-L1 的样品致死率为
100% ；稀释到 10-3 时，原始 YBT-881 的样品致死率
M.DL2000 Marker ；1. 过表达菌株 YBT-881-L1 扩增
Cry2Ac 基因 ；2. 原始 YBT-881 扩增 Cry2Ac 基因
图 4 苏云金芽胞杆菌 YBT-881 和 YBT-881-L1 中
Cry2Ac 基因的验证
图 5 YBT-881 和 YBT-881-L1 中 Cry2Ac 基因序列同源性比较
为 27.5%，过表达重组菌株 YBT-881-L1 的样品致死
率为 52.57% ；稀释到 10-5 时，原始 YBT-881 的样品
致死率为 10.42%，过表达重组菌株 YBT-881-L1 晶
体蛋白样品致死率为 30.58%。可见重组菌株 YBT-
881-L1 的杀虫活性比原始菌株 YBT-881 明显增强。
图 6 苏云金芽胞杆菌 YBT-881 和 YBT-881-L1 生长曲线
3 讨论
cry2 类基因在 Bt 中分布较广泛，不同的 Cry2
类蛋白有不同的杀虫谱和毒力 [13]，其中 cry2Ab 为沉
默基因，但在国内外都已实现了有效表达，cry2Ac
和 cry2Ad 基 因 在 Bt 中 不 常 见。 研 究 表 明，Cry2A
类蛋白与 Cry1A 蛋白具有不同的结合位点，害虫对
这两种蛋白不易产生交互抗性。Cry2 类蛋白与其他
杀虫蛋白之间还具有增效作用 [14,15]。目前已发现的
cry2Ac 基因较少，对其功能和活性了解不多 [16]。本
试验通过一个穿梭载体 pHT1K-Plip-TS，将 cody 基
因克隆到该载体上，验证后得到过表达 CodY 的重
组载体 pHT1K-PlipcodyTS。并将重组载体电转化进
蛋白浓度
（稀释倍数）
校正死亡率（%）
CK YBT-881 YBT-881-L1
10-1 0 70 100
10-3 0 27.5 52.57
10-5 0 10.42 30.58
表 3 苏云金芽胞杆菌 YBT-881 和 YBT-881-L1 晶体
蛋白对棉铃虫的毒杀活性
黄凯等 ：过表达 CodY 蛋白的苏云金芽胞杆菌基因工程菌 YBT-881-L1 的构建及特性鉴定
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011年第12期186
苏云金芽胞杆菌 YBT-881 中，经验证后得到重组菌
株 YBT-881-L1。随后通过特性鉴定，发现野生株中
沉默的 cry2Ac 基因在工程菌中被激活，序列比对后
证实该 cry2Ac 基因与 cry2Ac4 相似率为 99% 以上，
这样工程菌种同时含有 Cry2A 类与 Cry1 类两种晶体
蛋白。然后以鳞翅目害虫棉铃虫为供试虫种进行生
物测定，发现重组菌株的晶体蛋白对棉铃虫的生物
杀虫活性明显增强。这为以后选育优良高杀虫毒力
的菌种提供重要理论指导，并且对其他病源微生物
毒力蛋白的研究提供理论基础。
全局性转录调控因子 CodY 在低 G+C 含量的芽
胞杆菌属中普遍存在，并且起着至关重要的作用。
它能够调控一些与鞭毛形成，毒力因子，芽胞形成
等有关的基因，从而使菌体能够更好地适应恶劣的
环境 [17,18]。至今，对于该蛋白已经开展大量的研究，
但是在研究中也遇到了一些令人费解的问题，比如，
在一些菌体中将该基因敲除后发现菌体的致病性降
低而在另一些菌体中又表现上调。例如，在难辨梭
状芽胞杆菌中 CodY 阻遏毒力基因的表达，然而在
炭疽芽胞杆菌中该蛋白激活毒力基因的表达 [19]。另
外在研究 Bs 中 CodY 的活性时，发现其活性依赖于
两个效应分子，即 GTP 和支链氨基酸（BCAA）[20]。
它们可以增强 CodY 与靶位点的体外结合能力，二
者可单独或者协同作用 [21]。
目前基本没有人关注 CodY 在 Bt 中的功能，但
是通过本实验室研究表明，CodY 在苏云金芽胞杆
菌中是具有重要的调控作用的。例如，在研究聚 -β-
羟基丁酸酯（PHB）时，通过构建 PHB 形成过程中
关键基因 pha 的缺失突变体，发现该突变体的芽胞
和晶体产生量很少，随后进行双向电泳检测分析其
在蛋白质组方面的差异时，发现 CodY 在对数期较
原始菌株的表达量显著提高，然而在稳定期时其表
达量明显下降。这些结果让人们想到在苏云金芽胞
杆菌中 CodY 可能对伴胞晶体、芽胞以及 PHB 的形
成起着重要的调控作用。本试验是在研究 CodY 蛋
白在 Bt 中的作用机制时，发现过表达该蛋白后工程
菌中沉默的 Cry2Ac 蛋白刺激表达，分析后推测原因
可能是 CodY 蛋白与 cry2Ac 本身的启动子有直接关
系，因为 CodY 蛋白是一种转录调控因子，本身可
以与 DNA 相结合并刺激或者阻遏基因的表达。另外
也可能对 Cry2Ac 蛋白的形成起间接调控作用。这些
相关研究本实验室正在开展，最终通过进一步的研
究希望弄清楚 CodY 蛋白在 Bt 中的代谢调控机制。
4 结论
本研究通过构建过表达 CodY 重组载体 pHT1K-
PlipcodyTS，最终得到重组菌株 YBT-881-L1。通过对
重组菌株特性鉴定，发现野生菌株中沉默的 cry2Ac
基因在工程菌中被激活，并在菌体中积累大量的
Cry2AC 晶体蛋白。这样工程菌种同时含有 Cry2A 类
与 Cry1 类两种晶体蛋白。然后以鳞翅目害虫棉铃虫
为供试虫种进行生物测定，发现重组菌株的晶体蛋
白对棉铃虫的生物杀虫活性明显增强。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）
黄凯等 ：过表达 CodY 蛋白的苏云金芽胞杆菌基因工程菌 YBT-881-L1 的构建及特性鉴定